Quantificação de Microrganismos - BIOTECIND

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INSTITUTO FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO - IFES 
TÉCNICO EM QUÍMICA – TQVV3N 
 
 
 
 
 
 
 
ALINE BEATRIZ PIMENTEL DOELINGER OLIVEIRA 
ANA PAULA SIMMER 
CACIA FREITAS 
FABRÍCIO ROCHA 
FERNANDA PISSARRA 
FRANCINE GUIMARÃES SALLA 
 
 
 
 
 
 
 
 
Prática n° 2 (22/03/2018): 
QUANTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS 
 
 
 
 
 
 
 
Disciplina: Biotecnologia Industrial 
Professor: Robison P. Garcia Jr. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VILA VELHA 
MARÇO- 2018 
 
Objetivos 
 
Conhecer e aplicar quatro técnicas de quantificação de microrganismos e determinar a 
concentração de células de levedura em uma suspensão a partir destas. 
 
Introdução 
 
O método de quantificação microbiana é muito importante para o controle do número 
de microrganismos em determinados processos, principalmente onde as 
concentrações de certas células podem interferir positiva ou negativamente no 
processo. A exemplo, a concentração da levedura ​Saccharomyces cerevisiae 
influencia diretamente no processo de produção de cerveja ou de pães. Além da 
quantificação de microrganismos da água ou de alimentos, para avaliar se estão 
dentro dos padrões estabelecidos, pois contaminações microbiológicas podem ocorrer 
em todas as etapas pelas quais passam os produtos. 
De acordo com a Portaria do Ministério da Saúde, MS N° 2,914/2011, deve haver o 
monitoramento de bactérias heterotróficas, para a verificação da integridade de um 
sistema de distribuição, pois densidades de bactérias heterotróficas acima de 500 
UFC/mL (unidade formadora de colônias) podem provocar interferência na detecção 
de coliformes, por inibição de crescimento. Devido a isso, a contagem de bactérias 
heterotróficas presta-se, de alguma forma, como controle de qualidade dos resultados 
de coliformes. Há também limites de aceitabilidade de microrganismos para produtos 
de higiene pessoal, a Resolução RDC n° 481/99 determina que para produtos de uso 
infantil, na área dos olhos ou produtos que entram em contato com mucosas, a 
contagem de microrganismos mesófilos (​desenvolvem-se melhor em condições de 
temperatura moderada​) ​aeróbios totais não podem exceder de 10² UFC/g ou mL, com 
o objetivo de manter uma boa qualidade do produto, evitando assim a deterioração ou 
mudanças químicas neste tipo de produtos. 
Existem diferentes técnicas de contagem de microrganismos. A quantificação pode ser 
direta, ou seja, contando-se microscopicamente o número de células presentes num 
determinado material ou superfície, ou indireta, onde é possível efetuar análise da 
turbidez com um espectrofotômetro,ou através da determinação do peso seco, dentre 
outras. 
O processo da análise da turbidez consiste no auxílio de um instrumento capaz de 
medir a quantidade de luz absorvida ou transmitida ao atravessar uma amostra 
contida em uma cubeta, a luz transmitida é inversamente proporcional a concentração 
de células, pois quanto maior a concentração de células, menor será a quantidade de 
luz que será transmitida, e consequentemente, maior será a absorbância. Na 
determinação do peso seco, o processo consiste em centrifugar uma determinada 
quantidade de uma amostra da suspensão microbiana, desprezando o sobrenadante e 
o sedimento é colocado em um recipiente apropriado, por fim, esse conjunto é secado 
na estufa até peso constante. 
Outros processos também utilizados consistem na medida de componentes celulares, 
que podem fornecer uma avaliação da massa microbiana, ou pela medida de 
compostos resultantes da atividade metabólica, onde há uma relação entre a massa 
de material seco que aumenta e a quantidade de nutrientes disponíveis no meio de 
cultura que diminui. Esses nutrientes são utilizados como parâmetros para estimar a 
massa microbiana. 
Há um teste simples e eficaz para a quantificação de um volume aproximado de 
quantidade de biomassa, a técnica de volume de material celular após centrifugação 
consiste na centrifugação de uma suspensão celular em tubo de centrífuga graduado. 
A centrifugação deve acontecer de modo que promova a sedimentação dos 
microrganismos sem provocar a lise celular ou ruptura, o volume de células é obtido 
por leitura na escala existente do tubo. 
É necessário se atentar ao fato de que algumas dessas técnicas exigem algumas 
precauções, como a necessidade de diluição para diminuição do número de 
microrganismos da amostra, para viabilizar a quantificação de uma determinada 
população de micróbios. 
 
 
Materiais e Reagentes: 
 
● Microscópio 
● Estufa a 100 – 120°C 
● Espectrofotômetro 
● Balança analítica 
● Centrífuga 
● Câmara de Neubauer 
● Tubo para centrífuga 
● Pipetas volumétricas 2,3,5 e 10mL 
● Pipeta Pasteur 
● Balão volumétrico 100,250 e 500mL 
● Vidro de relógio 
● Béquer 
● Fermento biológico 
● Água destilada 
 
 
Procedimento Experimental: 
 
● Preparo da suspensão de células 
A suspensão de células já havia sido preparada, contendo cerca de 5g de 
fermento biológico dissolvido em água destilada e diluído em um balão 
volumétrico de 500mL. 
 
● Determinação do peso seco de células (%m/v) 
Após a homogeneização da suspensão já preparada foi retirada uma 
alíquota de 10mL e adicionada a um vidro de relógio com peso já conhecido, 
pesados em uma balança analítica e em seguida levados para secar em 
estufa entre 100 e 120°C. A amostra foi retirada da estufa no dia seguinte 
(22/03) por volta das 18:30 e pesada novamente. 
 
● Turbidimetria 
Foram feitas 4 diluições a partir das suspensão de células sendo três no 
balão volumétrico de 250 mL com as seguintes quantidades, 2, 3 e 5 mL, e 
uma alíquota de 1,5 mL em um balão volumétrico de 100 mL. 
Em seguida, no comprimento de onda de 570nm, foi realizado a leitura da 
absorbância das soluções diluídas no espectrofotômetro, usando a água 
destilada como branco. 
 
● Contagem de células em câmara de NEUBAUER 
Em uma alíquota de 1 mL de suspensão de células foi diluída em balão 
volumétrico de 50 mL. Posteriormente, foram gotejadas em uma câmara de 
NEUBAUER e coberta com a lamínula, levada ao microscópio e com auxílio 
de um monitor realizou-se a contagem de 5 dos 25 quadrados da câmara. 
 
● Determinação do volume do centrifugado (%v/v) 
Em um tubo de centrífuga graduado adicionou-se 10 mL de suspensão de 
células, logo após levado para a centrífuga durante 15 minutos. 
 
Resultados e Discussão 
 
Determinação do peso seco da célula 
 
Peso seco: 13,4770g 
Peso após a adição de 10 mL solução: 23,2364g 
Peso final após secagem em estufa: 13.5593g 
 
 
Ms: 13,5593g-13,4770g = 0,0823 g 
C: Ms/V Logo 
C= 0,0823g/10mL = 0,008230 g/mL de fermento 
No entanto em 100mL temos: 
Ms= V.C Logo 
Ms= 100mL.0,008230g/mL = 0,8230 g de Fermento 
 
O método de determinação do peso seco da célula, foi capaz de fornecer a massa de 
levedura da amostra. Através do aquecimento em estufa houve perda do solvente e 
consequentemente muitos componentes antes solúveis decantam junto com o 
fermento. Por ser um método gravimétrico, apresenta um baixo custo, é preciso e 
moderadamente rápido. Entretanto deve-se considerar algumas limitações que podem 
prejudicar o resultado final, como o fato de que a quantificação das células nesse 
método é total, ou seja, estão presentes na massa pesada células e vivas e mortas, o 
que não é útil para processos. Partículas que estavam dissolvidas em soluçãoque não 
eram células também influem no massa final, logo a massa seca não apresentou uma 
pureza tão confiável, o que pode ser minimizado através da lavagem do precipitado. 
 
 
Contagem de células em câmara de NEUBAUER 
 
Dados: 
 
1 quadrante 21 células 
2 quadrante 19 células 
3 quadrante 19 células 
4 quadrante 28 células 
5 quadrante 23 células 
 
Células contadas = ∑5 quadrados 
Células contadas = 110 células 
Total de células = (∑5 quadrados) x (5 x 10​4​) x diluição 
Total de células = 110 x 5 x 10​4​ x 50 
Total de células = 2,75 X 10​9​ células/mL 
 
Como a câmara de NEUBAUER possui 25 campos ​é preciso multiplicar este valor por 
5 para achar o total de células no volume da câmara. O volume colocado na câmara é 
inferior a 1mL, logo é necessário multiplicar o valor encontrado por 10​4 para 
expressarmos o resultado em células/mL. Entretanto este valor ainda não corresponde 
ao da suspensão original, podemos obter isso multiplicando pelo fator de diluição, que 
conforme o procedimento é de 50x. Assim encontraremos o total de células na 
suspensão que é de 2,75 x 10​9​ células/mL. 
 
 
Figura 1 - Foto obtida no microscópio utilizando a técnica da câmara de Neubauer 
 
A técnica que foi desenvolvida originalmente para determinar concentração de células 
sanguíneas, hoje abrange várias áreas incluindo a microbiologia. Essa técnica é muito 
sensível, através dela é possível quantificar valores extremamente pequenos de 
células/mL, dependendo do tamanho dessas células. Tratando-se de volumes tão 
pequenos, qualquer erro de contagem é significativo para o valor final. 
Em comparação a outras técnicas é um processo com grande vantagem de se ter a 
possibilidade de diferenciar células viáveis das não viáveis, com o auxílio de um 
simples corante que células vivas são capazes de oxidar mudando a sua cor. O seu 
erro na maior parte das vezes está relacionado ao analista na falta de prática de 
contagem. 
 
Determinação do Volume Centrifugado 
 
Dados: 
 
V​Solução​: 10mL 
V​Centrifugado​: 0,4mL 
V​Retirado​: 9,6mL 
C= (V​Centrifugado​/ V​Solução​) X 100 
C= (0,4mL/10mL) X 100 
C= 4,0mL de células/100 mL de suspensão ou 4% de células v/v. 
 
Como utilizou-se 10mL da solução e no tubo graduado o precipitado foi de 
aproximadamente 0,4mL, a concentração é obtida através de uma regra de três 
simples e podendo ser expressada através da porcentagem do volume em 100mL de 
suspensão. Esse método é bem rápido e prático, apresenta um baixo justo, seus 
resultados não são tão precisos, pois alguns erros de medição volumétrica não foram 
eliminados, como por exemplo: o volume do precipitado foi medido a olho nu, não 
sendo realizado nenhum teste para saber sobre umidade do mesmo, outro fator é as 
impurezas, uma vez que na centrifuga todos os sólidos em suspensão precipitaram 
incluindo as impurezas. Essa técnica, pode torna-se mais precisa através de etapas 
mais complexas, no qual podemos utilizar reagentes químicos para extrair algumas 
impurezas da suspensão original. 
 
Dentre as técnicas indiretas de quantificação de microrganismos, está a 
turbidimetria, também chamada densidade óptica da suspensão celular. A turbidez do 
meio indica o crescimento microbiano, pois quanto maior o número de células 
presentes, menor a quantidade de luz que atravessa uma suspensão. Utiliza-se um 
comprimento de onda entre 490 e 600 nm, e para a análise realizada foi selecionado o 
comprimento 570 nm. Realizadas as medidas, foi confeccionada a curva de calibração 
para quantificar as leveduras presentes na solução preparada, fornecendo os 
seguintes resultados: 
 
amostra Volume alíquota/ Volume solução diluição 
Absorbância 
(u.A.) 
amostra 1 2 mL/250 mL 125x 0,100 
amostra 2 3 mL/250 mL 83x 0,124 
amostra 3 1,5mL/100mL 67x 0,180 
amostra 4 5 mL/250 mL 50x 0,241 
 
Quanto mais próximo de 1 o coeficiente de correlação, menor a dispersão do 
conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão 
estimados. De acordo com a ANVISA, o coeficiente de correlação deve estar próximo 
de 0,99 como mínimo aceitável e para o INMETRO, deve estar acima de 0,90. Como 
obteve-se um R² de 0,97, o coeficiente de correlação está dentro do estabelecido pelo 
INMETRO, mas não pela ANVISA. Considera-se também, como fatores de alteração, 
as diluições realizadas, que contam com os erros de precisão associados aos 
instrumentos e aos laboratoristas. O método turbidimétrico também é menos sensível 
à quantificação, e suscetível a erro nas leituras devido à rápida decantação dos 
microrganismos em suspensão. 
 
 
Conclusão 
 
Os métodos, exceto a turbidimetria, apresentaram eficiência satisfatória ao objetivo do 
experimento, que era quantificar a quantidade de células de ​Saccharomyces 
cerevisiae contidas na suspensão utilizada. A turbidimetria não apresentou a eficiência 
esperada devido aos erros associados à sua realização e à rápida decantação das 
células em suspensão durante a análise na cubeta no espectrofotômetro. Os demais 
métodos foram mais eficientes porque não trabalhavam com a emulsão, e sim com o 
volume de células presente nas alíquotas. 
 
 
 
Referências 
 
Coordenação Geral de Vigilância em Saúde Ambiental/DSAST/SVS/MS. 
(Outubro de 2012). ​PERGUNTAS E RESPOSTAS SOBRE A PORTARIA 
MS N° 2.914/2011​. Fonte: Ministério da Saúde: 
http://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2015/setembro/30/PERG
UNTAS-E-RESPOSTAS-SOBRE-A-PORTARIA-MS-N-2-914.pdf 
Nitzke, J. A. (s.d.). ​Medida do Crescimento​. Fonte: Universidade Federal do Rio 
Grande do Sul: 
http://www.ufrgs.br/alimentus1/pao/fermentacao/fer_crescimento_quantifi
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Sanitária, D. C. (27 de Setembro de 1999). ​Resolução - RDC nº 481, de 23 de 
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http://www.prolabnet.com.br/arquivo-rdc/Resolu%C3%A7%C3%A3o+RD
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BORZANI, Walter; SCHMIDELL, Willibaldo; LIMA, Urgel ; AQUARONE, 
Eugênio. Biotecnologia Industrial. 1ºedição. São Paulo: Edgard blucher, 
2001. Vol 1 
RIBANI, Marcelo et al. ​Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. 
Quím. Nova. 2004, vol.27, n.5, pp.771-780. ISSN 0100-4042. 
http://dx.doi.org/10.1590/S0100-40422004000500017.