Relatório-1-UV-Vis

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Determinação espectrofotométrica da concentração de ferro em medicamentos. 
RESUMO
A não absorção da quantidade diária de ferro recomendada é um grande problema para muitas pessoas, visto que o ferro é um nutriente essencial para o organismo. Dentre as suas funções podemos destacar o transporte de oxigênio pela hemoglobina. Indivíduos com disfunção na absorção do ferro necessitam de uma correta suplementação do mineral. Com o objetivo de comparar a concentração de ferro indicada nos suplementos Hematofer e Vitafer® utilizou-se da espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis para determinar a concentração de ferro dos comprimidos em comprimento de onda de 505 nm indicado pelo espectro de absorção. Foi utilizado na prática um espectrofotômetro UV-Vis FEMTO 800 XI com cubeta de caminho óptico 1 cm. Na oportunidade, verificou-se que ambos os medicamentos estão estatisticamente de acordo com os valores indicados na bula, indicando que o método de determinação de ferro por espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis é efetivo.
Palavras chave: Ferro. Concentração. Espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis.
INTRODUÇÃO
Desde os primórdios da humanidade existem evidências da utilização do ferro. Este é o quarto elemento mais abundante encontrado na crosta terrestre, porém não é encontrado na natureza em sua forma isolada mas sim em forma de minerais. Dentre estes, destaca-se a hematita (Fe2O3) e a magnetita (Fe3O4) (SIQUEIRA et al., 2004).
A presença de ferro no organismo é de suma importância visto que é o responsável pelo transporte de oxigênio pela hemoglobina, formação de mioglobina, responsável pelo transporte de oxigênio para os músculos, formação de citocromos, substâncias aceptoras de elétrons que participam da cadeia respiratória no processo de respiração celular, entre outras funções. A deficiência de ferro no organismo pode causar sérios problemas, como a fadiga muscular, anemia e estomatite (MARTINS et al., 2006).
Nos seres vivos a absorção de ferro dá-se principalmente por alimentos e pela água. Em condições normais, um indivíduo possui entre 3,5 g e 5,0 g no organismo. Os níveis recomendados de ingestão variam de 10,0 mg para homens e 18,0 mg mulheres para que haja a absorção de cerca de 2,0 mg, quantidade normal para que este seja continuamente reciclado pelo organismo (MARTINS, 2002). A suplementação de ferro é indicada para combater disfunções em indivíduos que não conseguem absorver a quantidade necessária para normal funcionamento do sistema. 
Para determinação do ferro pode-se utilizar a espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis, um dos métodos mais utilizados para determinações analíticas em várias áreas. Este método compreende o envolvimento de um ligante ou complexante para o ferro, para formação de um complexo capaz de absorver a radiação emitida pelo espectrofotômetro (SKOOG et al, 2002).
Espectrofotômetros são instrumentos que possuem a capacidade de registrar dados de absorbância ou transmitância em função do comprimento de onda. Em geral são compostos por cinco componentes principais: fonte, monocromador, recipiente para a solução, detectores e indicadores de sinal (VINADÉ, 2005).
A espectrofotometria é baseada nas medidas de Transmitância, T = P/P0, ou Absorção, A = -log(P/P0). P0 é a radiação que incide na amostra e P é a radiação que é transmitida pela amostra contida no recipiente com caminho óptico definido (NEPOMUCENO e RUGGIERO, 2004)
A lei de Lambert-Beer relaciona a quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma solução com a concentração de uma solução, esta pode ser expressa pela Equação 1:
Equação 1
Onde:
: Transmitância
: absortividade específica; 
: Caminho óptico
: Concentração da solução
O objetivo deste trabalho é comparar as concentrações de ferro informadas pelos fabricantes dos suplementos ferrosos Hematofer e Vitafer® com as concentrações calculadas a partir dos dados espectrofotométricos.
METODOLOGIA
REAGENTES
	Todos os reagentes utilizados na prática foram previamente preparados e disponibilizados pelo laboratorista responsável. Os reagentes utilizados foram: água destilada, solução de hidroxilamina (1% m/v), solução 1,10-fenantrolina (0,1%m/v), solução tampão acetato e solução de ferro II (100 mg L-1).
EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
Foram utilizadas pipetas graduadas para fazer a medição e transferência dos reagentes para o preparo de soluções. Foram utilizados balões de 10 mL, 50 mL e 100 mL. Os balões de 50 mL foram utilizados apenas pela equipe da primeira determinação do comprimido Hematofer, pois a pesagem de analito ficou um pouco acima do estipulado e para não ficar fora da curva de calibração foi necessário maior diluição.
Todas as soluções preparadas foram analisadas em espectrofotômetro UV-Vis 800 XI com cubeta de caminho óptico de 1 cm.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Determinação do máx
Pipetou-se uma alíquota de 0,5 mL da solução estoque ferro II (100 mg L-1) em um tubo e adicionados 0,5 mL de hidroxilamina (1% m/v). Agitou-se e após 1 minuto foi adicionado 1 mL de solução tampão acetato. Fez-se a adição então de 0,5 mL de 1,10-fenantrolina (0,1% m/v) e completou-se o volume para 10mL, agitou-se, após 20 minutos foram realizadas as leituras.
	No espectrofotômetro escolheu-se o modo varredura e um comprimento de onda indo de 400 a 700 nm e com agua destilada na cubeta realizou-se a linha base. Após a realização da linha base pegou-se a solução de ferro preparada e realizou-se a varredura. Assim a partir desse espectro foi possível a escolha do comprimento máximo de onda.
Curva de calibração
A partir da solução estoque ferro II (100 mg L-1) foram feitas novas soluções, conforme a Tabela 1, em balões volumétricos de 10 mL, completando com água destilada.
Tabela 1 - Soluções para a montagem da curva de calibração
	Balão 10 mL
	Solução estoque de Ferro II (mL)
	Cloreto de Hidroxilamônio
(mL)
	Acetato de amônio
(mL)
	1,10 Fenantrolina
 (mL)
	Concentração final de Ferro (mg L-1)
	Branco
	0
	0,5
	1,0
	0,5
	0
	1
	0,5
	0,5
	1,0
	0,5
	0,5
	2
	1,0
	0,5
	1,0
	0,5
	1,0
	3
	1,5
	0,5
	1,0
	0,5
	1,5
	4
	2,0
	0,5
	1,0
	0,5
	2,0
	5
	2,5
	0,5
	1,0
	0,5
	2,5
	6
	3,0
	0,5
	1,0
	0,5
	3,0
O preparo das soluções seguiu os mesmos modos de preparo da solução para determinação do comprimento máximo (agitações e tempos de espera em torno de cada reagente adicionado), mudando apenas a quantidade da solução estoque de ferro em cada um dos balões.
No espectrofotômetro selecionou-se o modo fotométrico e o comprimento de onda adequado. Com água destilada realizou-se a linha base, e após a realização da base, foi realizada a leitura de cada um dos balões para a construção da curva de calibração.
Análise das amostras
	Pesou-se três comprimidos de ambos medicamentos a serem analisados, e anotado as respectivas médias. Posteriormente, um comprimido de Vitafer® e dois comprimidos de Hematofer referente à primeira e segunda determinações foram macerados o máximo possível. Após isso uma massa de 12,0, 31,2 e 24,6 mg respectivamente dos comprimidos macerados foram pesado em balão volumétrico e adicionou-se 1 mL de ácido clorídrico 10% e colocado em banho ultrassom por 1 minuto. Após o banho avolumou-se o balão para 100 mL. Uma alíquota de 0,5 mL foi retirado desta amostra e transferida para um balão de 10 mL para Vitafer® e segunda determinação de Hematofer e 50 mL para a primeira determinação de Hematofer. Adicionou-se 0,5 mL de hidroxilamina, agitou-se e repousou por 5 minutos. Em seguida adicionou-se 1 mL de solução tampão e 0,5 mL de 1,10-fenantrolina, completou-se o volume com água destilada. Após um repouso de 20 minutos foram então realizadas as leituras no espectrofotômetro. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
DETERMINAÇÃO DO COMPRIMENTO DE ONDA MÁXIMO
O comprimento de onda máximo, máx, é a faixa em nanômetros na qual ocorre maior absorção de radiação, ou seja, máxima absortividade molar(SOMMER, 1989). Para tanto, o pico máximo de absorção de uma substância é determinado a partir do espectro de absorção.
A Figura 1 apresenta o espectro de absorção de uma solução contendo ferro na concentração de 0,5 mg L-1 submetida ao feixe de luz na região espectral de 400 a 700 nm.
Figura 1 Espectro de absorção do ferro correspondente a concentração de ferro de 0,5 mg L-1.
Em análise à Figura 1, observa-se no espectro de absorção para a solução contendo 0,5 mg L-1 de ferro o comprimento de onda de 505 nm para a máxima absorbância de 0,106. Dessa forma, define-se 505 nm o comprimento de onda adequado para este trabalho.
Além disso, a partir da equação da Lei de Beer, representada pela Equação 2, é possível obter a absortividade molar, característica intrínseca do tipo de solvente empregado, a composição da amostra e da temperatura da solução estudada (SKOOG, 2006). Para uma absorbância () de 0,106, caminho óptico () de 1 cm e concentração () de 0,5 mg L-1, determinou-se a absortividade específica () de 0,212 L mg-1 cm-1
 	 Equação 2
CURVA DE CALIBRAÇÃO
A curva de calibração é imprescindível em uma análise analítica, e é caracterizada como sendo uma relação entre o sinal de resposta do equipamento – absorbância e a concentração de analito na solução segundo uma equação matemática. A linearidade da equação confirma-se por meio do coeficiente de correlação, indicando a validez da análise (SKOOG et al., 2006).
Neste trabalho, a curva de calibração, apresentada na Figura 2, foi obtida a partir da leitura das absorbâncias respectivas às concentrações de 0 a 3,0 mg L-1 de ferro. Para melhor visualização da coloração, apresenta-se a Figura 3 referente as variações da concentração de ferro.
 
Figura 2 Curva de calibração para determinação de ferro em espectrofotômetro de absorção molecular UV-Vis.
Figura 3 Variações da coloração em relação à concentração de ferro em solução.
A partir da curva de calibração, obtém-se um coeficiente de correlação (R2) de 0,99921. De acordo com Skoog et al. (2006), quanto mais próximo este coeficiente está da unidade, melhor o modelo linear corresponde aos dados aplicados. Dessa forma, conclui-se que a Equação 3 é válida na determinação analítica de ferro em amostras de medicamentos. 
 	 Equação 3
Onde:
: concentração de ferro na amostra (mg L-1);
: absorbância lida no equipamento. 
PARÂMETROS DE MÉRITO
Os parâmetros de mérito para as determinações de ferro foram obtidos a partir do cálculo dos limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ), e a precisão das medidas foi avaliada por meio do desvio padrão relativo (RSD, n=3), apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Parâmetros de mérito para determinação de ferro por espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis.
	Parâmetros de mérito
	
	Faixa de calibração (mg L-1)
	0 – 3,0
	Coeficiente de correlação (R2)
	0,99921
	LOD (mg L-1)
	0,0048
	LOQ (mg L-1)
	0,0160
	Desvio padrão relativo (%)
	0,51
Segundo IUPAC (1978), o limite de detecção é dito como sendo a menor concentração de analito que pode ser determinada com uma certa confiança, e depende da magnitude do sinal analítico em relação à flutuação do branco. Para este trabalho, o LOD foi determinado a partir do desvio padrão de dez medidas consecutivas do branco das amostras dividido pelo valor da inclinação da respectiva curva de calibração multiplicado pelo fator de segurança 3, que confere nível de confiança de 99,6% (IUPAC, 1978). Já o limite de quantificação (LOQ) é dito como sendo 3,33 vezes o valor do limite de detecção. 
O desvio padrão relativo (RSD) é uma estimativa da precisão do método estudado, avaliando o conjunto de dados, as respectivas médias e desvio padrão (SKOOG et al., 2006). Dessa forma, a análise aos valores obtidos para o RSD (n=3) afirma que as amostras estudadas apresentaram boa estimativa de precisão.
APLICAÇÃO ANALÍTICA
O objetivo deste trabalho é avaliar a quantidade de ferro presente em suplementação de sulfato ferroso para indivíduos com deficiência de ferro no organismo. Para tanto, foram avaliados dois medicamentos distintos: Vitafer® da indústria farmacêutica Novamed Fabricação de Produtos Farmacêuticos LTDA e Hematofer da indústria farmacêutica Prati, Donaduzzi & Cia LTDA. A Tabela 3 apresenta as informações referentes a massa média dos comprimidos e as quantidades de sulfato ferroso e ferro elementar indicados na bula dos respectivos medicamentos.
Tabela 3. Informações sobre os medicamentos estudados.
	
	Vitafer®
	Hematofer
	Massa média do comprimido (mg)
	310,30
	267,90
	Quantidade de sulfato ferroso indicado (mg)
	109,00
	109,00
	Quantidade de ferro elementar indicado (mg)
	40,07
	40,00
	Excipientes indicados do comprimido
	Croscarmelose sódica
Celulose microcristalina
Estearato de magnésio
Álcool polivinílico + macrogol
Dióxido de titânio
Corante alumínio laca amarelo crepúsculo 6
Óxido de ferro vermelho
	Celulose microcristalina
Crospovidona
Estearato de magnésio
Dióxido de silício coloidal
Copolímero de polivinil álcool-polietilenoglicol + macrogol
Dióxido de titânio
Corante vermelho laca alumínio n° 40
Corante marrom alumínio laca n° 75
talco
A Figura 4 apresenta os resultados das quantificações de ferro em comprimidos dos medicamentos estudados.
Figura 4 Resultados das quantificações de ferro em amostras de medicamentos de suplementação de ferro por espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis.
Em análise à Figura 4, observa-se que estatisticamente ambos os medicamentos estão de acordo com os valores indicados na bula de ambos os medicamentos Vitafer® e Hematofer, indicando que o método é efetivo na determinação de ferro por espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis. No entanto, observa-se que os erros relacionados às determinações de ferro nos comprimidos de Hematofer foram maiores, caracterizados pelo elevado desvio padrão. O elevado erro pode estar associado à heterogeneidade do comprimido. Como exposto na Tabela 2, o comprimido de ferro possui muitos excipientes que podem não ter sido bem homogeneizados ao realizar a maceração. Além disso, não se descarta o erro associado às más práticas do experimentador. Sendo assim, sugere-se realizar a quantificação de ferro novamente atentando-se às boas práticas do laboratório, bem como realizar a pesagem de mais de uma amostra de comprimido. 
4 CONCLUSÕES
O método analítico de determinação de ferro em amostras mostrou-se efetivo e confiável na aplicação da espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis, apresentando coeficiente de correlação de 0,999, LOD de 0,0048 mg L-1 e ótima estimativa de precisão.
Das análises realizadas, foi possível verificar que o suplemento Vitafer® encontrou-se com valor um pouco acima daquele sugerido na bula. O medicamento Hematofer mostrou valores distintos para cada uma das equipes, no entanto estatisticamente os resultados apresentados estão dentro do esperado. No entanto, devido ao alto erro associado às determinações de ferro em comprimidos de Hematofer, já que cada uma das análises foi realizada por grupos diferentes, seria necessário nova análise para identificar qual dos dois resultados seria reproduzido.
REFERÊNCIAS
MARTINS, A.P.C. et al. Cirrose hepática e hemocromatose neonatal secundária associadas à tirosinemia tipo 1: relato de um caso e diagnóstico diferencial com hemocromatose primária hereditária. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina
Laboratorial. v.42, n.2. Rio de Janeiro: abril, 2006.
MARTINS, F.G. Estudo espectrofotométrico de oxidação do sistema ferro (II)/tiocianato e seu aproveitamento analítico. Dissertação de mestrado. Faculdade de filosofia, ciências e letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2002, 108f.
NEPOMUCENO, M.F.; RUGGIERO, A.C. Manual de Bioquímica – roteiros de
análises bioquímicas quantitativas e qualitativas. Ribeirão Preto: Tecmedd,2004.
SIQUEIRA, L. F. S.; NETO, J. J. G.; ROJAS, M. O. A. Determinação de ferro (I) em água do mar pelo sistema Fe (I)/ KSCN via espectrometria do UV-Vis: uma alternativa prática e de baixo custo. Eclética Quím. Vol. 20, No. 2, 2002.
SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A.; trad. CARACELLI, I. et al. Princípios de análise instrumental. 5 ed. Porto Alegre: Bookman, 2002.
SKOOG, A. D.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, R. S. Fundamentos de Química Analítica. Editora Thomson, São Paulo-SP, 2006.
SOMMER, L. Basis of Spectrophotometry in the UV and Vis Regions. Studies in Analytical Chemistry, v. 8, p. 13-46, 1989.
VINADÉ, C. E. M; VINADÉ, C. R. E, Métodos espectroscópicos de análise quantitativa. Santa Maria: UFSM, 2005.