Dosagem de proteínas usando método de Bradford

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Curso Técnico em Biotecnologia 
Processos Bioquímicos 
 
 
 
 
Dosagem de Proteína usando o método de Bradford 
 
 
NOTA: 9,9 
 
 
Gabriele Mentz 
Nathalia Gonçalves 
Pâmela Stradolini 
 
 
 
 
 
 
Profº. Dra. Alessandra Nejar Bruno e Dr. Leonardo da Silva Bittencourt 
 
 
Porto Alegre, 04 de Outubro de 2019 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
1.1 PROTEÍNAS 
Proteínas são polímeros de aminoácidos responsáveis por controlar 
praticamente todos os processos que ocorrem dentro de uma célula. As proteínas de 
cada organismo, da mais simples das bactérias aos seres humanos, são construídas a 
partir do mesmo conjunto onipresente de 20 aminoácidos (Nelson e Cox, 2019). 
As proteínas têm muitos papéis importantes no corpo; diferentes da gordura e 
do glicogênio, elas não são apenas uma reserva de substratos energéticos. A proteína 
muscular é essencial para o movimento corporal. Outras proteínas funcionam como 
enzimas (catalisadores de reações bioquímicas) ou como componentes estruturais de 
células e tecidos (Nelson e Cox, 2019). 
Os 20 aminoácidos comumente encontrados nas proteínas estão unidos entre si 
por ligações peptídicas. A sequência linear dos aminoácidos ligados contém a 
informação necessária para formar uma molécula proteica com estrutura tridimensional 
única (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
A estrutura de grandes moléculas, tais como proteínas, pode ser descrita em 
vários níveis de complexidade, arranjada em um tipo de hierarquia conceitual. Quatro 
níveis de estrutura proteica são comumente definidos (Nelson e Cox, 2019). 
 
 
Figura 1 - Níveis estruturais de proteína - Princípios de Bioquímica de Lehninger; Nelson e Cox 2019. 
1.1.1 Estrutura Primária 
 
A sequência de aminoácidos em uma proteína é denominada estrutura primária 
da proteína. A sequência linear dos aminoácidos ligados contém a informação 
necessária para formar uma molécula proteica com estrutura tridimensional única 
(Harvey e Ferrier, 2012). 
 
 
Figura 2- Estrutura Primária de proteína – Bioquímica ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012 
1.1.1.1 Ligação Peptídica 
Nas proteínas, os aminoácidos são unidos covalentemente por ligações 
peptídicas, as quais são ligações amida entre o grupo a-carboxila de um aminoácido e 
o grupo a-amino de outro. As ligações peptídicas não são rompidas por condições 
desnaturantes, como aquecimento ou altas concentrações de ureia. Deve haver uma 
exposição prolongada a um ácido ou a uma base forte em temperaturas elevadas para 
hidrolisar essas ligações de forma não enzimática (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
• Características das ligações peptídicas: A ligação peptídica tem um caráter 
de dupla-ligação parcial, ou seja, é mais curta do que uma ligação simples, além 
de rígida e planar. 
 
 
Figura 3 - Características das ligações peptídicas - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
A ligação peptídica geralmente é uma ligação trans, em grande parte devido à 
interferência estérica dos grupos R quando em posição cis (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
 
1.1.2 Estrutura Secundária 
Estrutura secundária se refere a qualquer segmento de uma cadeia polipeptídica 
e descreve o arranjo espacial de seus átomos na cadeia principal, sem considerar a 
posição de suas cadeias laterais ou sua relação com outros segmentos (Nelson e Cox, 
2019). 
 
O esqueleto polipeptídico não assume uma estrutura tridimensional aleatória, mas, em 
vez disso, geralmente forma arranjos regulares de aminoácidos que estão localizados 
próximos uns aos outros na sequência linear (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
 
Figura 4 - Estrutura de proteína Secundária - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
 
1.1.2.1 α Hélice 
Apresenta estrutura helicoidal, que consiste em um esqueleto polipeptídico 
central espiralado e bem compacto, com as cadeias laterais dos aminoácidos que a 
compõem estendendo-se para fora do eixo central, de modo a evitar a interferência 
estérica entre si (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
1.1.2.3 Folha β 
Outra forma de estrutura secundária, na qual todos os componentes da ligação 
peptídica estão envolvidos com ligações de hidrogênio. As superfícies das folhas β 
apresentam uma aparência "pregueada" e, portanto, essas estruturas são 
frequentemente denominadas ''folhas β pregueadas". Ao contrário da α hélice, as folhas 
β são compostas de duas ou mais cadeias peptídicas ou segmentos de cadeias 
polipeptídicas, que se apresentam quase totalmente estendidos. Nas folhas β as 
ligações de hidrogênio são perpendiculares ao esqueleto polipeptídico (Harvey e Ferrier, 
2012). 
 
1.1.2 Estrutura Terciária e Quaternária 
A estrutura primária de uma cadeia polipeptídica determina sua estrutura 
terciária (Harvey e Ferrier, 2012). O arranjo tridimensional total de todos os átomos de 
uma proteína é chamado de estrutura terciária. Enquanto o termo “estrutura secundária” 
se refere ao arranjo espacial dos resíduos de aminoácidos adjacentes em um segmento 
polipeptídico, a estrutura terciária inclui aspectos de alcance mais longo da sequência 
de aminoácidos (Nelson e Cox, 2019). 
 
Figura 5 - Estrutura de Proteína terciária - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
Algumas proteínas contêm duas ou mais cadeias polipeptídicas distintas, ou 
subunidades, que podem ser idênticas ou diferentes. O arranjo destas subunidades 
proteicas em complexos tridimensionais constitui a estrutura quaternária. 
 
 
Figura 6 - Estrutura de Proteína Quaternária - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
1.2 Espectrofotometria 
A espectrofotometria é uma técnica analítica que permite determinar a 
concentração das soluções por meio da intensidade de luz absorvida ou transmitida por 
elas. Com soluções coloridas, em que a intensidade de cor produzida na solução é 
proporcional à concentração da substância que está sendo dosada, conseguimos 
quantificar a concentração de uma dada substância em uma solução. Isso ocorre devido 
às diversas biomoléculas absorverem luz em comprimentos de onda () característicos. 
A luz branca é um espectro contínuo dos comprimentos de onda de todas as cores. Se 
a luz branca atravessar uma solução contendo um composto corado, certos 
comprimentos de onda de luz são absorvidos seletivamente (BRUNO et al., 2014). 
Em 1852, Johann Lambert estudou transmissão de luz por sólidos homogêneos, 
enquanto August Beer estendeu os estudos para a análise das soluções, resultando na 
Lei de Lambert-Beer que determina que: “Quando uma faixa de luz monocromática 
atravessa uma solução colorida, a quantidade de luz absorvida é diretamente 
proporcional à concentração da solução colorida e à espessura da camada atravessada” 
(NELSON; COX, 2011). 
O espectrofotômetro é um equipamento que compara quantitativamente a fração 
de luz que passa através de uma solução de referência e de uma solução de teste. De 
modo geral, um espectrofotômetro possui uma fonte estável de energia radiante 
(normalmente uma lâmpada incandescente), um seletor de faixa espectral 
(monocromatizadores, como os prismas, que selecionam o comprimento de onda da luz 
que passa através da solução de teste), um recipiente para inserir a amostra a ser 
analisada (a amostra deve estar em recipientes apropriados conhecidos como cubetas) 
e um detector de radiação, que permite uma medida relativa da intensidade da luz. O 
espectrofotômetro informa quanta luz foi transmitida (T) ou quanta luz foi absorvida (A). 
Desta forma podemos afirmar que: 
Absorbância (A): é a quantidade de luz que uma solução absorve. Apresenta a 
vantagem de variar de forma linear com a concentração da amostra. 
Transmitância (T): é quantidade de luz que uma solução deixa passar, ou seja, 
não absorve. É expressa em porcentagem de luz transmitida.Assim, quando T=100%, 
não há absorção de fótons. 
A determinação da concentração de um soluto em uma determinada solução por 
espectrofotometria envolve também a comparação da absorbância da solução comum 
com uma solução de referência, na qual já se conhece a concentração do soluto. De 
modo geral, essa solução de referência é chamada de solução-padrão. Pode-se então 
diluir a solução-padrão para obter diferentes concentração (pontos), determinar as suas 
respectivas absorbâncias e traçar um gráfico, cujo perfil é conhecido como curva-
padrão. No gráfico da curva-padrão, o eixo Y (vertical) indica a absorbância da amostra, 
enquanto no eixo X (horizontal) indica a concentração em mg/mL da amostra (BRUNO 
et al., 2014). 
Em cada ponto obtido na curva-padrão, obtemos o fator de calibração (FC) de 
cada ponto da curva. Realizando a média dos fatores de calibração parcial, obtemos o 
fator de calibração médio (FCM) e, com ele, calculamos as concentrações 
desconhecidas em uma solução por meio da seguinte fórmula: 
Q ou C (concentração) = A (absorbância da amostra) X FCM 
1.2 .1 Método de Bradford 
O método de Bradford (1976) é uma técnica para a determinação de proteínas 
totais baseada na interação entre o corante que utiliza o reagente de “Coomassie 
brilliant blue”, e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias 
laterais básicas ou aromáticas. A interação entre a proteína de alto peso molecular e o 
corante provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que 
absorve fortemente em 595 nm. O método de Bradford é mais rápido e sensível que o 
de Lowry, apresentando linearidade para BSA de 0,2 – 1 mg/ml. A técnica tem sido 
utilizada para a determinação de proteínas totais em diversos meios: plasma ou soro 
sangüíneo, líqüor, saliva humana, produtos alimentícios, leite humano, tecidos de 
plantas, suspensões de células e urina (BRUNO et al., 2014). 
2. OBJETIVO 
 
- Utilizar um método espectrofotométrico de quantificação de proteínas. 
- Determinar a concentração de proteína em uma amostra biológica através do método 
de Bradford. 
 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.1 Materiais 
 
• 1 estante para tubos de ensaio 
• 14 tubos de ensaio grandes 
• 350 uL de Albumina 1 mg/mL (previamente preparada) 
• 35 mL de Coomassie Blue 
• Micropipeta de 10-200uL 
• Ponteiras pequenas para água, albumina e amostra 
• 01 Pipeta de vidro de 5mL para o Comassie Blue 
• Espectofotômetro 
 
3.2 Métodos 
 
Em tubos de ensaio foram adicionados em duplicata quantidades de Coomassie 
Blue, água e Albumina Bovina Padrão (BSA) em diferentes concentrações conforme a 
tabela abaixo: 
Concentração 
(mg/mL) 
Água (uL) 
Albumina 1 mg/mL 
(uL) 
Coomassie Blue 
(uL) 
Branco 50 0 2500 
0,2 40 10 2500 
0,4 30 20 2500 
0,6 20 30 2500 
0,8 10 40 2500 
1 0 50 2500 
Tabela 1 - Curva Padrão (Bradford, 1996). 
Após a curva padrão foi feita a quantificação de proteínas, onde foi pipetado em 
um tubo de ensaio 30 uL de água, 20 uL da amostra e 2500 uL de Coomassie Blue, 
conforme a tabela abaixo: 
Tubo Água (uL) Amostra (uL) Coomassie Blue (uL) 
1 30 20 2500 
Tabela 2 - Quantificação de Proteínas. 
No espectrofotômetro previamente ligado e calibrado no comprimento de onda 
desejado (595nm) foi medido a absorbância de cada solução. 
 
 
4. RESULTADOS 
 
Curva-padrão da proteína BSA (Albumina Bovina Padrão) lida em 595 nm 
Tubos Absorbância 1 Absorbância 2 Média FC 
Tubo 1 0,086 0,076 0,081 2,47 
Tubo 2 0,177 0,577 0,377 1,06 
Tubo 3 0,257 0,455 0,356 1,68 
Tubo 4 0,912 0,292 0,602 1,32 
Tubo 5 0,702 0,332 0,517 1,93 
Tabela 3 - Resultados de absorbância lidos em espectrofotômetro para quantificação de proteínas pelo 
método de Bradford. 
Cálculos: 
Tubo 1 
FCP = abs 1 + abs 2 / 2 
FCP = 0,086 + 0,076 / 2 = 0,081 
 
FC 1 = C / abs 
FC 1 = 0,2 / 0,081 = 2,47 
 
Tubo 2 
FCP = abs 1 + abs 2 / 2 
FCP = 0,177 + 0,577 / 2 = 0,377 
 
FC 1 = C / abs 
FC2 = 0,4 / 0,377 = 1,06 
 
Tubo 3 
FCP = abs 1 + abs 2 / 2 
FCP = 0,257 + 0,455 / 2 = 0,356 
 
FC 1 = C / abs 
FC3 = 0,6 / 0,356 = 1,68 
 
Tubo 4 
FCP = abs 1 + abs 2 / 2 
FCP = 0,912 = 0,912 
 
FC 1 = C / abs 
FC4 = 0,8 / 0,912 = 0,877 
 
 
 
 
 
 
Tubo 5 
FCP = abs 1 + abs 2 / 2 
FCP = 0,702 = 0,702 
 
FC 1 = C / abs 
FC5= 1,0 / 0,702 = 1,42 
 
 
FCM = soma dos FC’s / 5 = 2,47 + 1,06 + 1,68 + 0,877 + 1,42 / 5 = 1,50 
 
 
Quantificação da proteína BSA (Albumina Bovina Padrão) 
Tubo Água (uL) Amostra (uL) Coomassie Blue (uL) Absorbância Concentração (C) 
1 30 20 2500 0,549 41,2 mg/mL 
Tabela 4 - Concentração em mg/mL obtida a partir da absorbância lida no espectrofotômetro. 
 
Cálculo: 
Concentração multiplicada por 50 para correção do valor devido a diluição de 50x da 
amostra 
 
C = FCM x abs x 50 
C = 1,50 x 0, 549 x 50 = 41,2 mg/mL 
 
 
Gráfico 1 - Curva padrão usando Albumina Bovina Padrão (BSA 1 mg/mL) versus absorbância lida em 
595 nm. 
Eixo Y: absorbância 
Eixo X: concentração (Q) em mg/mL da proteína BSA 
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
 
 
5. CONCLUSÃO E DISCUSSOES 
 
Na técnica de quantificação de uma amostra de proteína pelo método de 
Bradford, as proteínas que contem aminoácidos de cadeias laterais básicas ou 
aromáticas interagem com o reagente coomassie blue. Nessa interação o corante 
provoca deslocamento do equilíbrio da proteína à forma não iônica, absorvido pela luz 
do espectrofotômetro no comprimento de 595nm. 
Para cada amostra usamos duplicatas, e o valor de cada amostra se 
assemelham, em muito, a sua respectiva duplicata e na realização de experimento da 
amostra de leite foi diluída previamente em 50 vezes. Preparamos os tubos de ensaio 
com as amostras com diferentes concentrações todos em duplicatas exceto o branco, 
aguardam os 5 minutos, e pipetamos a proteína nos tubos. Obtivemos os valores, para 
montar o gráfico da curva padrão, por meio do espectrofotômetro. 
Podemos ver uma pequena variação de medição no espectrofotômetro dos tubos 
4 e 5 da tabela 3, os valores de absorbância 0,292 e 0,332, respectivamente, ficaram 
fora do padrão de calibração, ou seja, estavam fora dos 20% aceitos, portanto foram 
cortados do FCM para um melhor resultado final da curva-padrão. 
 O método de Bradford como uma técnica rápida é eficiente e detecta entre 20 a 
2000 µ g/mL, mas seu reagente exige altas concentrações de proteínas podem variar a 
quantificação assim atribuindo uma menor precisão, sendo uma vantagem do método 
calcular proteína de alta massa molecular, já que o reagente não se liga a baixas 
concentrações. Os resultados obtidos na pratica de laboratório fez com que tivéssemos 
uma visão e um entendimento bem mais claro sobre o Método de Bradford possibilitando 
um melhor aprendizado.
Comentado [A1]: Aqui poderiam ser incluídas outras 
caraterísticas da técnica, tais como linearidade, 
sensibilidade, interferentes, estabilidade, custo, limite de 
detecção..... 
 
Comentado [A2]: Aqui na discussão poderia conter: 
- Qual a proteína dosada na amostra utilizada? 
 
 - Se a concentração de proteína encontrada condiz com a 
concentração correta? 
Pela curva o valor deveria ser de quanto? 
 
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
BRUNO, Alessandra Nejar et al (Org.). Biotecnologia I: Princípios e Métodos. Porto 
Alegre: Artmed, 2014. p 101 - 102. 
NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 5. ed. Porto 
Alegre: Artmed, 2011 
Nelson, L.. Cox, M; Princípios de Bioquímica de Lehninger - 6. ed. – Porto Alegre : 
Artmed, 2014.NELSON, David L.; COX, Michael M.; Princípios de Bioquímica de Lehninger - 7. Ed. 
Porto Alegre : Artmed, 2019. 
Harvey, A., Ferrier, D; Bioquímica ilustrada - 5. ed. - Porto Alegre : Artmed, 2012. 
Volhardt, K. et al; Química Orgânica – Estrutura e Função 6ª edição; 6ª edição, 2013. 
ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via 
espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química 
Nova, v. 21, n. 6, p. 787-793, 1998