IMUNOLOGIA CLINICA RESUMO-convertido

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Reações de Aglutinação e precipitação. 
A pesquisa e quantificação de antígenos e anticorpos serve para dosagem de hormônios (T3, 
T4, TSH, etc.), diagnóstico e acompanhamento de doenças infecciosas (pesquisa de Ag ou Ac), 
dentre outras aplicações. 
As principais características das interações entre antígenos e anticorpos, são: 
• Afinidade, que é a força de interação entre um único sítio de ligação ag-ac, em um 
único epítopo (menor porção do antígeno que vai gerar a resposta imune quando em 
contato com o anticorpo). Exemplo: Hepatite por HBV (pesquisa de agentes virais e de 
anticorpos contra o vírus). 
• Avidez, que é a força de interação total entre ag e ac. Ocorre a soma das afinidades de 
todos os epítopos envolvidos. 
• Especificidade, capacidade do ac de distinguir seu imunógeno de outros ags. 
• Reação cruzada, dois ags diferentes apresentam epítopos estruturalmente 
semelhantes. Os acs específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não 
relacionado, com propriedades químicas similares. Ex: reação cruzada em áreas 
endêmicas de Leishmaniose e Doença de Chagas. 
• Especifidade analítica, capacidade do teste de detectar apenas o analito em questão, 
sem reações cruzadas. Alguns fatores que levam a resultados falso-positivos: Presença 
de acs naturais; poli infecções. 
MÉTODOS: 
Reagentes não marcados: 1) Reação de aglutinação 
2) Reação de floculação 
3) Reação de precipitação 
1) Reação de aglutinação: Pode ser direta, realizada em eritrócitos (hemaglutinação), 
bactérias, fungos. 
Passiva: látex. 
- As reações de aglutinação são feitas em lâmina, tubo ou placa de microtitulação. 
- Fatores interferentes: Classe de Ac, tempo, temperatura, presença de 
macromoléculas (ex. albumina). 
- Permite maior diluição da solução teste que a imunodifusão. 
- Forma complexos mais pesados, que precipitam com maior velocidade e facilidade. - 
- Melhoria da detecção ag-ac; 
- Vantagens: Método simples, de fácil execução, baixo custo, rápido. 
- Desvantagens: Baixa sensibilidade e especificidade, devido ao mal armazenamento 
das hemácias, pode-se obter resultados falso-negativos. 
- Aglutinação direta: Pode ser utilizada para pesquisa de ag que faz parte naturalmente 
da célula ou hemácia/ Pesquisa de ag na superfície das hemácias. Ex: Sistema ABO, Rh. 
- Aglutinação indireta ou passiva: Ocorre aglutinação passiva usando hemácias ( hemo 
aglutinação), as hemácias são sensibilizadas com ag dos micróbios; são detectadas 
classes de ac. Ag ou Ac não faz parte da partícula. 
• Exemplo 1: Partículas de látex com ac ou ag adsorvido; hemácias de aves com 
ag de microrganismos (hemaglutinação). 
• Exemplo 2: Látex para proteína C reativa (PCR), fator reumatoide ou para ac- 
anti estreptolisina O. 
- Aplicações: Sorologia para ac anti-Toxoplasma gondii. 
- As reações de aglutinação podem ser qualitativas ou quantitativas: 
- Qualitativas: Classificação sanguínea. 
- Semi-quantitativas: Detecção de infecções. 
 
2) FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO: Variação da técnica de hemo aglutinação, onde utiliza-
se a capacidade citolítica do Sistema de Complemento para amplificar a detecção da 
interação Ag/Ac. Variações da técnica: Inibição da fixação do complemento. 
- Antígeno + complemento + sérum com anticorpos forma a fixação do complemento; 
- Antígeno + complemento + sérum sem anticorpos não realiza a fixação do 
complemento; 
- Vantagens: Maior sensibilidade do que a hemo aglutinação, rápida execução, baixo 
custo. 
- Desvantagens: Devido a problemas na preservação do complemento, e na sua 
estabilidade, problemas de falso negativos podem ocorrer. 
 
3) REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO: Quantidades de ag solúvel são adicionadas a uma 
quantidade fixa de soro contendo o ac. E a medida que a quantidade de ag aumenta, a 
quantidade de ac também aumenta até um valor máximo para depois diminuir. Ao 
final são produzidos complexos insolúveis visíveis. 
- Quando as quantidades de ac e ag são equivalentes, há a formação máxima de 
precipitado, decrescendo à medida em que um dos dois reagentes está em excesso: 
pró-zona ou zona de excesso de anticorpo e pós-zona de excesso de antígeno. 
Precipitado em solução: O precipitado é formado pela geração lenta de um reagente 
precipitante de forma homogênea em toda a solução. 
• IMUNODIFUSÃO > Vantagens: 1) Método de fácil execução, tempo curto de 
realização, baixo custo, não necessita de aparato sofisticado. 
- Desvantagens: 1) Baixa sensibilidade, especificidade, difícil preservação do gel, não 
aplicável a alguns isotipos de Igs. É pouco utilizado como ferramenta de diagnóstico e 
mais utilizada como controle da produção de anticorpos policlonais. 
- PRECIPITAÇÃO EM GEL – IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES: Um anticorpo específico 
é incorporado à solução de ágar ou agarose antes da gelificação. Permite a 
quantificação do antígeno ou anticorpo. O processo continua até ser atingida a zona 
de equivalência com os compostos precipitando-se em um anel (halo) em torno do 
orifício. 
• Ex: Uso para verificar classes e subclasses de Igs, proteínas do complemento e 
proteína C reativa. 
- PRECIPITAÇÃO EM GEL – IMUNODIFUSÃO RADIAL DUPLA: Antissoro e amostra são 
adicionados à orifícios diferentes do gel de ágar (não são incorporados no ágar). As 
soluções sofrem difusão e quando o ag e ac se encontram em uma zona de 
equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação. Pode 
ser visualizada pós lavagem do gel, para remoção das proteínas solúveis, por coloração 
dos arcos de precipitação com corante. Ex: muito usada em pesquisa e diagnóstico de 
cisticercose. 
4) REAÇÃO DE FLOCULAÇÃO: Coagulação de certas soluções coloidais sob a forma de 
flóculos. 
- Utilizados para testes como VDRL (Veneral Disease Research Laboratory). Usado para 
triagem e controle de tratamento de sífilis. O antígeno usadi utiliza cristais de 
colesterol e cardiolipina e lectina. Utilizado para pesquisa de ac anti cardiolipina. 
- Utilizado para detectar algumas patologias como, síndrome do anticorpo anti – 
fosfolipídio, onde o organismo produz acs que formam trombos e é a causa de abortos 
repentinos. 
5) IMUNOELETROFORESE: Eletroforese seguida de imunodifusão. 
1º - Realizada a eletroforese de proteínas, onde será feita a separação de proteínas do 
soro do paciente de acordo com a carga em gel de ágar ou agarose. 
- É um teste qualitativo; 
- Utiliza lâminas recobertas por ágar. 
- As moléculas migram para o polo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com suas 
cargas elétricas. 
- Ag e Ac formam arcos de precipitação. 
- Usados para detectar gamopatias monoclonais, como mieloma múltiplo e 
macroglobulinemia. 
6) IMUNOFIXAÇÃO – Mais sensível e rápida que a imunoeletroforese. 
- A amostra é aplicada em 6 posições diferentes no gel de agarose e proteínas da 
amostra são fracionadas. 
- Soros mono específicos (anti- IgG, anti- IgA) impregnados em fita de papel são 
aplicados em cada posição e difundem no gel. 
- Adicionar solução fixadora de proteínas. 
7) ELISA (ENZYME- LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) – Técnica que utiliza ag/ac 
imobilizado em placa de polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a 
qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará 
a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor. Variações da técnica: ELISA 
quimio-luminescente, ELISA fluorescente, ELISA radioativo. 
- O anticorpo estará marcado com a enzima. 
- ELISA DIRETO: No fundo dos poços há acs específicos para a patologia. Se na amostra 
houver antígenos para determinadas doenças, ele se ligará diretamente ao anticorpo. 
Após isso é realizada a incubação para que haja a ligação. Depois éfeita uma lavagem, 
que é um passo importante para retirar os antígenos que não se ligaram ao anticorpo. 
É adicionado então um ac conjugado que estará ligado com a enzima que geralmente é 
da classe das peroxidases e por fim o substrato para a enzima para alteração na cor. 
- ELISA INDIRETO: Na microplaca já haverá o antígeno para a patologia, a amostra 
adicionada vai estar com possíveis anticorpos produzidos que vão se ligar a estes 
antígenos na placa. Ocorre novamente a incubação. Retira-se os anticorpos 
desnecessários. Adiciona-se o anticorpo conjugado, que não será contra o antígeno, 
mas contra o anticorpo, chamado também de anti-anticorpo, este é específico para se 
ligar a porção fc do anticorpo. Substrato cromogênico é inserido então para a 
mudança de cor. 
- ELISA DE CAPTURA: No fundo da microplaca haverá anticorpos, mas diferente do 
ELISA direto vai querer encontrar anticorpos. Adiciona-se a amostra e se houverem acs 
reagentes a doença, estes serão ligados nos acs do início, que já estavam na placa. 
Depois é acrescentado o antígeno biotinilado, que é um antígeno marcado assim como 
o ac conjugado, marcado com a proteína biotina, que possui a capacidade de se ligar 
apenas ao ac específico para a patologia que foi o adicionado com o soro. Em seguida 
faz-se a lavagem e por fim é adicionada a enzima livre que se ligará com o antígeno 
biotinilado pois a mesma tem afinidade com a biotina, haverá então a mudança de cor. 
- ELISA DE COMPETIÇÃO: Tenta localizar antígenos. É uma técnica direta. Os 
anticorpos já estão na placa. São adicionados os antígenos com a amostra e depois o 
antígeno biotinilado. Mas o antígeno biotinilado só toma o lugar do anterior se o outro 
não for específico, se o anterior for, ele não consegue tomar o lugar. É um teste 
confirmatório para saber se o paciente é positivo ou negativo. Por fim a enzima é 
adicionada. 
- Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade 
como ensaio quantitativo. Custo baixo a médio. 
- Desvantagens: Devido a alta sensibilidade pode ocorrem pequenas variações de 
pipetagem e tempo de incubação causando resultados alterados. 
- Em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve resposta. 
- ELISA de competição muito suscetível a erros de manipulação. 
8) IMUNOFLUORESCÊNCIA / IMUNOHISTOQUÍMICA – Utilizado s para detecção e 
localização de antígenos em células e tecidos e para detecção de anticorpos 
específicos em fluídos biológicos. É um método de alta especificidade e alta 
sensibilidade. 
São utilizados anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes (FITC, FAC) na IFA, 
e de anticorpos conjugados com enzimas (Imunohistoquímica). 
- Vantagens: Alta especificidade e sensibilidade; possibilidade de detecção de 
proteínas intracelulares e de sua localização, bem como do tráfico intracelular, 
reprodutível, determina classes e subclasses de anticorpos. 
- Desvantagens: “variação individual” na leitura de resultados de IFA; alto custo de 
microscópio de fluorescência; técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para 
imuno-histoquímica nem sempre disponíveis. Uso do microscópio de fluorescência, 
diminuição da fluorescência sob irradiação, subjetividade na leitura. 
- Utilizado em métodos colorimétricos, radioativos, quimioluminescentes, 
fluorescentes. Em agentes infecciosos, anticorpos, hormônios, alérgenos, etc. 
- Na reação de imunofluorescência os anticorpos são conjugados com fluorocromos 
que são substâncias que absorvem a luz de menor intensidade e quando excitados 
com luz ultravioleta, emitem luz de maior intensidade. Os mais utilizados são 
isoticiocianato de fluoresceína e rodamina que emitem luz na faixa visível. 
- IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETO: serve na pesquisa de antígenos (células ou tecidos). 
No método direto células com antígeno de membrana com fluorocromo são ligados a 
acs primários. 
- IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETO: pesquisa de acs ou ags. O anticorpo secundário 
antiisotipo é ligado com fluorocromo a um anticorpo primário anti-mAg. O método 
indireto com fluorocromo ligado à proteína A associado ao anticorpo primário anti-
mAg e anticorpo secundário aniisotipo. 
11) CITOMETRIA DE FLUXO – Identificação e separação de células baseadas na 
dispersão de luz e fluorescência sob feixe de laser. 
- Usado para populações de leucócitos > luz dispersa > tamanho e forma da célula. 
- Usado para identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B. 
- FACS (fluorescence-activacted cell sorter) – separação de uma única célula. 
- Faz a separação de células marcadas por fluorescência 
- São utilizados anticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou antígenos de 
conjunto de diferenciação (CD) 
- Cada ac é marcado com um fluorocromo diferente. É um teste qualitativo e 
quantitativo. 
 
Métodos utilizados para detecção e mensuração dos níveis de anticorpos em fluidos 
biológicos. 
- IMMUNO DOT, IMUNOHISTOQUÍMICA, IMUNOCITOQUÍMICA, IMUNOMIGRAÇÃO 
RÁPIDA, RADIOIMUNOENSAIO. 
- IMMUNO DOT: DOT-ELISA – reação imunoenzimática sobre proteína. É um método 
qualitativo ou semi-quantitativo, rápido e de simples execução. Usado para detecção 
de proteínas solúveis, fungos, protozoários, bactérias, vírus. 
- IMUNOHISTOQUÍMICA/ IMUNOCITOQUÍMICA – Detecção e localização de antígenos 
celulares/teciduais. 
- São utilizados anticorpos conjugados com enzimas Q em conversão de substrato 
incolor em produto colorido. 
- As enzimas mais utilizadas são, peroxidase, fosfatase alcalina, beta galactosidase, 
glicose oxidase. 
- Método direto: Acs primários conjugados (detecção de antígenos). 
- Método indireto: Acs secundários conjugados (detecção de antígenos e anticorpos) 
- Desvantagens: Atividade enzimática endógena, armazenamento inadequado dos 
conjugados. 
- IMUNOCITOQUÍMICA – Envolve a avaliação microscópica computadorizada após 
ensaio de imunofluorescência ou imuno-histoquímica em material de biópsia. Há um 
aumento na especificidade com a remoção da subjetividade do observador. Pode ser 
realizada a avaliação quantitativa através da cor, intensidade e concentração. 
9) WESTERN BLOT – Associação da técnica de Eletroforese em gel de SDS-page com 
técnicas imunológicas. 
- Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular 
definido. 
- Identificação de anticorpos que reconhecem determinado antígeno em solução 
contendo diversos antígenos. 
- Permite a realização de cinética de expressão de proteínas celulares. 
- Vantagens: Alta sensibilidade e especificidade; 
- Reconhecimento de antígenos individuais em um extrato. 
- Realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas 
imunodominantes. 
- Desvantagens: Custo médio a alto. 
- Procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos. 
- Dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança.