RELATÓRIO DE DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE AGLUTINAÇÃO E FLOCULAÇÃO

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UNIVERSIDADE NILTON LINS 
FARMÁCIA 
Imunologia Clínica
DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO
AGLUTINAÇÃO E FLOCULAÇÃO
Elcinei Macedo Belém 
Karla Dayana Davi da Silva
Manaus, 2019
Elcinei Macedo Belem
Karla Dayana Davi da Silva
DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO
AGLUTINAÇÃO E FLOCULAÇÃO 
Relatório apresentado na disciplina de Imunologia Clínica, da turma LFA082, ministrado pela Profª. Evelyn Vaz, para obtenção de nota parcial.
Manaus, 2019
1. Atividade Laboratorial
No dia 28 de Outubro do ano de 2019, na instituição de Ensino Superior, Universidade Nilton Lins, situado no bairro de Flores, Manaus-AM, foi ministrado através da Profª. Evelyn Vaz, aula prática em laboratório da disciplina de Imunologia clinica do curso de Fármacia da instituição.
· Aglutinação, em teste para tipagem sanguínea.
· Floculação, em teste de VDRL. 
Foi abordado como tema, Aglutinação e Floculação, que foi dado início através do teste de tipagem sanguínea para a realização da aglutinação, foi realizado uma pequena coleta de sangue através de uma lanceta, com três gotas de sangue em uma lâmina de vidro, indicando o antígeno A, antígeno B, e o fator RH para a realização do teste, após reagir foi feita a leitura das aglutininas.
Em seguida foi realizada o teste de VDRL, para a obtenção da floculação, foi realizado em uma plca de kline ou escavada, onde foi usado apenas o controle positivo do teste diluido em soro fisiológico a partir de 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, assim sucessivamente. Após foi homogeinizado manualmente e levado ao microscópio para análise da floculação e até qual diluição essa reação de floculação se encontra para otenção de resultado descrito como Reagente, e sua Titulação.
2. Objetivo
Este trabalho tem como objetivo, mostrar ao aluno como pode ser feito a metodologia de Aglutinação e Floculação, ampliando assim seu conhecimento em relação a disciplina de Imunologia Clínica, que com o estudo do tema proposto, pode se fazer os teste imunológicos para tipagem sanguínea, e o teste de VDRL. Obtendo assim conhecimento de como essas técnicas podem ser de extrema importância para o diagnostico imunológico.
3. Introdução
Os imunoensaios são técnicas para a detecção ou quantificação de antígenos ou anticorpos, podendo utilizar reagentes marcados ou não marcados. Os ensaios com reagentes não marcados possuem sensibilidade de detecção menor, pois é necessário que se forme grande quantidade de imunocomplexos para que se processe a visualização do fenômeno. Nas últimas décadas os imunoensaios se tornaram a tecnologia padrão em medicina laboratorial. Houve grande desenvolvimento na tecnologia de produção de anticorpos e antígenos empregados, bem como dos analisadores automatizados. Esses avanços tecnológicos agregaram baixa variabilidade inter e intra-ensaios (CV = coeficiente de variação) e rapidez na realização dos testes. (Bender e Von Mühlen).
Os testes de aglutinação ocorrem quando há a formação de agregados suficientemente grandes de micropartículas ou células com múltiplos determinantes antigênicos, interligados por pontes moleculares de anticorpos ou antígenos. Os testes de floculação baseiam-se em uma suspensão antigênica que contém cardiolipina, colesterol e lecitina. No preparo da suspensão antigênica, a ligação desses componentes ocorre ao acaso e resulta na formação de estruturas arredondadas denominadas micelas. (Avelleira e Bottino).
Teste de aglutinação.
A ligação cruzada com produção de agregados ocorre quando um anticorpo reage com um antígeno multivalente presente em uma partícula (insolúvel). A partícula insolúvel pode ser um antígeno insolúvel nativo, antígenos expressos em células (por exemplo, antígenos eritrocitários) ou partículas cobertas com antígenos (por exemplo, partículas de látex). As reações de aglutinação têm boa sensibilidade e podem ser analisadas por inspeção visual, no entanto são mais sujeitas a resultados falso-positivos devido à aglutinação inespecífica.
Teste de floculação de Cristais de Colesterol 
O teste do VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) emprega cristais de colesterol que são sensibilizados com lecitina e cardiolipina para a pesquisa de anticorpos cardiolipídicos da sífilis ou na presença de auto-anticorpos da síndrome anti-fosfolípide primária ou secundária, neste caso em geral associado ao lupus eritematoso sistêmico.
O método é indicado para teste de triagem. O diagnóstico final não deve ser baseado somente no resultado laboratorial. Deve-se correlacionar o resultado com os sinais e sintomas clínicos do paciente. Pacientes com infecção sifílica tratada podem apresentar resultados positivos em títulos baixos (cicatriz sorológica). O VDRL pode ser utilizado para acompanhar a terapêutica, pela rápida resposta representada pela queda de títulos, pela negativação e modificações mais lentas ou mesmo inexistentes para os testes treponêmicos.
4. Materiais e Metodos.
Os materiais usados durante a aula pratica foram:
Tipagem Sanguinea - Aglutinação.
· Lâminas de vidros
· Algodão
· Álcool a 70%
· Lanceta
· Luva de procedimento
· Kit de reagente A,B e D.
Teste VDRL – Floculação.
· Placa de kline ou escavada
· Pipeta graduada
· Luva de procedimento
· Cloreto de sodio a 0,9% (soro fisiologico)
· Ponteiras
· Kit de reagente do teste de VDRL
Avaliação microscópica.
· Microscópio óptico.
5. Metodologia
Tipagem Sanguinea - Aglutinação.
A determinação de grupos sanguíneos do sistema ABO realiza-se confrontando os glóbulos vermelhos do paciente com anticorpos monoclonais Anti-A, Anti-B ou Anti-AB. A presença ou ausência de aglutinação dos eritrócitos confrontados com cada um dos reagentes, indica a presença ou ausência dos correspondentes antígenos.
O experimento de tipagem sanguínea foi realizado com base nas orientações e métodos utilizados em todos os laboratórios do Brasil, respeitando os parâmetros e regras do Ministério da Saúde (2013).
Foi organizado o material de coleta e análise sanguínea, seguindo as normas de ética e biossegurança, e iniciaram as atividades com os alunos selecionados para participar da prática, escolhidos de acordo com seu tipo sanguíneo previamente conhecido e com seu desejo e permissão para participar como voluntário.
1. Colocar em uma placa limpa e rotulada, 1 gota de Reagente Anti-A, Anti-B ou Anti-AB monoclonal. Adicionar ao seu lado, 1 gota de sangue. É importante manter a relação reagente:células em todos os sistemas de ensaio.
2. Misturar o Reagente e os eritrócitos com um palito descartável cobrindo uma área circular de 2 cm de diâmetro e mexer durante 2 minutos. Observar aglutinação visível macroscopicamente até os 2 minutos. 
A observação pode-se facilitar se utilizar uma fonte de luz difusa. Não deve-se utilizar microscópio. A prova deve-se interpretar dentro dos 2 minutos para evitar o secado do reagente por evaporação. Quando observar aglutinação débil deve-se repetir a prova utilizando a técnica em tubo (por centrifugação). Podem-se acrescentar 2 volumes de reagente a 1
Teste VDRL – Floculação.
A combinação de lecitina, colesterol e cardiolipina possui semelhança imunológica com antígenos do Treponema pallidum, consistindo em um antígeno não treponêmico. A interação das reaginas da amostra com este antígeno produz floculação que pode ser detectada ao microscópio óptico.
	Cavidade nº
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	Diluição
	1:2
	1:4
	1:8
	1:16
	1:32
	1:64
1. Pipetar em cada cavidade da lâmina escavada 50 L de NaCl 0,9 %. 
2. Na cavidade Nº 1, pipetar 50 L da amostra a ser titulada, homogeneizar.
3. Transferir 50 L da cavidade Nº 1 para a Nº 2 e assim sucessivamente até a diluição desejada.
4. Desprezar os 50 L em excesso da última cavidade.
5. Em seguida adicionar à cada cavidade, 20 L do Reagente Nº 1.
6. Agitar manualmente com movimentos circulares ou em um agitador rotativo por 4 minutos a 180 rpm.
7. Examinar ao microscópio no aumento 100 X, logo após a agitação.
	O título corresponde à maior diluição da amostra em que ocorreu a floculação.
Termino de avaliação microscópica.
1. Ao termino da avaliação, baixe a luz à menorintensidade pelo potenciômetro.
2. Antes de remover a lâmina, baixe a mesa.
3. Remover a lâmina.
4. A luz deverá ser desligada e o microscópio guardado no devido local.
Vale lembrar que o microscópio jamais deverá ser arrastado para mudança de local e devem ser evitados movimentos bruscos, que poderão danificar o núcleo óptico do aparelho.
6. Resultados
No sistema ABO, existem 4 grupos sanguíneos determinados geneticamente (A, B, AB e O), dependendo da presença ou ausência de determinados aglutinogênios (antígenos) nas hemácias. A presença de aglutinogênio A, presença de aglutinogênio B, presença de aglutinogênio A e B e ausência de aglutinogênios, respectivamente, é o que caracteriza cada um deles. O fator Rh pode ser Rh positivas (Rh+) ou quando não possuem nas hemácias o fator Rh e são Rh negativas (Rh-).
Cicatriz sorológica é o termo utilizado para as situações nas quais o indivíduo, comprovadamente tratado, mas ainda apresenta reatividade nos testes. Nestes casos, os testes treponêmicos tendem a ser reagentes, e os testes não treponêmicos quantitativos apresentam baixos títulos. É um erro considerar títulos baixos apenas como cicatriz sorológica ou como reação falsamente positiva. Os testes para o diagnóstico da sífilis devem ser feitos em duas etapas, de triagem e outra confirmatória, sendo que os resultados dos testes devem ser interpretados pelo médico, em associação com os dados da história clínica do indivíduo e com os dados epidemiológicos..
7. Conclusão
Diante de todo o processo dos teste imunologicos, observou-se que todo o processo estudado nesta aula prática, é de extrêma importância para o estudo de diagnóstico em pacientes de triagem sendo que a análise é a importância em saber diferenciar cada uma, para estudo de doenças, ou de transplantes ou doação sanguínea, como é o caso da Tipagem sanguínea, ao mesmo tempo que elas podem ser alguns dos marcadores e até mesmo indicadores de uma enfermidade, como caso do teste de VDRL.
8. Bibliografia
1. Bende, A.L., Von Mühlen, C.A., - Testes Laboratoriais Aplicados à Imunologia Clínica. cap. 5, pag, 71 – 93. Disponível em: (https://www.sobrau.com/wp-content/uploads/2016/11/Testes-Laboratoriais-Aplicados-Imunologia-Clinica.pdf). Acessado em 29/10/2019, as 00h12min.
2. AVELLEIRA J.C.R.; BOTTINO, G. Diagnóstico, tratamento e controle da sífilis. An. Bras. Dermatol. 2006; 81(2):111-26.
3. Departamento de Microbiologia e Parasitologia Universidade Federal de santa Maria Website construído utilizando o Assistente Web - CPD/2004.
4. Diagnóstico Imunológico utilizando a técnica de enzimaimunoensaio. Universidade Federal de Santa Catarina. Acessado em: 29/10/2019 as 00h30minh.
5. BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. SECRETARIA DE GESTÃO DO TRABALHO E DA EDUCAÇÃO NA SAÚDE. Técnico em hemoterapia: livro texto. Brasília: Ministério da Saúde, 2013.
6. FERREIRA, A.W.; Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e auto-imunes, 2 ed.Editora Guanabara Koogan SA, 2001
7. https://www.bioclin.com.br/sitebioclin/wordpress/wpcontent/uploads/arquivos/instrucoes/INSTRUCOES_VDRL.pdf. Acessado em 30/10/2019 ás 00h32min.
8. https://www.wienerlab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20portgues/anti_a_anti_b_anti ab_monoclonal_po.pdf. Acessado em 30/10/2019 ás 01h30min.
9. ANEXO
	Tipagem sanguínea - Aglutinação
	Teste de VDRL – Floculação
	
	
	FIG -1. Uso da lanceta para furar a extremidade do dedo, para coleta de amostras
	FIG – 4. VDRL reativo e não reativo.
	
	
	FIG – 2. Misturando os reagentes na lamina com a amostra.
	FIG – 5. Placa de kline ou escavada.
	
	FIG – 3. Resultados do teste já com a aglutinação