Imunologia - Culturas Celulares

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Culturas Celulares
O que é?

Cultura in vitro de células (desde 1900) 
Qual o objectivo?

Na investigação

Na clínica

Nas empresas farmacêuticas 
Substituição de modelos animais 
Reprodutibilidade 
Ensaios mais rápidos e controlados 
 
Cultura de células: 
Culturas primárias 
Culturas secundárias 
Linhas imortalizadas 
Cultura de órgãos 
Cultura tridimensional de um tecido não desagregado que mantém a maioria ou todas as características histológicas do tecido in vivo 
Culturas Histotípicas 
As células são reassociadas de forma a criar uma estrutura 3D semelhante ao tecido original (infiltração de uma matriz de colagenio em gel) 
Tipo de estudos científicos
Estudos imunológicos 
1. Migração celular

2. Adesão celular

3. Proliferação celular 
4. Produção de citoquinas 
5. Vias de transdução de sinal 
Estudos farmacológicos 
1. Resposta celular in vitro

2. Estudos de sensibilidade a drogas 
3. Citotoxicidade 
Estudos oncológicos 
1. Estudos de sensibilidade a drogas Quimiotaxia 
Estudos microbiológicos 
1. Quimioterapia (resistência a químicos) Fagocitose 
Estudos moleculares 
1. Clonagem de genes - estudo da expressão e função 
Estudos em células estaminais 
1. Processo de diferenciação, cirurgia reconstrutiva 
 
Requisitos básicos de uma cultura celular
Meio de cultura apropriado: 
2. Soro e nutrientes 
3. Factores de crescimento 
4. Antibióticos 
5. Atmosfera adequada 
6. Superfície de adesão 
 
Como se processa? 
É necessário mimetizar as condições fisiológicas 
Células ou tecidos 
Equipamento 
Incubador de CO2 
Armazenamento em N2 líquido 
Câmara de fluxo laminar 
Microscópio

Hemocitómetro

Técnica asséptica

Soluções filtradas 
numa cultura em vias de extinção ... 
Não foram feitos triplicados 
Não foi considerada a presença de activadores 
Foi contaminada

A cultura está overcrowded 
Preservação
Tecidos (sangue, medula óssea, outros tecidos linfóides)

- Criopreservação: - 80 oC (3 meses; perda progressiva de 
características) 

		 
Células (culturas celulares, células previamente separadas) 

- Crioprotecção - 40 oC (semanas) 
- 80 oC (anos) 

No caso dos linfócitos ocorrem sempre algumas alterações ao nível das moléculas de superfície (fenotipagem antes da utilização)
 

Tipos celulares 
 
Reacção antigénio - anticorpo:

o uso do anticorpo para separação celular 
Anticorpos
Afinidade 
Avidez 
Antigénio-Anticorpo
Antigénio 
Epitope 
Anticorpos monoclonais 
Anticorpos policlonais 
Anticorpos monoclonais
Preparação: 
1. Estimulação do animal 

2. Colher Linfoblastos B 

3. Obter por cruzamento celular hibridomas 

4. Testar cada clone para especificidade ( screening) 

 
Anticorpo como terapia 
Uso de imunoglobulinas como agentes terapêuticos 

· 
· Doenças crónicas inflamatórias 

· Cancro 

· Doenças auto-imunes 

· Transplantes 

· Imunodeficiências (IGIV)
Fraccionamento/Separação Celular
Separação Celular 
1. Centrifugação 

2. Panning 

3. Separação Imunomagnética 

4. Separação por Imunofluorescência 

5. Cromatografia 

6. Citometria de fluxo 

7. FACS (fluorescence-activated cell sorter) 

1.Centrifugação
A suspensão de células vai ter partículas com diferentes 
· Tamanho 
· Carga 
· Densidade 
Separação pela aplicação de força centrifuga elevada (600 mil x g)
Aplicações: 
· Técnica preparativa para separar um dado componente para estudo 
· Técnica analítica para determinar propriedades físicas (pm; densidade, forma) ou pesquisar a presença de macro moléculas 
 
Centrifugação Diferencial
· Envolve a separação do material solúvel entre o material celular insolúvel 
· A força centrífuga e o tempo de centrifugação são ajustadas de forma a assegurar que o material insolúvel fica no pellet e o material solúvel (proteínas) fica no sobrenadante 
ex: sangue/plasma 
Centrifugação em Gradiente 
· Envolve a separação de partículas com base na sua massa e forma mas numa solução de densidade (de sacarose) e/ou de concentração (de sais) crescente 
· A amostra é colocada no cimo do tubo e durante a centrifugação a migração dá-se de acordo com a velocidade de sedimentação, 
ex: separação de linfócitos do sangue 
Separação de Monócitos em gradiente de densidade 
· Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas mais densas, que por sua vez impedem as menos densas de sedimentar 
EX: centrifugação em gradiente de Ficoll-Hypaque 
Gradientes: 
Ficol: polissacarideo que agrega eritrócitos tornando-os mais densos e separa-os dos monócitos 
Metrizamida (composto derivado de glucose usado na separação de células, partículas subcelulares e vírus. 
Centrifugação em gradiente de Ficoll 
Eritrócitos + leucócitos polimorfonucleares (granulócitos) mais densos 
Células mononucleares (linfócitos + monócitos) menos densos - recuperados à superfície 
2.Panning
Aderência celular a uma superfície sólida 
Monócitos e macrófagos são naturalmente aderentes (medula óssea) 
· Células dendríticas 
Outras células podem aderir se a superfície estiver conjugada com anticorpos apropriados (anti Ig- separam B de T) 
3. Separação Imunomagnética
Forma rápida de separação de grandes quantidades de linfócitos 
Acoplamento de esferas magnéticas a anticorpos monoclonais que reconhecem moléculas da superfície das células 
Os anticorpos acoplados às esferas magnéticas, são misturados com as células a separar. A mistura passa por uma coluna magnética, que reterá as células ligadas ao anticorpo 
4.Separação por Imunofluorescência
· Anticorpos conjugados com compostos fluorescentes 

· Aumento de 10 a 1000 vezes na sensibilidade 

· Rapidez de detecção 

 5.Cromatografia
· Baseada na capacidade de uma proteína/componente se ligar especificamente a outra partícula (anticorpo) 
· As colunas contêm esferas ligadas covalentemente a anticorpos específicos de uma molécula de interesse, na célula coluna de imunoafinidade 
· As células são depois eluídas por ex. por uma solução concentrada de ligando, pH diferente do de ligação. 
6.Citometria de fluxo
· O Citómetro de Fluxo detecta e conta individualmente as células que passam através do laser (tamanho, granularidade e fluorescência). 
· O FACS (Fluorescence-activated cell sorter) 
· Permite separar subpopulações de linfócitos com base nas diferentes proteínas expressas á superfície (B, TCD4, TCD8) 
· Cada tipo celular é marcado com um anticorpo específico que se encontra acoplado a um corante fluorescente. 
Citometria
Granulócitos 
Monócitos 
Linfócitos 
 
Aplicações:
Imunologia 

Hematologia 

Anatomia patológica 

Biologia celular 

Oncologia 

1. 
2. Detecção de apoptose 
3. Permeabilidade membranar 
4. Mudanças do conteúdo de DNA 
5. Estudos enzimáticos funcionais

6. Resistência a fármacos 

7. Separação de células sanguíneas 
8. Diferenciação de sub populações de linfócitos T 
9. Diferenciação linfócitos B 
10. Diferenciação de células NK 
11. Quantificação antigénica 
12. Variações linfoproliferativas (idade, imunodeficiências, neoplasias, transplantes, DA, inflamações) 
13. Fagocitose 
Electroforese de proteínas plasmáticas
 Inflamação

Anomalias nas Igs 
Crioglobulinas (I, II e III) 
 
Hipergamaglobulinemia