Analisadores hematológicos

Prévia do material em texto

AUTOMAÇÃO EM HEMATOLOGIA PARÂMETROS DERIVADOS DA AUTOMAÇÃO NO HEMOGRAMA
Aula 2 
Prof. MSc. Matheus Guedes Duarte
HEMOGRAMA
Análise
do	sangue	periférico	com	o	intuito	de
responder duas questões:
Se a medula óssea está produzindo um numero suficiente de células maduras de diferentes linhagens;
Os processos de proliferação, diferenciação, aquisição de função de cada tipo celular estão se desenvolvendo de maneira adequada em todas as linhagens celulares.
HEMOGRAMA
Exame mais solicitado nos laboratórios clínicos
Características
Custo
T.A.T. (tempo total para realização do exame)
Exame de rotina
Essencial em serviços de alta complexidade
Qualidade
HEMOGRAMA
RESULTADO
Quantidade de parâmetros
Interferentes
Diferentes metodologias
Automação em hematologia
Determinam de 8 a 32 parâmetros relacionados a plaquetas, leucócitos e eritrócitos.
Múltiplos canais: 
 - Cell Dyn1400, Coulter T890
3 parâmetros: 
 - Cell Dyn 1600, Cobas Minos STE-X, Coulter 
 MicroDiff, KX-21N (Sysmex)
Automação em hematologia
5 parâmetros:
 - Cell Dyn 3000, Pentra 120, Sysmex NE 1500, XT-1800 (Sysmex), Mindray BC-5380
Reticulócitos:
 - Pentra Retic 120 (ABX Horiba), Cell Dyn 4000, XT-2000 (Sysmex)
Com preparador de lâminas integrado
 - XE-Alpha N(Sysmex), Pentra Retic 120 DX
Vantagens da automação
Rapidez na emissão dos resultados
Otimização do tempo de análise microscópica
Qualidade dos exames
Contagem manual: 
 - CV= 6,5% (leucócitos normais ou elevados)
 - CV= 15% (leucócitos baixos)
Contagem automática: CV= 1 a 3 %
Vantagens da automação
Novos parâmetros:
RDW
Histograma eritrocitário
Histograma plaquetário
VPM
Matriz leucocitária
Parâmetros reticulocitários
Vantagens da automação
Detecção de Trombocitopenias
Exatidão
Precisão
Possibilidade de avaliações urgentes sem interferência com a rotina
Problemas da contagem manual de leucócitos
Má distribuição das células no esfregaço
Erro na classificação dos vários tipos celulares
Erro estatístico
Limitações da contagem diferencial manual
Quantas células
Estatística
Com o que se está comparando
Como está o esfregaço
Onde está se realizando a contagem
Qual é o padrão
Distribuição irregular
Qualidade da coloração
Tipo de coloração utilizado
Qualidade da amostra
Esfregaço sangüíneo
Contudo a automação permite:
Monitorização das médias das amostras
Calibração
Utilização de controles
Gráfico de Lewey-Jennings e Westgard 
 - Análise dos controles
Reprodutibilidade
Estabilidade
Parâmetros fornecidos pelos contadores hematológicos
Eritrócitos (RBC)
Nº, HCT, Hb,VCM,HCM, CHCM,RDW
Flags: eritroblastos, aglutinação, anisocitose, fragmentos
Leucócitos (WBC)
Nº, Diff 3 partes, Diff 5 partes
Flags: blastos, desvio a esquerda, linfócitos atípicos
Plaquetas (PLQ)
Nº, Pct, PDW
Flags: plaquetas gigantes, interferência eritrócitos, grumos plt
Série Vermelha
RDW = RED CELL DISTRIBUTION WIDTH
Coeficiente de variação na distribuição das hemácias (anisocitose)
 - RDW-SD (fL)
 - RDW-CV (%)
Calculado diretamente no histograma
RDW-SD
Homem: 39,9 - 46,3 fL
Mulher: 36,9 - 50,2 fL
RDW-CV
Homem: 11,9 -12,9%
Mulher: 11,6 -14,7%
Determinação do RDW
 Curva de distribuição de eritrócitos
EXEMPLO DE ANISOCITOSE
Série Plaquetária
VPM = volume plaquetário médio (6 – 11 fL)
PDW = platelet distribution width (derivado da curva de distribuição das plaquetas)
Pct = platquetócrito
VPM
Correlação entre o volume plaquetário e grau de estímulo ou nível de produção medular
Correlação com a idade das plaquetas
Plaquetas mais novas = maiores
Plaquetas mais velhas = menores
EXEMPLO DE PDW ELEVADO
Tecnologias aplicadas
Impedância:
Tamanho do pulso elétrico gerado pela interrupção da corrente está diretamente relacionado ao tamanho da partícula
Medida da condutividade
- Impulso produzido é função preferencialmente da estrutura celular interna
Eritrócitos
Curva de distribuição das hemácias
Plaquetas
Curva de distribuição das plaquetas
Impedância
Baseado na obstrução da passagem da corrente elétrica
O pulso gerado é diretamente proporcional ao tamanho da partícula
Histograma de plaquetas e eritrócitos
Os histogramas propiciam uma análise visual das populações
de células
VCM: tamanho dos eritrócitos
Dupla população eritrocitária
Alterações na distribuição
Microcitose
Alterações na distribuição
Eritrócitos e Plaquetas
Discriminadores flutuantes
25-75 fl
200-250 fl
RBC
PLT
Histograma de eritrócitos
RL	RU
Histograma de	plaquetas
2-6 fl
12-30 fl
PU
PLT
RBC
PL
100%
20%
Eritrócitos e Plaquetas
Histograma de eritrócitos
2-6 fl
PLT
20%
12-30 fl 25-75 fl
200-250 fl
Histograma de	plaquetas
PL	PU	RL
100%
RBC
RU
Determinação do hematócrito
Detecção da altura de pulsos cumulativos
O hematócrito é medido através da soma do volume de cada célula que passa pela abertura
Volume constante
Método SLS-HGB
Reativo livre de cianeto
Atóxico
Ecologicamente correto
Dosagem por espectrofotometria
DOSAGEM DE HEMOGLOBINA
O nosso método de deteção SLS de hemoglobina utiliza laurilsulfato de sódio (SLS) sem cianeto. O reagente hemolisa os eritrócitos e leucócitos da amostra. A reação química inicia-se com a alteração da globina, oxidando depois o grupo heme. O grupo hidrofílico do SLS pode agora ligar-se ao grupo heme, formando um complexo corado (SLS-HGB) que é analisado através de um método fotométrico. 
Volume Corpuscular Médio
– VCM (fL) =
Hemoglobina Corpuscular Média
– HCM (pg) =
– CHCM (g/dL) =
 	HCT (%) RBC (x 106/uL)
HGB (g/dL)
RBC (x 106/uL)
Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média
 	HGB (g/dL)_ HCT (%)
CÁLCULO DOS ÍNDICES HEMATIMÉTRICOS
Tecnologias aplicadas
Medida de dispersão de luz (laser ou halogênio)
- Fotodetector de ângulo baixo ou frontal: tamanho celular
Detector de ângulo alto ou lateral: estrutura interna
Citoquímica isolada ou combinada com as outras técnicas
Princípios empregados no hemograma
Impedância: WBC,RBC,PLT
Método da cianometahemoglobina: Hb
Integração eletrônica: HCT
Cálculos: HCM, CHCM, RDW,PDW,PCT
Citoquímica,impedância e transmissão ótica: diff de leuco
Basófilos: canal específico
Citometria de fluxo + laser: retic, subpopulações de linfócitos, identificação de células imaturas
Reagentes básicos
Diluente
Agente lítico
Detergente
Detergente enzimático – (enzimatic cleaner)
Reagentes citoquímicos
Laser Semicondutor (λ = 633 nm)
Foto Multiplicador (Fluorescência)
Espelho Dicróico
Célula de Fluxo
Foto Diodo
(Luz desviada frontalmente)
Foto Multiplicador (Luz desviada lateralmente)
Tamanho
Complexidade interna
Conteúdo de DNA/RNA
Contagem diferencial dos leucócitos
Citometria de Fluxo Fluorescente
Citometria de fluxo fluorescente
2 átomos de nitrogênio endocíclicos produzem sinais de luz "brilhantes" Amplificação da fluorescência da ligação com os ácidos nucléicos
	Excitação e emissão do comprimento do onda com o uso de laser semicondutor
Canal de DIFF
Células normais
Blastos Granulócitos
imaturos
Linfócitos atípicos
Lisante
Stromatolyser 4-DL
Corante fluorescente
Stromatolyser 4-DS
Intensidade de
fluorescência
Muito alta
Alta
Baixa
Contagem diferencial de leucócitos
Polimetina – marcador de Ac. Nucleico
Citometria de Fluxo Fluorescente
Luz dispersa lateral (estrutura interna celular)
Fluorescência (conteúdo de RNA/DNA)
Luz dispersa lateral Complexidade interna
Luz dispersa frontal
Volume celular
Canal DIFF
Canal WBC/Baso
Citometria de fluxo fluorescente
+	+
Populações anormais
Análise inicial de 500 células, depois o centróide é fixado
Análise de mais 500 células com o centróide fixo (total de 1.000 células) para otimizar o posicionamento do núcleo
Repetição dos passos 1 e 2 até 5 vezes
Determinação final da discriminação celular
Análise e discriminação de 32.000 células
Análise adaptativa de grupos de células
ACASErros nas contagens automatizadas
ERI falsamente diminuídos 
Crioaglutininas
Hemolise in vitro
Microcitose ou grande fragmentos
VCM falsamente elevados
Conservação prolongada do sangue
Crioaglutininas e aglutinação EDTA-Dependente
CHCM falsamente elevado
Aumento de Hb
Crioaglutininas
Redução espúria do Hct 
Erros nas contagem automatizadas
Leucócitos falsamente diminuídos 
Amostra velha, agregação leuco, aglutinação
Contagem de PLT falsamente diminuídas
Coagulação parcial da amostra
Agragação de PLT EDTA dependente
Satelitismo plaquetário
Macroplaquetas
Contagem de PLT falsamente elevadas
- ERI microcíticos ou fragmentados
- Fragmentos de leucócitos
Material EXTRA
Feitoooooo!!!