Slides de Aula - Unidade III

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Profa. Dra. Marília Patrão
UNIDADE III
Bases Analíticas 
do Laboratório Clínico
Conteúdo da Unidade III: 
Principais técnicas analíticas utilizadas no laboratório clínico:
 Cromatografia
 Eletroforese
 Espectrofotometria
 Determinação do pH
Conteúdo programático – Unidade III
 Início: Mikhail Semyonovich Tsvet - 1903
 Estudos sobre clorofila das plantas
Cromatografia
Fonte:<http://www.cromatografialiquida.com.br>
"Uma vez que as diferentes substâncias 
apresentarem diferentes constantes, irão, 
consequentemente, mover-se com 
diferentes velocidades de deslocamento ao 
longo do fluxo e assim serão separadas 
como zonas de adsorção independentes."
Fonte: 
https://pt.wikipedia.org/wiki/Mi
khail_Semenovich_Tswett
 Cromatografia: técnica que se baseia na diferença de afinidade, entre uma fase 
estacionária e uma fase móvel, dos solutos que compõem uma solução complexa 
(diversos solutos em uma mesma solução). 
 Usos: separação de princípios ativos de plantas, controle de qualidade de 
medicamentos, identificação de substâncias tóxicas e drogas na medicina 
forense etc.
 Separação dos solutos (ou analitos) ocorre pelos 
mecanismos de adsorção, de partição, de troca iônica, 
de bioafinidade ou de exclusão.
Cromatografia: conceito
 Adsorção: estabelecimento de interações entre as 
moléculas contidas em um fluido (o adsorvato) e uma 
superfície sólida (o adsorvente). 
 Dessorção: término da adsorção; liberação do adsorvato. 
Cromatografia: mecanismo de adsorção
Fonte: <http://qnint.sbq.org.br>.
 Partição: diferença 
de solubilidade 
de uma substância 
entre duas fases 
líquidas (fase móvel 
e fase estacionária, 
encontrada entre os 
poros de um suporte 
sólido inerte).
Cromatografia: mecanismo de partição
Fonte: <https://drgpinstitute.wordpress.com/2014/12/26/chromatography/>.
Sólido inerte
Partículas do soluto
Fase móvel
Fase estacionária
 Troca iônica: separação baseada na carga iônica total de proteínas (aminoácidos 
podem mudar sua carga elétrica de acordo com o pH do meio).
Cromatografia: mecanismo de troca iônica
Fonte: <http://gamemakertech.info/other/solid-particles.awp/>.
 Bioafinidade: afinidade do soluto por uma proteína ou 
outra estrutura, por exemplo, um anticorpo.
Cromatografia: mecanismo de bioafinidade
Amostra
Fase estacionária
contendo anticorpos
Fonte: MOSER, A. C.; HAGUE, D. S. Bioanalysis, vol. 2, n. 4, p. 769-790, 2010.
 Exclusão por tamanho: separação 
das moléculas de acordo com a sua 
diferença de tamanho. Moléculas 
maiores não são retidas pelos poros 
da fase estacionária, enquanto que 
as moléculas menores, são.
Cromatografia: mecanismo de exclusão por tamanho
Fonte: HARRIS, D. C. Exploring chemical analysis. 3 ed, 2004.
Moléculas pequenas
penetram nos poros
da fase estacionária
Moléculas grandes
são excluídas
Cromatografia: classificação
De acordo com a configuração do sistema:
Em coluna
Planar
Fonte: SILVA, L. B. et al. Química Nova 
na Escola, n. 23, p. 52-53, 2006.
Fonte: <http:/cromatografiafametro.blogspot.com>
Cromatografia: classificação
Fonte: <http://qnint.sbq.org.br>.
Cromatografia
Planar Coluna
Centrífuga
(Chromatotron)
CCD CP Líquida CSC Gasosa
Clássica CLEA CG CGAR
 Tempo de eluição: tempo necessário para que a molécula percorra toda a 
extensão da coluna e 
seja coletada.
Cromatografia em coluna: identificação de substâncias
Fonte: <https://bitesizebio.com/29947/basics-chromatography-column/>
Amostra
Fase
estacionária
Separação
Fase
móvel
Moléculas
eluídas
 Fator de retenção: quociente entre a distância percorrida 
pelo analito e a distância percorrida pela fase móvel.
Cromatografia planar: identificação de substâncias
Fonte: <http://www.bio-rad.com/pt-br/applications-technologies/introduction-chromatography?ID=LUSMIS7OP>
Interatividade
A cromatografia é uma técnica utilizada na análise qualitativa e quantitativa de 
substâncias. A respeito dessa técnica, assinale a alternativa correta.
a) Na cromatografia, o analito não deve ter afinidade pela fase móvel.
b) A fase estacionária sempre se encontra no estado sólido.
c) Na exclusão por tamanho, a fase estacionária apresenta poros que retêm as 
moléculas maiores e deixa passar as menores. 
d) A adsorção se refere ao estabelecimento de forças de atração entre a fase 
estacionária e as moléculas da amostra.
e) É uma técnica cuja principal aplicação reside em 
separar os componentes de uma mistura heterogênea 
do tipo suspensão.
Resposta
A cromatografia é uma técnica utilizada na análise qualitativa e quantitativa de 
substâncias. A respeito dessa técnica, assinale a alternativa correta.
a) Na cromatografia, o analito não deve ter afinidade pela fase móvel.
b) A fase estacionária sempre se encontra no estado sólido.
c) Na exclusão por tamanho, a fase estacionária apresenta poros que retêm as 
moléculas maiores e deixa passar as menores. 
d) A adsorção se refere ao estabelecimento de forças de atração entre a fase 
estacionária e as moléculas da amostra.
e) É uma técnica cuja principal aplicação reside em 
separar os componentes de uma mistura heterogênea 
do tipo suspensão.
 Eletroforese: processo de separação de misturas que permite a separação de 
partículas em diâmetro coloidal com base na aplicação de uma carga elétrica 
sobre a amostra. 
 Isolamento de moléculas biológicas 
(proteínas, DNA).
Eletroforese: principais conceitos
Fonte:
<http://profissaobiotec.com
.br/5-ferramentas-
fundamentais-para-a-
engenharia-
genetica/eletroforese/>
Fonte de energia
Poços das amostras
Direção do
movimento
Solução tampão
Cuba de eletroforese
Eletroforese: princípio da técnica
Separação é feita por tamanho: 
 Aplica-se um detergente que apresenta carga negativa, o que garante que as 
moléculas presentes na amostra migrarão em direção ao polo positivo (ex.: SDS).
 Malha de gel faz com que moléculas de maior tamanho migrem mais lentamente, 
enquanto que as menores migram mais rapidamente.
 Tamanho de proteínas estimado 
em Daltons (Da) e de fragmentos 
de DNA, em pares de base (pb), 
com base na comparação com 
um padrão.
Eletroforese: princípio da técnica
Fonte: <https://wikiciencias.casadasciencias.org/wiki/index.php/Electroforese_(Biologia)>
1 2 3
654
S
+ + +
- - -
Eletroforese: classificação
De acordo com a 
configuração do sistema:
Vertical
Horizontal
Fonte: <http://biologiabioblog.blogspot.com/2017/03/eletroforese-
por-raphael-goncalves.html>
Fonte: <http://biologiabioblog.blogspot.com/2017/03/eletroforese-por-raphael-goncalves.html>
 Eletroforese vertical: gel de poliacrilamida (acrilamida/ bisacrilamida em 
diferentes proporções).
 Acrilamida é uma molécula linear, enquanto que bisacrilamida tem formato 
de “T”  formação de uma “malha”.
 Eletroforese horizontal: gel de agarose (polímero linear isolado de algas marinhas; 
forma matriz porosa).
Tipos de gel
 Identificação e isolamento 
de proteínas presentes em 
uma amostra biológica.
 Exemplo: proteínas de fase 
aguda (relacionadas a 
processos inflamatórios).
Exemplo de aplicação – eletroforese vertical
Proteína
Separação por tamanho
Fonte: <http://www.edvotek.com/SDS-PAGE>
 Teste de paternidade: DNA da 
mãe, do filho e do suposto pai é 
cortado com enzimas específicas 
e o tamanho dos fragmentos 
gerados é comparado.
Exemplo de aplicação – eletroforese horizontal
Fonte: 
<http://nlm.nih.go
h/visibleproofs/e
ducation/electrop
horesis/dna.pdf
 Teste de paternidade: metade 
do DNA é herdado do pai e 
metade, da mãe. Portanto, 
padrão de bandas formadas 
após digestão enzimática deve 
seguir esse padrão.
Exemplo de aplicação – eletroforese horizontal
Fonte: UNICAMP (2009)
A eletroforese é uma técnica que permite a separação de DNA e proteínas, 
partículas em diâmetro coloidal, presentes em uma mistura. A respeito dos métodos 
eletroforéticos, assinale a alternativa correta.
a) A separação éfeita por tamanho. Quanto maior a molécula, maior a distância 
percorrida no gel.
b) A eletroforese em gel de agarose é adequada para a separação de proteínas.
c) Ao se aplicar um campo elétrico sobre o sistema, as moléculas migram do polo 
negativo para o polo positivo, ocorrendo separação por tamanho. 
d) O teste de paternidade é realizado a partir da 
eletroforese das proteínas do sangue.
e) O SDS é um detergente que adiciona cargas positivas 
às proteínas.
Interatividade
A eletroforese é uma técnica que permite a separação de DNA e proteínas, 
partículas em diâmetro coloidal, presentes em uma mistura. A respeito dos métodos 
eletroforéticos, assinale a alternativa correta.
a) A separação é feita por tamanho. Quanto maior a molécula, maior a distância 
percorrida no gel.
b) A eletroforese em gel de agarose é adequada para a separação de proteínas.
c) Ao se aplicar um campo elétrico sobre o sistema, as moléculas migram do polo 
negativo para o polo positivo, ocorrendo separação por tamanho. 
d) O teste de paternidade é realizado a partir da 
eletroforese das proteínas do sangue.
e) O SDS é um detergente que adiciona cargas positivas 
às proteínas.
Resposta
 Espectrofotometria: técnica que permite a determinação da concentração de um 
analito com base no padrão de absorção de ondas de luz pelo mesmo.
 Apresenta alta sensibilidade e especificidade  muito utilizada nas diferentes 
áreas do laboratório. Exemplo: dosagem da bilirrubina.
Espectrofotometria
Exames
Média
(mg/mL)
Hepatite
Valor máximo
(mg/mL)
Valor mínimo
(mg/mL)
Bilirrubinas totais 3,58 12,51 0,47
Bilirrubinas 
indiretas
1,59 4,87 0,31
Bilirrubinas diretas 1,94 8,15 0,06
 Luz: natureza ondulatória (ondas eletromagnéticas de diferentes comprimentos) e 
particulada (envolve a atividade dos fótons).
Natureza da luz
Fonte: CAVALEIRO, 
M.; BELEZA, M. D. 
FQ8 –
sustentabilidade na 
terra. 2008.
Ondas de rádio Micro-ondas Raios X Raios y
Radiação
infravermelha
Radiação
ultravioleta
4x1014Hz 8x1014Hz
Luz visível
 Luz: natureza ondulatória (ondas eletromagnéticas de diferentes comprimentos) e 
particulada (envolve a atividade dos fótons).
Espectrofotometria: princípio da técnica
Fonte: CAVALEIRO, M.; BELEZA, M. D. FQ8 – sustentabilidade na terra. 2008.
Luz vermelha Luz azul
Baixa
Frequência
Alta
Frequência
V
e
rm
e
lh
o
A
la
ra
n
ja
d
o
A
m
a
re
lo
V
e
rd
e
A
z
u
l
A
n
il
V
io
le
ta
 Comprimento de onda: distância entre duas cristas de onda, em nanômetros (nm).
Natureza da luz
Luz vermelha Luz azul
 Violeta: 380 a 450 nm;
 Azul: 450 a 494 nm;
 Verde: 495 a 570 nm;
 Amarelo: 570 a 590 nm;
 Laranja: 590 a 620 nm;
 Vermelho: 620 a 750 nm.
Fonte: CAVALEIRO, M.; BELEZA, M. D. FQ8 – sustentabilidade na terra. 2008.
 Cores: resultado do padrão de absorção/reflexão da luz de determinado(s) 
comprimento(s) de onda.
 Objeto branco: reflete luz de todos os comprimentos de onda.
 Objeto preto: absorve luz de todos os comprimentos de onda.
 Objeto azul: absorve todos os comprimentos de onda, menos 
o azul (que é refletido).
Natureza da luz
Fonte: <https://mundoeducacao.bol.uol.com.br/fisica/a-cor-um-corpo.htm>
Corpo violeta Corpo negroCorpo branco
Luz 
branca
Luz 
branca
Luz 
branca
Luz 
violeta
Luz 
branca
 Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução  parte da luz é 
absorvida pela solução e parte é transmitida (continua seu percurso).
 Absorção da luz envolve a incorporação da energia do fóton à estrutura da 
molécula do analito.
Espectrofotometria: princípio da técnica
Fonte: <http://wellelaser.com>
FÓTON
ELÉTRON ELÉTRON
FÓTON
 Padrão de absorção depende 
das características 
físico-químicas da molécula 
e de sua concentração.
Espectrofotometria: princípio da técnica
Fonte: 
<https://commons.wikimedi
a.org/wiki/File:Chlorophyll_
Absorption_Spectrum.svg>
1e5
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
300 400 500 600 700 800
Comprimento de onda (nm)
C
o
e
fi
c
ie
n
te
 d
e
 a
b
s
o
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ã
o
 m
o
la
r
Clorofila A
Clorofila B
 Espectrofotômetro: equipamento laboratorial cujo funcionamento se baseia na 
medida da absorbância de um feixe de luz monocromática após o mesmo 
atravessar a solução que caracteriza a amostra experimental.
 Absorbância: capacidade intrínseca das moléculas absorverem luz de 
comprimentos de onda específicos.
Espectrofotometria: princípio da técnica
 Espectrofotômetro: composto de fonte de luz, prisma ou monocromador e detector.
Espectrofotometria: princípio da técnica
Fonte: 
<https://commons.wikimedia.
org/wiki/File:Componentes_d
e_un_espectofotometro.jpg>
FONTE DE
RADIAÇÃO
SELEÇÃO DO
COMPRIMENTO
DE ONDA
CUBETA DETECTOR
R
E
G
IS
T
R
O
 Lei de Lambert-Beer: correlaciona a absorbância detectada no espectrofotômetro e 
a concentração do analito na solução.
A = absorbância
ɛ = coeficiente de absortividade molar (L·mol-1·cm-1)
b = largura da cubeta que contém a amostra (cm)
ℳ = molaridade da amostra (mol/L).
Lei de Lambert-Beer
Você realizou a extração de um princípio ativo de uma planta, a fim de testar seu 
potencial uso no tratamento da cefaleia. Agora, você precisa determinar a 
concentração do princípio ativo isolado na solução obtida, por espectrofotometria. No 
comprimento de onda utilizado, o coeficiente de absortividade molar é de 7,5·102
L·mol-1·cm-1. A espessura da cubeta que contém a solução é de 1 cm. Sabendo que 
a absorbância da amostra, já descontado o branco, é de 0,352, qual a concentração 
do princípio ativo?
Exemplo de aplicação
O princípio da Lei de Lambert-Beer, que relaciona a absorbância de uma espécie 
química com sua concentração, afirma que a concentração de uma substância:
a) é diretamente proporcional à quantidade de luz transmitida. 
b) é inversamente proporcional à intensidade de cor.
c) é inversamente proporcional à quantidade de luz absorvida.
d) é diretamente proporcional à quantidade de luz absorvida.
e) é igual ao coeficiente de absortividade molar.
Interatividade
O princípio da Lei de Lambert-Beer, que relaciona a absorbância de uma espécie 
química com sua concentração, afirma que a concentração de uma substância
a) é diretamente proporcional à quantidade de luz transmitida. 
b) é inversamente proporcional à intensidade de cor.
c) é inversamente proporcional à quantidade de luz absorvida.
d) é diretamente proporcional à quantidade de luz absorvida.
e) é igual ao coeficiente de absortividade molar.
Resposta
 Potencial hidrogeniônico (pH): medida da acidez ou da basicidade 
de uma amostra.
 Várias características da solução dependem do pH (reatividade, natureza das 
reações químicas possíveis de serem realizadas com a amostra etc.).
 Parâmetro importante no diagnóstico de anormalidades nos líquidos corporais 
(várias patologias levam à alteração do pH ideal desses líquidos).
 Muitos procedimentos laboratoriais precisam ser 
realizados em determinadas faixas de pH.
Potencial hidrogeniônico (pH)
 Definição de pH: valor que expressa a atividade de íons hidrogênio 
(H+) em solução. 
 Em soluções diluídas (0,1 mol/L ou menos), valor é próximo à concentração de 
íons H+ em solução  valor negativo do logaritmo da concentração de íons H+.
 [H+] = concentração, em mol/L, de íons H+ em solução.
Definição de pH
 Arrhenius (1884): ácidos liberam íons H+ e bases liberam íons OH- quando 
em solução.
Exemplos de ácidos: HCl, H2SO4, ácido úrico etc.
Exemplos de bases: NaOH, Mg(OH)2 etc.
Definição de ácidos e bases
Ionização de ácidos
Dissociação de bases
Escala de pH: escala, de 0 a 14, construída a partir da reação de ionização da água:
 Em condições de equilíbrio: [H+] = [OH-] = 10-7 mol/L
Como pH = -log [H+], temos que:
pH = -log10-7
pH = 7  em condições de equilíbrio, o pH é neutro (pH 7)
Definição de pH
 Quanto maior o valor 
do pH, menor a 
concentração de 
H+na solução.
Exemplo: 
pH 1  [H+] = 10-1 mol/L = 0,1 mol/L
pH 14  [H+] = 10-14 mol/L = 0,000000000000001 mol/L
Escala de pH
Fonte: <http://www.blog.mcientifica.com.br/a-escala-de-ph/>
Soluções básicas: 
pH acima de 7
[OH-] > [H+]
Sempre teremos
[H+]·[OH-] = 10-14
Exemplo: pH 1  [H+] = 10-1 mol/L, portanto, 
[OH-] = 10-13 mol/L
Escala de pH
Fonte: <http://www.blog.mcientifica.com.br/a-escala-de-ph/>
 Indicadores ácidos-base: constituídos de um ácido fraco em equilíbrio com sua 
base conjugada, ou de uma base fraca em equilíbrio com seu ácido conjugado.
 Ácido e a base que estão em equilíbrio apresentam cores diferentes e, portanto, a
partir da cor da amostra, é possível saber para que lado o equilíbrio está
deslocado. 
Indicadores ácido-base e fitas de pH
Ácido fraco
Cor A
Base conjugada
Cor B
HA (aq) H++ A – (aq)
Exemplos de indicadores ácido-base:
 fenolftaleína  rosa ou carmim em pH básico e incolor em pH ácido;
 papel de tornassol  rosa em pH ácido e azul em pH básico.
Indicadores ácido-base e fitas de pH
Fonte: <https://www.vibuustore.eu/index.php?main_page=product_info&products_id=53324>
Papel de tornassol
Fenolftaleína
Fonte: <http://brasilescola.uol.com.br>
ph = 7 ph = 10
 Fitas de pH: maior exatidão na determinação do valor do pH; combinação de 
vários indicadores de pH.
Indicadores ácido-base e fitas de pH
Fonte: <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/76/Indicador.JPG>.
 pHmetro: aparelho que determina a atividade dos íons H+, ou seja, o pH, de 
soluções aquosas. 
 Mede a diferença de potencial elétrico entre um eletrodo indicador, que é sensível 
aos íons H+ presentes na solução a ser testada, e um eletrodo de referência, no 
qual a concentração de íons H+ é conhecida. 
 Usado no controle de qualidade da água, de bebidas 
fermentadas, como a cerveja e o vinho, na determinação 
do pH de soluções de uso experimental etc.
pHmetros
1. Imerge-se o eletrodo na solução;
2. Íons H+ presentes na solução atingem o bulbo 
de vidro, no eletrodo;
3. É criado um potencial eletroquímico ao longo 
da estrutura; 
4. A diferença de potencial gerada é convertida 
em unidades de pH.
pHmetros
Fonte: <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/36/201107_pHmeter.png>
Uma solução apresenta pH = 3,0. Assinale a alternativa correta a respeito 
dessa solução:
a) A concentração de OH- na solução é maior do que a concentração de H+.
b) A solução é básica.
c) A concentração de íons H+ na solução é 10-3 mol/L.
d) Ao entrar em contato com a solução, o papel de tornassol adquire a cor azul.
e) Todas as alternativas acima estão corretas.
Interatividade
Resposta
Uma solução apresenta pH = 3,0. Assinale a alternativa correta a respeito 
dessa solução:
a) A concentração de OH- na solução é maior do que a concentração de H+.
b) A solução é básica.
c) A concentração de íons H+ na solução é 10-3 mol/L.
d) Ao entrar em contato com a solução, o papel de tornassol adquire a cor azul.
e) Todas as alternativas acima estão corretas.
ATÉ A PRÓXIMA!