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EXAME ANDROLÓGICO •Finalidade: ➢ avaliar aptidão reprodutiva de um macho ➢ avaliar fertilidade de um reprodutor – um animal para ser usado na reprodução deve ter um sêmen bom e com boa fertilidade – se tiver alguma patologia – naquele momento ele não vai servir para ser um reprodutor. O exame andrológico deve ser feito sempre antes de começar um trabalho de reprodução e todo ano/ antes de iniciar a estação de monta. •Baseado – este exame vai ser baseado em vários aspectos, vai ser feito um exame clinico deste animal. ➢ saúde geral, saúde hereditária – ver se possui patologias congênitas. ➢ saúde genital e potencial de fertilidade – comportamento sexual, libido frente a fêmea e coleta de sêmen para completar o exame. Indicações: •seleção e comercialização de reprodutores •avaliação do potencial reprodutivo na pré-estação de monta •diagnóstico de sub ou infertilidade •avaliação para preservação sêmen in vitro Introdução: •O exame andrológico reflete as atuais condições reprodutivas do macho; •Observação das condições semiológicas, sanidade (vacina, vermífugo), alterações genéticas, saúde geral, deficiências na cópula (alterações locomotoras ou do sistema genital) e problemas espermáticos. •Laudo nunca é definitivo, validade de 60 dias – que é o tempo de uma espermatogênese. Etapas do Exame: 1.Identificação do animal 2.Histórico e anamnese 3.Exame clínico geral 4.Exame clínico específico 5.Comportamento sexual 6.Espermograma – vamos avaliar: •características físicas – motilidade e vigor (só diz que os espermatozóides estão vivos e mexendo – não diz tudo sobre eles) •características morfológicas – integridade de membrana plasmática – capacidade de fertilização 1. Identificação do animal: •Proprietário •Nome •Raça •Idade •Número de registro •Procedência do animal 2. Histórico e anamnese: •saúde do indivíduo e do rebanho •sistema de monta ou como doador de sêmen •número de fêmeas cobertas / reprodutor •fertilidade a campo •condições ambientais – animal fica solto, fechado •alimentação •ascendência e descendência – filhos, pais •número de fêmeas gestantes / reprodutor •procedência do animal 3. Exame clínico geral: •FC e FR, TºC •Exame do sistema digestório •Exame do sistema locomotor - aprumos e lesões de membros prejudicam a cópula •Condições corporais – o animal não pode estar muito obeso e nem magro, fatores primordiais tanto para copula quanto para o sêmen •Defeitos congênitos 4. Exame clínico específico: •Cordão espermático – ver espessura •Escroto : forma (caprinos é bipartido) – observar se há: ➢ lesões ou cicatrizes ➢ ectoparasitos •Testículos: simetria, forma, mobilidade dentro da bolsa, consistência e posição •Biometria testicular: fita ou paquímetro – medida dos testículos. A medição é feita em cada animal: eqüinos:largura e comprimento touros:circunferência - a diferença da medida : europeu + 30 meses: >35cm – mais baixo e mais largo zebuínos + 30 meses: >30cm – mais comprido e mais fino •Epidídimos: palpar e passar o us ➢ cabeça ➢ corpo ➢ cauda Avaliando a simetria, delineamento, consistência •Prepúcio: tamanho, forma, se há secreções, integridade do óstio •Pênis: avalia em repouso e em excitação – para ver se não há lesão •Glândulas anexas: volume e sensibilidade, secreções – palpação ou ultrassom transretal Avaliação ultrassonográfica – avalia: •Funículos espermáticos: (Varicocele) – dilatação de alguns vasos do funículo que pode prejudicar a termorregulação. •Testículos: (Tumores, hidrocele, hematomas) •Epidídimos – se não tem obstrução, inflamação •Glândulas anexas: ➢ Transretal (Grandes animais) ➢ Transabdominal (Pequenos animais) Funículos espermáticos - varicocele TESTÍCULOS - tumor EPIDÍDIMOS – ver se tem obstrução, deformação - epididimite URETRA – fistula na uretra GLÂNDULAS ANEXAS – inflamada e com liquido – presença de pontos ecogênicos – sugestiva de vesiculite 5. Comportamento sexual: dar nota neste comportamento – tempo que vai demorar. •Cortejo •Ereção •Protrusão do pênis •Procura •Introdução •Ejaculação •Período refratário •colocar 2 ou mais vacas em estro com cada touro •anotar todas as manifestações do macho num período de 10min •escores de 0 a 10 •Freqüência ótima de serviço (ótimo comportamento sexual) depende: -condições físicas do reprodutor: nem debilitado, nem obeso -qualidade seminal e reserva de sptz depende da produção e eliminação diária de sptz. Machos com boa qualidade de sêmen podem e devem ser usados maciçamente – se o animal estiver parado, coletar duas a três vezes antes de examinar o sêmen para não obter falso resultado – vai ter mais sptz morto -manejo reprodutivo – soltar, tomar sol, fazer exercício, alimentação balanceada -comprimento da estação de monta: ↓libido, mas não n°sptz -comportamento individual – cada um tem sua característica individual -espaço disponível – ter um espaço adequado -estímulos sexuais presentes – ter uma fêmea em cio próximo do animal 6. Espermograma: analises em laboratório •Avaliação do reprodutor •Colheita do sêmen •Análise do sêmen - Ordem de avaliação do sêmen: 1.Características físicas 2.Características morfológicas Avaliação do Reprodutor •Qualificação Zootécnica – avaliar primeiramente se este animal tem genética para ser um reprodutor. •Sanidade geral •Sanidade reprodutiva •Sanidade genética Métodos de colheita de sêmen – cada espécie se coleta com um método diferente a) massagem das ampolas dos ductos deferentes e glândulas vesiculares: sêmen não sai com boa qualidade – essa técnica é utilizada somente em touros/ bovinos, mas também não é uma melhor técnica. A melhor seria com a vagina artificial – vai se excitar mais e ejacular mais. Mas tem alguns animais mais bravos não permitem essa opção, então depende do temperamento do animal. b) coleta manual: Usado em suíno e cão, pode ser feito com presença de fêmea ou manequim, cuidado com choque térmico (tubo com água morna a 37 graus, proteger da luz solar). c) eletroejaculação: ruminantes mais bravos que não da pra coletar com a vagina artificial e silvestres -indução artificial do reflexo de ereção e ejaculação -centros controlares da ereção e ejaculação – região sacral da medula -sêmen geralmente é mais diluído – pois o animal não ta se excitando -não necessita de condicionamento d) vagina artificial: ruminantes mansos e eqüinos – melhor método de colheita, mais se assemelha com a monta -sêmen de melhor qualidade -presença de fêmea ou manequim -pouca variação das condições naturais -permite controle de choques térmicos -permite controle de contaminação – lavar o pênis do animal para obter um sêmen mais limpo Manequins: •Bovino: bem almofadada •Suíno: piso anti-derrapante •Eqüinos: égua bem contida e com bandagem na cauda •Ovinos: manequim com vagina artificial acoplada. VAGINA ARTIFICIAL - Geralmente é um tubo proporcional ao diâmetro do pênis, com mucosa de borracha e valvula que enchemos de água quente para deixar aquecida, na outra ponta vai um copo coletor onde o sêmen irá cair. MONTAGEM DA VAGINA ARTIFICIAL PREPARAÇÃO DO LABORATÓRIO – antes de colher o sêmen para que não haja choque térmico. Tudo que vamos utilizar para manipular este sêmen deve estar aquecido. Se causar choque térmico provoca diversas patologias de cauda. O diluente devemos deixar no banho maria a 37 graus antes de utilizar. LAVAGEM DO PÊNIS – essencial em qualquer espécie, para limpar as sujidades que é rica em espécies reativas ao oxigênio, que alem de contaminar o útero da fêmea, atrapalha a refrigeração e congelamento do sêmen. COLHEITA DO SÊMEN – fêmea próxima no cio para excitar o macho. Para coleta de sêmen de melhor qualidade. MANIPULAÇÃO NO LABORATÓRIO– depois da coleta do sêmen, filtrar o sêmen no béquer, medir volume na proveta – anotar, olhar aspecto, tirar amostras para fazer concentração e patologia. DILUIÇÃO DO SÊMEN – senão o plasma seminal começa matar os sptz. Pegar o diluente especifico para a espécie, ele é feito para proteger o sêmen durante uma hora para dar tempo de avaliar. Após dar um destino para o sêmen – refrigerar, congelar etc. Diluente sempre na proporção de 1:1. Cuidado com o choque térmico na diluição. Cuidado também com o choque osmótico que também causa patologias de cauda, pois o sêmen tem uma osmolaridade diferente do diluente, por este motivo deve adicioná-lo ao sêmen aos poucos e homogeinizando – para haver o equilíbrio da osmolaridade. Depois de misturar com o diluente não tem perigo de choque térmico. ANÁLISE FÍSICA •Aspecto – cor, cheiro, presença de sangue, urina •Volume – medir na proveta e anotar •Motilidade – montar uma lamina para ver motilidade e vigor do sêmen com diluente na obj 10x aumento de 100x •Concentração – quantos sptz por ml •Vigor ASPECTO E VOLUME Características físicas: a) Volume: varia inter e intra-espécie – e mesmo dentro da mesma espécie tem animais que podem ejacular mais ou menos , ou até mesmo o animal dependendo da sua excitação. Aumento de volume: ➢ fêmea em estro – para excitar o animal ➢ eletroejaculação – como método de coleta, estimula produzir mais liquido seminal ➢ contaminação c/ água ou urina – são espermicidas Diminuição de volume: ➢ animais jovens ➢ uso excessivo – coletas todos os dias, mais de uma vez ao dia o animal pode entrar em exaustão ➢ vesiculite - inflamação Media de volume das espécies: Touro (5 a 7 ml); Garanhão ( 30 a 100 ml); Varrão (200 a 300ml) , carneiro e bode (0,5 a 1,5ml), cão 2 a 8 ml) b) Turbilhonamento: característica que só é vista em ruminantes pelo volume do sêmen – como não vem quase liquido seminal, o sêmen é grosso com muito sptz. ➢ formação de ondas em uma gota de sêmen – pois há muito sptz aglomerado com motilidade e vigor. ➢ relaciona-se c/ concentração, motilidade e vigor. Portanto, quanto melhor estiver o sêmen – mais motilidade, vigor e concentração, maior a formação das ondas. ➢ escala de 0 –5 (ideal > 3) ➢ análise em M.O. em 100x ➢ não é desclassificatório – não indica que tudo esta bom ➢ utilizados somente em ruminantes c) Motilidade (total e progressiva): ➢ % de sptz móveis – vivos – sptz moveis ➢ uma gota de sêmen em aumento de 100 a 400x – ver porcentagem vivo e os parados. Avaliar sptz em motilidade total ou progressiva – ideal que esteja com um sentido de movimento - progressivo, e não movimentos circulares (sinal de choque osmótico ou térmico) ➢ para doação de sêmen: >70% motilidade ➢ para sêmen congelado: >50% motilidade d) Vigor: ➢ vitalidade do movimento do sptz – relacionado com a produção de energia pelas mitocôndrias que ficam na peça intermediária. ➢ escala de 0 –5 (ideal >3) e) Concentração espermática: 10/02/2020 ➢ varia com fatores intrínsecos e extrínsecos ➢ (ex.: método de coleta) ➢ espectofotômetro, contador eletrônico (Sperm Counter) ou câmara de Neubauer ➢ [ ] normal média de sptz/ml ➢ Bovinos (1 bilhão); Suínos (100 milhões) ➢ Eqüinos (120 milhões); Cão (300 milhões) ➢ Carneiro e bode (3 bilhões) - A concentração espermática em qualquer espécie vamos calcular com a câmera de neubauer ou contador automático. O resultado é em milhões de espermatozóides por ml. - Portanto, primeiramente vamos ver o volume do ejaculado, motilidade vemos pelo olho – vamos fazer a contagem na câmera de neubauer. - A câmera de neubauer é uma câmera com duas câmeras que contem 25 quadrados. Quando chegamos no laboratório com um sêmen fresco, pega- se uma gota, pré dilui no ependorff com água destilada para matar os espermatozóides para que seja possível ser feita a contagem (1:100; 1:200; 1:20). Em cima desta pré diluição aguardar alguns minutos para matar os espermatozóides. Com a amostra preencher as duas câmeras de neubauer. Estes espermatozóides vão decantar no fundo da câmera. - Vamos contar 5 quadrados da câmera – e a somatória destes 5 quadrados vão nos dar um numero e este valor jogamos na formula e chegamos na concentração ( numero em milhões – de sptz em ml). - A motilidade é a quantidade de espermatozóides que estamos vendo vivos – moveis – se formos contar – é aquele sptz que colocamos no diluente para mante-los vivos por mais tempo. Vamos avaliar na lamina a porcentagem de vivos e a porcentagem de mortos (objetiva de 10 a 40x). Para o semen estar com características consideradas boas devem estar com motilidade acima de 70%. E com menos de 30% de mortos. Se for um sêmen congelado consequentemente ele vai cair de qualidade – neste caso para ser considerado apto para ser utilizado é acima de 50% de motilidade. - É mais fácil contar a porcentagem de sptz que estão parados do que os que estão se movimentando. - A motilidade é dividida em dois tipos – dentro da motilidade total que anotamos é importante saber o que é motilidade total e progressiva. A total é tudo que esta mexendo que nós vamos anotar, mas a progressiva é os sptz que estão se movimentando e eles tem uma direção. Alguns espermatozóides que sofreram choque osmótico ou de temperatura, ou possui alguma patologia de cauda começam a ter movimentos circulares. Portanto, o ideal é que tenha um espermatozoide com um grande potencial de motilidade progressiva – chance maior de fertilizar. - Depois vamos avaliar o vigor: que é a vitalidade, a potencia do movimento dos sptz – portanto quanto mais rápido – movimento mais forte com mais vitalidade maior o vigor. O vigor será avaliado de 0 -5 sendo que ele tem que ter de 3 para cima normalmente. - O vigor mostra como ta a produção de energia – como estão as mitocôndrias – sabendo que a peça dos sptz são totalmente formadas com mitocôndrias – então quanto tiver melhor a ação dessas mitocôndrias (função mitocondrial dos espermatozóides) – quanto melhor esta função mitocondrial , melhor é o vigor dos sptz. Os sptz quanto mais rápido / mais potente o movimento – mais energia ele tem. Ele vai ter uma viabilidade mais longa, o sptz vai durar mais tempo. CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA FORMULA: CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA – esta contagem da concentração é feita na câmera de neubauer que é um aparelho mais barato e é mais confiável porque contamos no olho. A concentração vai variar por métodos intrínsecos e extinsecos, depende o método da coleta – se usar a vagina artificial vai ter um sêmen com mais espermatozóides e menos liquido seminal – método estimula mais naturalmente. Se coletar com o eletroejaculador o animal vai ter mais liquido seminal e concentração mais baixa de espermatozóides. Temos hoje no mercado alguns contadores automáticos, mas dependendo do contador ele descalibra fácil. E tem outros melhores porém o preço é inviável. - Os espectrofotômetros hoje em dia quase não vemos sendo utilizado. Ele é o primeiro contador automático, porém, é muito desregulado. CAMERA DE NEUBAUER – é uma câmera de vidro que tem duas câmeras no centro dela, e cada câmera tem 25 quadradinhos. Colocamos uma lamínula em cima das duas câmeras e preenchemos ela com uma paleta ou uma pipeta com uma solução onde colocamos uma gota de espermatozoide para matar estes sendo possível a sua contagem. Quando preenchemos a câmera os espermatozóides vão assentar, e o próximo passo é fazer a sua contagem. Como é feita a contagem? Cada câmera tem 25 quadrados, destes devemos contar 5 quadrados. Depois de contado uma câmera, devemos repetir isto com a outra câmera. E vamos tirar uma média da contagem dos 5 quadradinhos, somar as duas médias e dividir por 2. A diferença de uma câmera para outra não pode exceder 10% - se der, temos que contar novamente. Existem duas formas decontar os 5 quadrados nesta câmera para termos um resultado confiável no final – podemos contar ela em diagonal ou uma em cada ponta e uma no meio. CALCULO: Nas espécies que tem o sêmen mais diluído – cão, eqüino e suíno – podemos diluir menos para contar. Vamos utilizar neste caso a diluição de 1:20 (ou seja, colocar 19 gotas de água para 1 gota de sêmen no tubo eppendorf) – é a única diluição que não precisa fazer conta, o resultado sai na hora, a soma dos quadrados da câmera é a concentração. Vejamos o exemplo: EX: 1:20 = 100 espermatozoídes = [] 100 milhões de sptz por ml (100x 106 ml). Para os ruminantes não consegue diluição 1:20 porque o sêmen é muito concentrado e não conseguimos contar. Bovino – diluição 1:100 (90 de água para 10 de sêmen). Foi feita uma diluição de 5x mais , portanto, vai pegar o resultado contado na câmera e multiplicar por 5. Ex: 200x5 = 1 milhão de sptz (toda vez que diluir 1:100 multiplicar por 5). Pequenos ruminantes (caprinos ou ovinos) – diluição 1:200 ( 190 de água para 10 de sêmen). Foi feita uma diluição de 10x mais, portanto, pegar o resultado que der na câmera e multiplicar por 10. Ex: 300 x10 = 3000x106 sptz/ml. Outras recomendações: - Focar a câmera primeiramente na obj de 10x – só que para contar fica muito longe. Então mudamos para a obj de 40x . Cada quadrado dos que temos que contar 5 – dos 25 que tem na câmera – ele tem 3 linhas em cada borda, que é o limite dele. Cada 1 quadradinho é subdividido com 16 quadradinhos. - Na contagem de sptz só se conta a cabeça (não importa para que lado esta a cauda). - Os sptz que estão com a cabeça nas 3 linhas das extremidades não podemos contar os 4 lados, somente devemos contar as cabeças presentes nas linhas de 2 laterais (lado esquerdo e inferior ou lado direito e superior). - Contar o valor das duas câmeras – somar e dividir por dois, e sempre fazer arredondamento para menos. Quando pensamos em sêmen, quanto mais sobrando melhor. Nunca superestimar. ANÁLISE COMPUTADORIZADA (SISTEMA CASA) – algumas faculdades estaduais e federais. Em suma... vamos calcular quantos espermatozóides tem por ejaculado, quantos moveis (vivos), calcular dose inseminante se for sêmen fresco, se for refrigerar ver quantas doses é possível enviar, se for congelar o sêmen fazer a dose para ver quantas paletas é possível congelar. CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS - Depois de fazer todos os cálculos vamos fazer a análise morfológica dos espermatozóides. Isto deve ser feito com calma e tempo. ANÁLISE MORFOLÓGICA: tem vários tipos de lâminas que podemos fazer. Técnicas de Preparação úmida – mais detalhes, principalmente na cabeça. •Contraste de Fase – luz especial – eppendorf com solução salina. DIC (Microscopia de Contraste de Interferência Diferencial) Esfregaço Corado: mais utilizado – obj 100x com óleo de imersão •Eosina-Nigrosina •Tripan Blue / Giemsa •Willian’s, Panótico, Karras modificado, Ceroviski MORFOLOGIA ESPERMÁTICA - Para avaliar a morfologia espermática devemos saber os defeitos. Então a patologia pode ter 3 origens: Patologias de origem primária: de origem testicular na espermatogênese. Patologias de origem secundária: não é na origem, é depois que saiu dos testículos. Animais com epididimite, vesiculite, ou seja, patologias que são no transito espermático até ocorrer a ejaculação. Podendo ser no epidídimo, na ampola, ducto deferente, na uretra, nas glândulas acessórias. Patologias de origem terciária: a pessoa que faz o exame que causou (choque térmico/ choque osmótico/ deixou cair água, luz solar). - Independente da onde estas patologias foram geradas, elas são classificadas em 2 tipos (que significam impacto na fertilidade): Defeitos maiores: defeitos que vão impedir o espermatozoide de fertilizar – impossibilita de chegar no oviduto e fertilizar/ pode até chegar no oviduto mas não vai fertilizar o ovulo. Defeitos menores: são menos graves que não interferem na fertilidade. Como uma cauda enrolada, dobrada. Defeitos maiores: •relacionados com patologias do testículo e epidídimo •interferem com a fertilidade -defeitos do acrossoma (descolamento, Knobbed,etc) -GCP (gota citoplasmática proximal -subdesenvolvido e cabeça pequena anormal -piriforme e estreito na base -contorno irregular -formas teratológicas -pounch formation (formação de vesículas) -defeitos de peça intermediária -cauda fortemente dobrada -cauda enrolada na cabeça Defeitos menores: •não comprometem tanto a fertilidade -GCD (gota citoplasmática distal) -cabeça delgada e pequena normal -cabeça isolada normal -peça intermediária -peça intermediária retroaxial, abaxial e oblíqua -cauda dobrada ou enrolada -cabeças gigantes, curtas e largas DEFEITOS ESPERMÁTICOS - Contar de 100-200 sptz , se ele tiver mais de uma, podemos anotar somente uma, sendo ela a mais grave. Tem que contar os sptz que conseguimos enxergar ele por inteiro, e ele deve estar inteiro. - Depois que fizer todas as analises das patologias vamos somar os defeitos. Limites de sptz patológicos por espécie DISTÚRBIOS REPRODUTIVOS X PARÂMETROS ESPERMÁTICOS ANÁLISES DA INTEGRIDADE ESPERMÁTICA ➢ Teste Hiposmótico (HOS) ou Osmótico (H0) ➢ Colorações supra vital (Corantes supra vitais) ➢ Eosina Negrosina ➢ Tripan Blue ➢ Sondas fluorescentes ➢ (Diversos tipos de análises da funções e integridade SPTZ)