REAÇÕES SOROLÓGICAS II - REAGENTES MARCADOS

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Prof. MSc. Adriano Moraes da Silva
Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos 
	Nesta classe da Imunologia realiza-se reações de alta sensibilidade onde se consegue detectar Ag ou Ac mesmo em pequenas concentrações.
Reações com Ragentes Marcados
Prof. MSc. Adriano Moraes da Silva
Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos
Princípio: marcar o Ag ou Ac com reagente de fluorescência para evidenciar o fator pesquisado.
Ex: Ac marcado com fluoresceína, exposto a luz ultravioleta e evidenciando o Ag que assume cor verde-maçã na microscopia de fluorescência.
Reações de Imuno Fluorescência (RIF)
Prof. MSc. Adriano Moraes da Silva
Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos
	Vantagem: não necessita de cultura e é mais rápido.
	Ex: suspeita de uretrite por Chlamydia trachomatis.
	Numa lâmina: secreção uretral + conjugado (Ac marcado com fluoresceína)
	Incubar 37ºC/15-30 minutos.
	Lavar em solução tampão.
	Leitura em MIF (Microscópio de Imuno Fluorescência)
	Resultado no campo microscópico:
	-        Pontos com cololoração verde-maçã: positivo
	-          Campo escuro: negativo
RIF Direta: pesquisa de Ag
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Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos
	Numa lâmina: secreção glandular + conjugado (Ac anti S. pyogenes marcado com fluoresceína).
	Incubar 37ºC/15-30 minutos.
	Lavar em solução tampão.
	Fazer leitura em MIF.
	Resultado no campo microscópico:
	- Streptococcus pyogenes em verde-maçã: positivo
	-  Campo escuro: negativo
Ex: suspeita de amigdalite por Streptococcus pyogenes.
Prof. MSc. Adriano Moraes da Silva
Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos
	Vantagens da técnica indireta: detectar classes de Ac usando conjugados anti IgG ou anti IgM.
	Princípio: usar um anti Ac humano marcado com fluoresceína.
	Ex: pesquisa de Treponema pallidum causador da sífilis.
	Lâmina impregnada com a bactéria T. pallidum. 
	Acrescentar soro do paciente (Ac anti T. pallidum ?).
	Incubar por 15-30 minutos/37ºC e lavar (solução tampão).
	Acrescentar o conjugado anti Ac humano + fluoresceína.
	Incubar por 15-30 minutos/37ºC e lavar.
	Fazer leitura em MIF.
	Visualizar as espiroquetas em verde-maçã. 
RIF Indireta: pesquisa de Ac
Princípio: uso de enzimas para marcar Ac e evidenciar o fator pesquisado pela obtenção de cor resultante da reação: enzima – substrato cromógeno.
	Enzimas: As enzimas marcadoras mais utilizadas são a catalase, glucose-oxidase, galactosidase, fosfatase alcalina e a peroxidase.
	Conjugado: Ac marcado com enzima.
	Conjugado + substrato = cor
	Leitura em espectrofotômetro especial (leitora de ELISA)
	A intensidade da cor é proporcional a concentração do que está sendo medido.
	A reação imonoenzimática pode ser de técnica direta ou indireta. 
Reação Imunoenzimática
Vantagens:
- maior estabilidade dos reagentes;
- maior especificidade, devido ao uso de antígenos marcados com enzima;
- produzem, de modo geral, ensaios homogêneos;
- ausência do perigo de radiações.
	Métodos: Simples e Competitivo
	Material utilizado na técnica indireta:
-          soro do paciente
-          placas de ELISA (polietileno ou polipropileno)
-          conjugado (Anti Ig Humana – Anti Ac marcado com enzima)
-          substrato cromógeno
ELISA – Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
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Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos
	 Exemplo 1: HIV
	Escolher a placa com o Ag específico (seqüência conhecida de fragmentos do vírus) e adicionar o soro do paciente. 
	Incubar em temperatura ambiente por 1 hora.
	 Lavar com solução tampão.
	Adicionar o conjugado (anti Ac humano marcado com enzima) e incubar por mais 1 hora. 
Técnica Indireta 
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Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos
	Lavar com solução tampão.
	Adicionar o cromógeno – revelador (substrato) e incubar por 2 horas.
	Aguardar a presença ou não de cor. 
	Levar a placa à uma leitora de ELISA. 
	Obter os resultados.
	OBS 1: para a sorologia de HIV deve colher sangue do paciente em jejum de 12 horas.
	OBS 2: para a sorologia de HIV deve-se inativar o soro do paciente antes do exame. Incubar à 56ºC por 30 minutos. Este processo elimina possíveis interferentes como macromoléculas e proteínas do sistema Complemento.
	Escolher a placa com o Ag específico (Antígeno de Superfície do vírus - HBsAg) e adicionar o soro do paciente. 
	Incubar em temperatura ambiente por 1 hora.
	Lavar com solução tampão.
	Adicionar o conjugado (anti Ac humano marcado com enzima) e incubar por mais 1 hora. 
	Lavar com solução tampão.
	Adicionar o cromógeno – revelador (substrato) e incubar por 2 horas.
	Aguardar a presença ou não de cor. 
	Levar a placa à uma leitora de ELISA. 
	Obter os resultados. 
Exemplo 2: Anti HBs (Hepatite B)
	Material utilizado na técnica direta:
	-  soro do paciente
	-  placas de ELISA (polietileno ou polipropileno)
	-  conjugado (Ac Anti Ag marcado com enzima)
	-  substrato cromógeno
	Exemplo 1: HBsAg (Hepatite B)
 
	Escolher a placa com o AC específico (Ac Anti Ag de Superfície do vírus – Anti HBs) e adicionar o soro do paciente. 
	Incubar em temperatura ambiente por 1 hora.
	Lavar com solução tampão.
	Adicionar o conjugado (AC Anti HbsAg marcado com enzima) e incubar por mais 1 hora. 
Técnica Direta 
	Lavar com solução tampão.
	Adicionar o cromógeno – revelador (substrato) e incubar por 2 horas.
	Aguardar a presença ou não de cor. 
	Levar a placa à uma leitora de ELISA. 
	Obter os resultados.
Prof. MSc. Adriano Moraes da Silva
Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos
	Pesquisa de Ag teciduais e células.
	Princípio: utilizar um conjugado formado por Ac anti Ag marcado com a enzima peroxidase.
Reação de Imunoperoxidase 
Prof. MSc. Adriano Moraes da Silva
Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos
	Fazer um imprint com o material biológico numa lâmina de vidro. Acrescentar o conjugado, incubar (30 minutos a 1 hora) e lavar com solução tampão.
	Acrescentar o substrato, incubar (30 minutos a 1 hora) e lavar.
	Levar ao microscópio e observar a presença ou não do Ag.
	OBS: técnica semelhante a imunofluorescência.
Técnica de Imprint
Prof. MSc. Adriano Moraes da Silva
Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos
	Princípio: utilizar Ag ou Ac marcado com substância radioativa.
	I ¹³¹ = iodo
	Radiofármacos 
	Obs.: Insalubridade
Radioimunoensaio 
(competitivo)
Prof. MSc. Adriano Moraes da Silva
Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos
	Preparar um suporte contido de Ac específicos (PRIME).
	Adicionar simultaneamente Ag marcados com iodo e a amostra biológica do paciente.
	Aguardar que ocorra a competição dos Ags marcados com os Ags do paciente pelo sítio de ligação dos Acs.
	Fazer medição da radioatividade com um cintilador específico.
	Quanto maior a quantidade de Ag paciente, menor a radioatividade.
Técnica direta (Ag?)
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Imunologia Clínica
Unip – São José dos Campos