Fatores de Transcrição, efeitos epigenéticos

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Fatores de Transcrição, efeitos epigenéticos.
Lourranny Gomes; Luís Gustavo; Luiza Nonato; Nathalia Faria; Patrícia Amorim.
Fatores de Transcrição
Pertence a uma classe de proteínas que regulam a expressão de genes alvos.
Ativação.
Repressão.
*Depende de onde as células são expressas;
*Promotor específico;
*Contato com a cromatina;
*Estágio do desenvolvimento;
Fatores de transcrição:
**FOX 
**HOX
**PAX
**bHLH
Google imagens
→Fator de transcrição não precisa se ligar ao DNA para regular a transcrição ao reagir com as proteinas acessorias, podem se ligar a outros fatores já ligados ao promotor no DNA.
Geralmente, os fatores de transcricao ligam-se a sequencias especificas de nucleotideos na regiao promotora dos genes alvo, podendo, ativar ou reprimir a transcricao. Eles dependem da localizacao em que as celulas sao expressas, do promotor especifico, do contato com a cromatina e do estagio de desenvolvimento. Esses fatores nao precisam se ligar diretamente a regiao promotora, podem ligar a outros fatores trascricao já ligados a regiao promotora. Ou podem se ligar e sequestrar outros fatores de transcricao - reprimindo a transcricao 
Os fatores de transcricao incluem mais de 40membros que desempnham varios papeis durante o desenvolvimento e nas doençaa. 80 a 100 aas que se ligam a sequencias especificas de DNA. outro exemplos incluem os fatores de transcicao HOX, PAX e bHLH
Proteínas HOX
*Os Genes HOX foram descobertos pela primeira vez na mosca da fruta. 
*As mutações do complexo homeótico (HOM-C) provocam fenótipos dramáticos, como o gene Antennapedia (pernas brotam na cabeça ao invés de antenas).
*A ordem dos genes HOX ao longo do eixo anteroposterior é fielmente reproduzida em sua organização do nível no cromossomo. Sua localização cromossômica, também é conservada em seres humanos;
Khan Academy.com
→Descobertas nas moscas das frutas genes descobertos pela primeira vez pela mosca da fruta
→Homeodomínio - região mais conservada da proteína que é altamente conservada ao longo da evolução
Proteínas HOX
*Defeitos em HOXA1 prejudicam o desenvolvimento do sistema nervoso humano;
A. Síndrome de Duane Bilateral. - abdução limitada com retração do globo ocular e estreitamento das fissuras palpebrais
B. (RNM) cranioencefálica- cisternas suprasselares (1) e pré-pontinas (2) aumentadas. 
C. TC do osso temporal - subdesenvolvimento da orelha interna esquerda com a presença de uma cavidade.
D. TC da base do crânio - canal carotídeo esquerdo ausente. 
E. RM de cérebro - artérias comunicantes posteriores (seta única) e artérias carótidas internas esquerda e direita sobrepostas (setas duplas). 
F. (RNM) cranioencefálica - artérias carótidas internas ausentes bilateralmente, aumento das artérias basilares (seta aberta) e artérias comunicantes posteriores (setas).
 Quinonez e Innis, (2014). 
Na imagem um podemos ver que o individuo afetado tem abducao ocular limitada com retracao do globo ocular e estraitamento das fissuras palpebrais
 Na segunda imagem podemos observar cisternas suprasselares pre pontinas aumentas quepodem provocar sindromes clinicas associadas a hiperssecrecao de hormonio hipofisarios e graus variados de perda da funcao da hipose, alem de efeitos neuro anatomicos relacionados a localizacao 
lesões selares e peri-selares podem provocar síndromes clínicas associadas à hipersecreção dos diversos hormônios hipofisários, graus variados de perda da função hipofisária, efeitos neuroanatômicos relacionados ao local onde se localizam 
Proteínas HOX
*Mutações em HOXA13 e HOXD13 resultam em má formação de membros;
 Quinonez e Innis, (2014). 
 Quinonez e Innis, (2014). 
HOXA13 --polegares e hálux encurtado - braquidactilia clínica dos segundo e quinto dedos.
--hipoplasia bilateral do polegar e do hálux causada pelo encurtamento da falange distal e / ou do primeiro metacarpo ou metatarsal
HOX d 13 ---. A- Sindactilia entre os dedos 3 e 4. 
B. sindactilia entre os dedos 3 e 4 com um dígito extra presente entre estes dedos.
 C. Terceira falange distal e média duplicada, terceira falange proximal bífida e quinta falange média hipoplástica. 
D. Falanges 3a distal, média e proximal duplicadas, 3a metacarpiana bifida, 5a falange média hipoplástica e polegar radialmente desviado com um 1º metacarpo curto. 
E. Polissindactilia com sindactilia entre os dedos 4 e 5 e um dedo extra.
Proteínas HOX
*A familia HOX de gene homebox codifica um homeodomínio composto por 3 alfa -hélice.
* A hélice de reconhecimento liga-se a sítios de DNA que contenham receptores de ligação a tetra-nucleotídeos dos promotores dos genes- alfa;
* Homeodomínio - região altamente conservada da ptn. ao longo da evolução.
**Outras regioes de ptt nao sao bem conservadas.
3 helice de reconhecimento
Proteínas HOX
*Mutações da região de ligação ao DNA do gene homeobox NKX2-5 = defeitos no septo atrial cardíaco. 
*Mutações am ARX = malformação no SNC, síndrome da lisencefalia.
Dobyns, W. B., Stratton, R. F.,e Greenberg, F. (1984)
Síndrome da hipoplasia cardiaca esq.
Sindrome da hipoplasia cardiaca esq e tetralogia de fallot (Creasy e Resnik)
Ausencia de circunolucoes- giros
Deficits psicomotores
Atrasos severros
Espasmos, convulsoes
Pode ser acompanhado de microcefalia
 Fallot -- a) estenose da valva pulmonar; b) comunicação interventricular; c) dextroposição da aorta e d)hipertrofia do ventrículo direito (veja a imagem).
Genes PAX
*PAX → contém receptores de ligação a DNA bipartidos conservados → domínio PAX;
*Também contém Homeodomínio;
→ podem ativar ou reprimir
Chamado
A maioria
Genes PAX
*Ortólogo de PAX6 de D. melanogaster eyeless é essencial para o desenvolvimento do olho;
 
*Indivíduos com apenas uma cópia funcional 
→ Haploinsuficiência - defeitos oculares; 
*Sem função de PAX 6 → Anolftálmicos.
medikoe.com
elbotiquin.mx
Corso, et al. (2011)
→Aniridia- ausencia da íris - ontrolar os níveis de luz
Anomalia de peter - grande redução da visã
Nao possui olhos
Em um experimento com ganho de funcao a expressao ectopica de eyeless provocou a formacao de olhos adicionais 
Assim, na musca da fruta eyless é regulador chave 
Genes PAX
*PAX 3 e PAX 7.
Cancer infantil resulta de …
FOXO1 é um fator de transcrição responsável pela modulação de genes envolvidos na diferenciação, proliferação e sobrevivência celular. A expressão de FOXO1 parece estar associada à expressão de adiponectina devido a sua ação na formação de um complexo promotor da transcrição de adiponectina.
Sindrome de waa... - doenca humana autossomica dominante – resulta de mutações no gene PAX 3
→Anormalidades da pigmentacao – topete branco
→Defeitos oculares ( distopia canthorum)
FATORES DE TRANSCRIÇÃO HÉLICE - ALÇA - HÉLICE BÁSICOS
* Os genes hélice-alça-hélice básicos (bHLH) produzem fatores de transcrição que determinam o destino da célula e regula a diferenciação de tecidos .
 Proteina
 (bHLH)
Região de ligação ao DNA 
 (carregada+)
Hidrofóbico
Hidrofílico 
Hidrofóbico
Hidrofílico
* O lado hidrofóbico é o região da interação proteína -proteína ( heterodimerização);
*Heterodimerização - para regular a transcrição. 
Alça - hélices
Durante o desenvolvimenti
A proteina bHLH em nível molecular têm uma região de ligação DNA que é seguida uma alça e duas hélices com lados hidrofóbicos e hidrofílicos .
A heterodimerização acontece para regular a alfa transcrição 
FATORES DE TRANSCRIÇÃO HÉLICE - ALÇA - HÉLICE BÁSICOS
* A pró-diferenciação dos genes bHLH pode ser reprimida por vários mecanismos.
 Proteínas Inibitórias de diferenciação (id) - não possuem receptor básico de lig. De DNA. 
*Quando as Id sofrem heterodimerização com proteínas bHLH, elas impedem a ligação das bHLH nas sequências promotoras de seus genes-alvo (E-boxes) - inibe transcrição; 
Id ,são proteínas que não possuem
motivo básico de ligação ao DNA
Se a proteina não se liga na região e-boxes inibe a transcrição
FATORES DE TRANSCRIÇÃO HÉLICE - ALÇA - HÉLICE BÁSICOS
 *Fatores de crescimento* 
→ Podem aumentar o nível de Id, que sequestram ptts bHLH de seus promotores ;
→ estimular a fosforilação do domínio de ligação ao DNA das ptts bHLH;
→ inibindo a diferenciação celular.
→ inibir a capacidade de ligação ao DNA.
FATORES DE TRANSCRIÇÃO HÉLICE - ALÇA - HÉLICE BÁSICOS
A expressão dos genes bHLH é crucial para o desenvolvimento dos tecidos.
Músculo (miogenina - MIOD1)
Neurônios (NEUROD1)
*Regulador chave da diferenciação muscular.
*Estudos camundongos : MioD e outro gene bHLH, Myf5→ cruciais para diferenciação de mioblastos.
* Diferenciação de mioblasto em célula muscular é controlado pela miogenina.
A expressão dos genes bHLH é crucial para o desenvolvimento dos tecidos como músculo (miogenina - MIOD1) e neuronios (NEUROD1).
A expressao de miod 1 é 
Estudos confirmaras 
Miod -transdiferencia varias linhagens celulares em celulas musculares
FATORES DE TRANSCRIÇÃO HÉLICE - ALÇA - HÉLICE BÁSICOS
Mash 1 (ASCL em humanos)
 
Genes pró neurais que regulam a formação de neuroblastos a partir do neuroepitélio
Neurogenin 1 (Neuro D3 em humanos)
Genes cruciais para especificação de diferentes subpopulações do SNC em desenvolvimento. (modelos murinos).
*Ex: Camundongos nocaute para Mash 1 → defeito no desenvolvimento do prosencéfalo.
*Ex: Camundongos nocaute para Neurogenin 1 → defeitos nos gânglios sensoriais cranianos e nos neurônios no corno ventral da medula espinhal. .
déficit motor e sensitivo corno ant
FATORES DE TRANSCRIÇÃO HÉLICE - ALÇA - HÉLICE BÁSICOS
*Especificação dos neuroblastos regulado por outros genes pró neurais → Neuro D e Math 5 (ATOH7 em seres humanos).
* Diferenciação muscular e neuronal → controlada por uma cascata de genes bHLH que funcionam nos estágios iniciais e tardios da diferenciação celular.
*As duas vias de diferenciação são inibidas pela sinalização da Via Notch.
epigenética
*Estuda as alterações hereditárias na função de genes, que não podem ser explicadas por alterações subjacentes na sequência de DNA;
* Estudo de modificações (acetilação e fosforilação de histonas) - Embora a expressão do gene seja afetada, essas modificações, não são necessariamente herdadas;
Epigenética	
 *Mecanismos importantes na regulação epigenética:
Epigenética
*As marcas epigenéticas são reguladas por classes de enzimas que as conhecem (leitores), adicionam marcadores epigenéticos (escritores) ou que removem as marcas (apagadores).
*Os distúrbios do remodelamento da cromatina incluem as síndrome de Rett, Rubinstein-taybi e alfa-talassemia/ retardo mental ligado ao X e vários tipos de câncer.
Epigenética
CHIP seq e RNA seq (métodos precisos)
Identifica genes alvo específicos de fatores de transcrição por genoma
Avaliar padrões de expressão gênica alterados durante estágio de desenvolvimento ou em doenças como câncer
*CHIP seq - Imunosupreciptação de cromatina associadas ao sequenciamento de DNA e RNA seq- sequenciamento de RNA;
Histonas 
temasbio.ufscar.br
temasbio.ufscar.br
Histonas
*Octômeros de histonas → são subunidades de histonas 2A, 2B, 3 e 4 subunidades;
Ex de modificações de histonas incluem fosforilação, ubiquitinação, sumoilação, acetilação e metilação.
Gerando Fosforilação, metilação e acetilação
 Acetilação de histonas 	Metilação de histonas 
Associada a ativação da transcrição Associada a repressão da transcrição
slideplayer.com.br
Acetilação de Histonas
*Acetilação de histonas → controlado por genes como histonas acetiltransferases (HATs)
Fatores de Transcrição
Modificam a acetilação de histonas - acetiltransferases .
Recrutam histonas desacetilases (HDACs).
Acetilação de Histonas
*Proteínas leitoras → ligam-se às histonas acetiladas como as enzimas de remodelamento de cromatina SMARCA4, contém estrutura proteica, o Bromodomínio.
*A fosforilação → causa um afrouxamento da estrutura de cromatina e ativação da transcrição gênica.
Metilação de Histonas 
*Histonas metiltransferares ( HMTs) catalisam a adição de um grupo metila à resíduos de lisina nas caudas de histonas;
*Histonas desmetilases (HDMs) removem a modificação;
*Pode resultar na adição de grupos metilas a um resíduo de lisina individual e à ativação da repressão ou da expressão gênica;
Metilação de Histonas
*A trimetilação pode estar associada a repressão ou ativação dos promotores.
*Mutações de leitores, escritores e apagadores da modificação de histonas podem provocar doenças distúrbios do desenvolvimento e câncer.
Metilação do dna
*Usada para repressão dos genes a longo prazo;
*Resíduos de citosina são metilados rapidamente em dinucleotídeos GC após a implantação pela DNA metiltransferases.
Implantação
Metilação dos resíduos de citosina
Dinucleotídeos GC
Metiltransferases
*contraste com mecanismo dinamico de modificacao da histona
Metiltransferases= enzimas escritores
Metilação do dna
*Durante o desenvolvimento embrionário, genes de pluripotência são reprimidos à medida que as células se diferenciam; 
*REPRESSÃO → mantida pela metilação dos loci em células diferenciadas. 
*O estado de metilação é apagado nas células germinativas primordiais para permitir a reexpressão dos genes de pluripotência.
*A metilação de DNA também é usada para repressão efetiva de genomas virais que são integrados no nosso próprio genomas.
Metilação do dna
*Mutações MECP2 se liga ao DNA metilado → síndrome de RETT.
Usados para TTO de distúrbios - câncer.
*TERAPIAS EPIGENÉTICAS
NO CANCER GENES DUPRESSOR DE TUMOR FREQUENTEMENTE SAO INATIVADOS PELA METILACAO DO DNA - PERMITINDO UM CRESCIMENTO CELULAR DESCONTROLADO
*Mutações MECP2 QUE se liga ao DNA metilado RESULTAM EM UM DISTURBIO NO DESENVOLVIMENTO - síndrome de RETT.( CONTRALAM A EXPRESSAO DE VARIOS GENES IMPORTANTES PARA O DESENVOLVIMENTO DOS NEURONIOS 
AGENTES DESMETILADORES DE DNA COMO OS CITADOS ESTAO SENDO USADOS CLINICAMENTE PARA TTO DE VARIOS DISTURBIOS INCLUINDO O CANCER. ESSES MEDICAMENTO + INIBIDORES DE HDAC SAO EX DE TERAPIA EPIGENETICAS.
MICRO RNAS
*São RNAs não codificadores de 22 nucleotídeos (curtos) e altamente conservados, que agem após a transcrição para silenciar o RNA;
*Biogênese de RNAmis → complexa → representa um processo altamente regulado. No citoplasma os pré-RNAmis precisam de uma ribonuclease (DICER) para que sejam processados.
Micro RNAs
*Uma fita de RNAmi é adicionada no complexo silenciados induzidos por RNA (RISC)
*O RNAmis pode também modificar a expressão gênica sem mudar a sequência do DNA. Ao dobrarem sobre si os RNAmi formam grampos curtos que diferenciam das moléculas de RNA de dupla-fita. 
Micro RNAs
* Muitas doenças, síndrome do desenvolvimento e câncer.
Desregulação de RNAmi
Os RNA mis epecíficos associados ao câncer 
Predisposição familiar a tumores
Mutações na linhagem germinativa DICER1
oncomirs
Blastoma pleuopulmonar, nefroma cístico e meduloepitelioma
Micro RNAs
Biomarcador prognostico para evolucao de doenças
Micro RNAs
Biotecnologia
*Na prática clínica, tais métodos são introduzidos por meio de terapia por RNAmis.
Perguntas?
Obrigado!