Métodos cromatográficos

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04/09/2019 
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Métodos Cromatográficos 
Maria Elvira Poleti Martucci 
e-mail: maria.martucci@ufop.edu.br 
O QUE É CROMATOGRAFIA 
 Método físico-químico de separação de misturas 
 1906: Termo Cromatografia – Botânico Russo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Análises qualitativas e quantitativas 
 Isolamentos 
APLICAÇÕES EM PRODUTOS NATURAIS 
 Perfil químico 
 Caracterizações químicas e biológicas 
 Isolamento de substâncias bioativas 
 Análises qualitativas e quantitativas 
 
PURIFICAÇÃO E ISOLAMENTO 
Extrato 
Material vegetal 
Cromatografia 
Análises quali/quanti 
Frações purificadas ou substâncias isoladas 
CROMATOGRAFIA – COMO FUNCIONA? 
 Separação por interação diferencial das substâncias da 
mistura com a fase estacionária e com a fase móvel 
 
SIMPLIFICANDO... 
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CLASSIFICAÇÃO 
De acordo com a fase móvel (FM) 
 
 Líquido 
 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) 
 Cromatografia em coluna clássica 
 
 
 Gás 
 Cromatografia gasosa (CG) 
 
 
 
CLASSIFICAÇÃO 
De acordo com a fase estacionária (FE) 
 
 Sólida 
 
 Líquida 
 
 Quimicamente ligada 
 - Suporte sólido 
 - Grupos polares (amino, amida) 
 - Grupos apolares (C18; C8) 
 
 
FASE NORMAL X FASE REVERSA 
 
Fase Normal 
FE mais polar 
que FM 
FE: sílica, 
alumina, 
grupos 
(amino, ciano 
FM: acetato de 
etila, hexano, 
isopropanol 
Ordem de 
eluição: 
apolares 
primeiro 
Fase Reversa 
FE menos 
polar que FM 
FE: 
C18, C8 
FM: 
acetonitrila, 
água, metanol 
Ordem de 
eluição: 
polares 
primeiro 
PRINCIPAIS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS 
Cromatografia em camada delgada (CCD) 
 
Cromatografia em camada delgada centrífuga 
 
Cromatografia em coluna clássica 
 
Cromatografia líquida de 
alta eficiência (HPLC) 
 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA 
 Técnica simples e econômica 
 
 
 
 
 Sílica 
 -Ligações covalentes entre silanóis e substância de interesse 
 - Adsorção irreversível: perda de material 
 
 Alumina 
 - Propriedades ácidas e alcalinas 
 
 Fase quimicamente ligada 
 - Novas aplicabilidades 
 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA 
 ----------------------- 
 - -------------------- 
 
 
 
 - -------------- 
 
 - ------- 
 
 
 - ---------------------------- 
 
 
a 
b 
c 
FM 
•Ponto de aplicação da amostra 
•Nível máximo da FM 
Linha de chegada da FM 
Rf = ΔS amostra 
 ΔS FM 
 
Rfa = Δa 
 ΔFM 
 Comparação com padrão 
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DETECÇÃO EM CCD 
 Método físico: Luz UV/Visível (λ = 200-800nm) 
 
 
 
 
 
 
 
 Método Químico: Reagentes Cromogênicos 
• Melhoram a detecção por UV 
• Específicos para cada classe de metabólito secundário 
CCD BIDIMENSIONAL 
1º desenvolvimento 2º desenvolvimento 
Eluição com outro solvente 
Separação de misturas complexas 90º 
TIPOS DE CCD 
 
 CCD analítica 
• Análises qualitativas – comparação com padrão 
• Análises quantitativas 
 
 CCD preparativa 
• Isolamento 
• Separação analito/FE – extração com solventes 
 
 CCD centrífuga 
• Chromatotron 
• Isolamento 
CCD PREPARATIVA 
 FE mais espessa 
 Região de interesse é removida da placa 
Extração com 
solvente Região de 
interesse é 
removida 
Filtração 
Eliminação 
da FE 
Substância 
isolada 
Secagem 
Possibilidade de perda de amostra 
Presença de contaminantes 
Suporta pouca amostra 
 
 Isolamento 
 Amostra aplicada no centro da placa circular 
 Bomba peristáltica – solvente 
 Frações coletadas na periferia 
 Monitoramento por CCD 
 
 Vantagens: 
• Utilização de gradiente de solventes 
• Menor risco de perda de amostra 
• Permite regeneração da FE 
CCD CENTRÍFUGA – CHROMATOTRON 
 
CROMATOGRAFIA EM COLUNA 
 Purificação e Isolamento 
 
 Quantidade grande de material de partida 
 Grande quantidade de solvente 
 Suporta maior quantidade de amostra que CCD 
 Frações monitoradas por CCD 
 
 
 
 Características desejáveis para a FE: 
• Inerte 
• Estável: capaz de suportar variações de temperatura e pH 
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CROMATOGRAFIA EM COLUNA 
 
 
 
 
 
 
 
 Coluna aberta: 
• Técnica lenta 
• Perda de amostra 
• Adsorção irreversível 
• Baixa reprodutibilidade 
 
 Cromatografia líquida à vácuo 
(VLC): 
• Eluição à vácuo 
• Empacotamento uniforme 
• Maior resolução 
cromatográfica 
 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA 
(HPLC) 
 Coluna de aço empacotada com micropartículas 
 
 Fase móvel – líquida 
 
 Isolamento 
 Análises qualitativas e quantitativas 
 
 Eluição da fase móvel: 
• Isocrática 
• Gradiente 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA 
(HPLC) HPLC PREPARATIVO 
• Isolamento 
• Purificação de frações obtidas de outras técnicas 
cromatográficas 
 
 
 
DIFERENÇAS ENTRE HPLC PREPARATIVO E 
HPLC ANALÍTICO 
 HPLC preparativo 
 Quantidade de amostra: mg 
 Produção máx de substância 
isolada 
 Fração purificada 
 Fluxo de FM alto > 3mL 
 Colunas grandes (comprimento, 
diâmetro interno e tamanho de 
partícula) 
 HPLC analítico 
 Quantidade de amostra: ug/ng 
 Análises qualitativas e/ou 
quantitativas 
 Comparação com padrão 
 Fluxo de FM < 3mL 
COMO MELHORAR A SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA?? 
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COMO MELHORAR A SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA?? 
 Alteração da FE 
 Outra coluna ; outra FE 
 FN X FR 
 Tamanho de partícula 
 Comprimento 
 
 Alteração da FM 
 Composição 
 Adição de ácido/base 
 
 Modificação do método 
 Isocrático  Gradiente 
 Modificação do gradiente 
QUAL TÉCNICA UTILIZAR??? 
QUAL TÉCNICA UTILIZAR? 
 Técnica analítica ou preparativa 
 
 Quantidade de amostra 
 
 Características da matriz 
 
 Propriedades físico-químicas da substância de interesse 
 
 Quantidade a ser isolada 
 
 Finalidade da substância obtida 
 
 Técnicas disponíveis no laboratório