Técnicas Parasitologia

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EXAME DIRETO A FRESCO
O exame direto a fresco é um procedimento simples e eficiente para o estudo das fezes, permitindo observar os trofozoítos vivos dos protozoários.
 As preparações a fresco são obtidas diretamente dos espécimes fecais e requerem o mínimo de material (2mg) para cada método de exame. Todos os estágios de diagnóstico dos organismos, pelo uso de diferentes soluções, podem ser determinados e identificados. Para a identificação de cistos de protozoários e larvas de helmintos cora-se a preparação com Lugol. Os esfregaços com fezes frescas e não fixadas são rotineiramente preparados com as soluções salina a 0,85% e de iodo. Entretanto, se o número de organismos for pequeno, o exame de pequena quantidade de fezes usada para a preparação de esfregaços a fresco pode ser insuficiente para revelar a presença de parasitos. Os esfregaços deverão ser examinados através da objetiva do microscópio de pequeno aumento (10X) e com pequena intensidade de luz. A confirmação dos parasitos deve ser realizada com a objetiva de grande aumento (40X). 
Quando forem usadas fezes preservadas, a formalina atua como diluente, não sendo necessário adicionar a solução salina a 0,85% às preparações de esfregaços sem coloração. 
Colorações temporárias podem ser utilizadas com as preparações a fresco para auxiliar na localização e identificação de protozoários, sendo desnecessários esses corantes para a pesquisa de ovos e larvas de helmintos.
Figura 1: Método de leitura na lâmina
Preparações salinas
Nas preparações sem coloração são pesquisadas a presença de cistos, ovos e larvas, e a motilidade dos trofozoítos, quando presentes. Entretanto, não é possível estabelecer um diagnóstico específico, no caso de formas trofozoíticas, com base em um exame direto a fresco e temporário, que tem somente um valor de orientação. Nesse caso as fezes deverão ser fixadas e um esfregaço fecal deverá ser preparado. Para pesquisa de ovos, o exame direto a fresco sem coloração oferece bons resultados, mas para a de cistos e de larvas é necessário preparar um esfregaço corado, tendo em vista o estudo das características morfológicas das diferentes espécies. O primeiro exame das amostras fecais deve ser feito por meio de esfregaços salinos. Nunca deve ser usada água corrente ou destilada, pois os trofozoítos são distorcidos, podendo ser deformados e rompidos. 
Soluções de Iodo
As soluções de iodo são indicadas, principalmente, para a coloração de cistos, com o objetivo de determinar o número e a estrutura dos núcleos. A solução de iodo usada no método de Gram não é aconselhada para a coloração dos organismos parasitos. Os corantes não devem ser velhos, devendo apresentar uma correta intensidade de contraste. A solução de iodo muito concentrada é absorvida tão rapidamente, que os cistos tomam uma coloração marrom-escura uniforme. Entretanto, quando a concentração dessa solução é muito baixa, a solução não é suficientemente absorvida e os cistos tendem a harmonizar na sua periferia um matiz imperceptível junto a uma coloração de fundo amarelo-limão
Figura 2: Método de exame direto com lugol
TÉCNICAS DE CONCENTRAÇÃO
As técnicas de concentração figuram entre os procedimentos de rotina, como parte de um exame completo das fezes, para a pesquisa de parasitos e o diagnóstico de um pequeno número de organismos que foram omitidos, quando foi usado somente o exame direto a fresco. Os três principais objetivos dessas técnicas são aumentar o número de cistos, oocistos, ovos ou larvas na preparação; eliminar a maioria dos detritos fecais; e apresentar os organismos em um estado inalterado, facilitando sua identificação. Essas técnicas são indicadas para separar os cistos e oocistos de protozoários e ovos de helmintos do excesso de detritos fecais através de diferenças específicas de densidade. As técnicas de concentração se dividem em: flutuação e sedimentação, e cada uma destas se subdivide em flutuação simples e centrífugo-flutuação; sedimentação simples e centrífugo-sedimentação
TÉCNICAS DE FLUTUAÇÃO
As técnicas de flutuação fundamentam-se no princípio da diferença de densidade específica entre os ovos de helmintos, cistos e oocistos de protozoários e o material fecal, a fim de que esses organismos flutuem na superfície dos reagentes com densidade específica. 
Os procedimentos de flutuação usam reagentes de alta densidade para a concentração dos ovos, cistos e oocistos de parasitos. Os ovos e cistos usualmente apresentam uma densidade específica que varia de 1,05 a 1,15g/ml; entretanto alguns ovos, como de Clonorchis e Opisthorchis eoutras espécies muito próximas, mostram uma densidade específica superior a 1,20g/ml e não podem ser concentrados pelas técnicas usuais de flutuação.
As principais vantagens apresentadas pela flutuação são a formação na superfície do tubo de uma membrana clara com poucos detritos fecais e a remoção seletiva de ovos e cistos, mesmo quando presentes em pequeno número no bolo fecal, resultando em quantidade maior de organismos de certas espécies, quando comparado com o número de parasitos presentes nos esfregaços salinos. A alta densidade dos reagentes é a mais significativa desvantagem dos procedimentos de flutuação. A parede dos ovos e dos cistos, com muita frequência, entra em colapso e os parasitos tornam-se distorcidos na aparência, dificultando a identificação. Por essa razão, as membranas deverão ser colhidas e examinadas dentro de um período de 10 a 20 minutos. Os trofozoítos e os ovos operculados não são isolados através dessa técnica; flutuam somente os pequenos ovos de trematódeos, como o Clonorchis e o Heterophyes. Ovos pesados, como os de Ascaris, Taenia, Schistosoma, Fasciola eFasciolopis, não flutuam; alguns cistos delicados e as larvas são distorcidos.
As gorduras e os óleos presentes nas fezes flutuam com os ovos e cistos, tornando a preparação algumas vezes insatisfatória para o exame.
Nas técnicas de flutuação são usadas principalmente as soluções saturadas
de cloreto de sódio, de sacarose, de sulfato de zinco e de sulfato de magnésio.
Método de Flutuação (Willis)
 
Se fundamenta na concentração e flutuação de cistos de protozoários e ovos leves de helmintos em solução saturada de cloreto de sódio ou açúcar. 
 É indicado na pesquisa de protozoários e ovos leves de helmintos (Ancilostomídeos,
Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura).
1. Preparar uma suspensão de fezes em solução saturada de cloreto de sódio na proporção de 1:10. 
2. Filtrar em gaze dobrada 4 vezes, para um tubo de Wassermann, até bem próximo da borda. Com uma pipeta ou conta-gotas, acrescentar mais solução até a formação de um menisco positivo. 
3. Colocar uma lamínula sobre o tubo, de forma que entre em contato com o líquido. Deixar em repouso por 5 a 10 minutos. 
4. Transferir a lamínula para uma lâmina com uma gota de lugol e examinar.
Figura 3: Método de Willis
Técnica de Faust
A técnica de Faust foi o primeiro procedimento desenvolvido
para o diagnóstico de cistos de protozoários e de ovos e larvas de helmintos.
Ovos grandes de trematódeos, de cestóides e inférteis de A. lumbricoides não são concentrados. Essa técnica é imprópria para espécimes fecais que contenham grande quantidade de gorduras. A solução de sulfato de zinco é preparada na densidade de 1,18g/ml para fezes frescas. A técnica pode ser usada com fezes preservadas em formaldeído (5% ou 10%, tamponado ou não tamponado), SAF e fixador APV; entretanto, a densidade específica deverá ser ajustada em 1,20g/ml. O aumento da densidade poderá resultar em uma distorção adicional dos organismos. 
PROCEDIMENTO:
1. Preparar uma suspensão, utilizando uma parte de fezes para 10 partes de água. 
2. Filtrar em gaze dobrada 4 vezes para um tubo de Wassermann (13 x 100mm). 
3. Centrifugar por 1 minuto a 2500 r.p.m.; decantar o sobrenadante, adicionar 2 a 3ml de água ao sedimento e misturar bem; acrescentar mais água, até atingir o volume inicial e misturar novamente.
 4. Repetir a operação de lavagem do sedimento (item 3), sempre completando o volume inicial,até que o sobrenadante fique claro. 
5. Decantar o líquido sobrenadante da última lavagem e misturar o sedimento com 2 a 3ml de solução de sulfato de zinco, com densidade de 1.180 (apr. 33g%); acrescentar mais solução de sulfato de zinco, até atingir o volume inicial e misturar. 
6. Centrifugar por 1 minuto a 2500 r.p.m.. 7. Retirar da película superficial da solução de sulfato de zinco, por meio de uma alça de platina, o material a ser examinado. Corar com lugol e examinar.
Figura 4: Técnica de Faust
TÉCNICAS DE SEDIMENTAÇÃO
Os dois principais objetivos das técnicas de sedimentação são o aumento do número de ovos operculados, não operculados, larvas ou cistos e a separação das gorduras e óleos da maioria dos detritos. Nessas técnicas, os organismos são sedimentados igualmente pela gravidade ou centrifugação. A sedimentação apresenta uma ação inversa, comparada com a flutuação.
Os cistos, oocistos, ovos e larvas são retidos no fundo do tubo, enquanto os detritos são suspensos para a superfície, não interferindo no diagnóstico final. A maior desvantagem é a grande quantidade de detritos fecais no sedimento, tornando a identificação dos organismos muito mais difícil do que pelos procedimentos de flutuação. Algumas técnicas de sedimentação usam o éter etílico e soluções de ácido clorídrico, ácido acético, ou sulfato de sódio para clarificar e liberar os organismos dos detritos fecais. O éter poderia conduzir muitos ovos e cistos junto com os detritos, dificultando o diagnóstico das infecções leves. As soluções de ácidos fortes podem deformar ovos e cistos 
Sedimentação Espontânea
A técnica de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer é um procedimento
simples, indicado para a pesquisa de ovos, larvas e cistos. Fundamenta-se na sedimentação espontânea em água (combinação da gravidade e da sedimentação). O uso de grande quantidade de material fecal nesse processo, em contraste com as pequenas quantidades usadas em outras técnicas, favorece um diagnóstico satisfatório e seguro, mesmo quando o número de organismos presentes é pequeno. 
Apresenta como vantagens ser de baixo custo e necessidade mínima de vidrarias, facilidade de execução da técnica.
PROCEDIMENTO:
1. Colocar aproximadamente 2g de fezes em um frasco de Borrel (pode ser substituído por copo plástico descartável), com cerca de 5mL de água, e triturar bem com bastão de vidro (ou "palito de picolé");
2. Acrescentar mais 20mL de água;
3. Filtrar a suspensão para um cálice cônico de 200 mL de capacidade, por intermédio de tela metálica ou de náilon com cerca de 80 a 100 malhas por cm2, ou gaze cirúrgica dobrada em quatro; os detritos retidos são lavados com mais 20mL de água, agitando-se constantemente com o bastão de vidro, devendo o líquido da lavagem ser recolhido no mesmo cálice;
4. Completar o volume do cálice com água;
5. Após isso, deixar esta suspensão de fezes em repouso durante 2 a 24 horas, decantar. Acabado esse tempo, remover o sobrenadante cuidadosamente, para não levantar o sedimento. Se o líquido sobrenadante estiver turvo, fazer nova lavagem com mais 60 minutos de repouso;
6. A última etapa é colher uma gota do sedimento, colocar na lâmina, cobrir com lamínula e examinar ao microscópio com aumento (10x) e (40x), sendo preparadas três lâminas para análise.
Figura 5: Técnica de HPJ
Figura 6: Sedimentação espontânea. A) copo cônico de sedimentação com filtro descartável B) fezes em suspensão C) sedimentação após algumas horas
Método de Blagg
Também conhecido por método de MIFC, é usado para a pesquisa de ovos e larvas de helmintos, cistos e alguns oocistos de protozoários. Baseia-se na sedimentação forçada pela centrifugação. É rápido, fácil e sensível. Tem como desvantagem a necessidade de uma centrífuga. 
PROCEDIMENTO:
1. Colher as fezes recém-emitidas em liquido conservador de MIF e homogeneizar bem;
2. Filtrar a suspensão de fezes em gaze dobrada em quatro ou em filtro descartável, em um copo plástico descartável; 
3. Transferir 1 a 2mL do filtrado para um tubo cônico de centrifugação, com capacidade para 15mL;
4. Acrescentar 4 a 5mL de éter sulfúrico e agitar vigorosamente (importante para desengordurar o material);
5. Centrifugar por um minuto a 1.500rpm;
6. Serão formadas 4 camadas – no fundo está o sedimento com os parasitos;
7. Com o auxílio de um bastão, descolar a camada de detritos da parede do tubo;
8. Inverter o tubo para desprezar o liquido, mantendo-o com a boca voltada para baixo, até limpar a parede do mesmo, utilizando um bastão de vidro (ou palito de picolé) contendo algodão na extremidade;
9. Inverter o tubo em uma lâmina, deixando escoar todo o sedimento. Se a quantidade de sedimento for excessiva, utilizar uma pipeta para colhê-lo e preparar as lâminas;
10. Colocar no sedimento uma gota de salina ou lugol
11. Cobrir com lamínula e examinar com as objetivas de 10 e 40X em “zig-zag”.
Método de Ritchie (Centrífugo-sedimentação)
Existem inúmeras variações nas técnicas de sedimentação pelo emprego da centrifugação, todas elas são derivadas do procedimento original de Telemann. Ritchie apresentou, em 1948, uma técnica eficiente para recuperar e identificar cistos de protozoários e ovos e larvas de helmintos, incluindo ovos operculados e de esquistossoma em material fecal fresco, preservado pelo formaldeído. Alguns autores recomendam substituir o éter etílico pelo acetato de etila. Este reativo é inflamável, mas pode ser usado com espécimes conservados com formaldeído e fixador APV.
PROCEDIMENTO:
1. Preparar uma suspensão com uma parte de fezes para 10 partes de água. 
2. Filtrar, através de gaze dobrada 4 vezes, para um tubo de centrifugação. 
3. Centrifugar durante um minuto a 2000 r.p.m.; decantar o sobrenadante. 
4. Lavar o sedimento com água até que o sobrenadante fique límpido. 
5. Misturar o sedimento com solução de formol a 7.5%, em volume suficiente para alcançar 2/3 da altura total do tubo. Agitar bem. 
6. Deixar em repouso por 20 a 30 minutos. 
7. Adicionar pequena quantidade de éter, tampar o tubo e agitar vigorosamente. 
8. Centrifugar a 1500 r.p.m., durante 1 minuto. 
9. Decantar o sobrenadante; Remover, com um bastonete provido de algodão em uma das extremidades, os detritos superficiais aderidos à parede do tubo. 
10. Examinar o sedimento corado pelo lugol.
tável (Parasitofiltro
®) com alça de segurança; B) fezes em suspensão; C) sedimentação após
duas horas
Figura 7: Técnica de Ricthie
tável (Parasitofiltro
®) com alça de segurança; B) fezes em suspensão; C) sedimentação após
duas horas