apostila biotecnologia

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BIOTECNOLOGIA
Tânia T. S. Ticom
Rio de Janeiro
, -
Indlce
I - Introdução
1.a - Histórico
I.b - As definições da Biotecnologia
I.c - Aplicações
11 - Agentes biológicos
lI.a - As células e os cromossomos
lI.b - Os microrganismos
11.c - As enzimas e os anticorpos
lI.d - Os ac. Nucleicos e os genes
01
01
03
03
04
04
05
08
10
111 - Elementos da enzimologia
III.a - Termodinâmica e cinética das reações
111.b - Enzimas
10
10
12
IV - Caminhos metabólicos 17
V - Processos fermentativos
V..a- Introdução
V.b - Linhagens industriais
V.C- A escolha da matéria-prima
V.d - Os processos tradicionais
V.e - Os processos submersos
V.f- A recuperação do produto
28
28
30
30
30
31
34
VI - Biotecnologia na produção de alimentos 35
Anexos 51
BIOTECNOLOGIA
I -Introdução
I.a - Histórico
Processos biotecnológicos vêm sendo utilizados na produção de vários bens,
principalmente alimentos, desde a mais remota antigüidade. Basta, neste particular, fazer
referência ao preparo de bebidas fermentadas a partir de cereais na Babilônia e no Egito
(8.000 a 6.000 anos a.c.), à produção de pão, utilizando fermentos, no Egito (4.000 anos a.c.)
e à produção de vinhos na Grécia (2.000 a.c.).
No início do século XIX, a demanda de mão-de-obra por uma indústria incipiente
estimula a migração da população do campo para a cidade. O progresso exige processos
industriais mais eficientes.
A .partir de 1850 surgem novas áreas do conhecimento; nascem a Microbiologia, a
Imunologia, a Bioquímica e a Genética.
Deve-se a Ereky (1919) a primeira definição de biotecnologia, como "a ciência e os
métodos que permitem a obtenção de produtos a partir de matéria-prima, mediante a
intervenção de organismos vivos".
O século XXassiste a um desenvolvimento extraordinário da ciência e da tecnologia. Da
convergência entre ambas resultam logros extraordinários em vários setores produtivos, onde
os seres vivos constituem a base de itens tão diversos, como a produção de variedades
vegetais mais produtivas, a fabricação de novos alimentos, o tratamento do lixo, a produção
de enzimas e os antibióticos.
A divisória entre a Biotecnologia Clássica e a Biotecnologia Moderna é uma série de
experiências realizadas por H. Boyer e S. Cohen, que culmina em 1973 onde se tornou possível
mudar o programa genético de um organismo, transferindo-lhe genes de outra espécie.
Na passagem de uma biotecnologia de laboratório a uma biotecnologia industrial, a
engenharia genética ocupa um lugar de destaque como tecnologia inovadora. Entretanto, a
manipulação gênica não é a única ferramenta disponível.
A Biotecnologia tem por base vários ramos do conhecimento que poderiam ser
classificados de FUNDAMENTAIS(como, por exemplo, Bioquímica, Fisiologia, Genética,
Microbiologia, Virologia, Botânica, Zoologia, Ecologia) ao lado de outros que poderiam ser
agrupados sob a denominação genérica de ENGENHARIAS(principalmente a Engenharia
Química).
z.
Cronologia de alguns Fatos Marcantes na HistÓria da Biotecnologia
IDADE CONiTEMPORÃNEA
1863 a 1886
1897
1910
1912 a 1914
1916
1919
1933
1936
1938
1944
1961
1968
1973
1981
1989
1995
1998
1999
Pasteur identifica a levedtlra como o agente responsável pela
fermentação alcoólica (1876), usa microrganismos atenuados para
obter vacinas contra o antraz e a cóler:a' (1881)" faz os primeiros
testes de uma vacina contra a raiva (1881).;paralelamente, Koch
inida o desenvolvimento de técnicas fundamentais para o estudo dos
microrganismos (1876), e enuncia quatro postulados sobre os
agentes infecciosos como catlsa de doer;1ças. .Em 1865 Mendel
apresenta o seu trabalho "Experiências de hibridizaçãoem plantas"
Büchner mostra. que . enzimas extraídas da levedura podem
transformar'açÚcar em álcool.
Em Manchester, na Inglaterra, começa, a introdução de sistemas de
purifica,ç~o,deesgoto baseados na atividade mic:robi~lAa.
Rhõm obtém a patente de uma preparaçãoenzimática'para o lavado
de rotlpas:'Weizmann consegue a produção,de ~cetona e butanol por
microrganismos.
Consegue-se imobilizar enzimas facilitando sua utilização em
processosinc:lustriais. . .
O engenheiro agrícola húngaro Ereky utiliza pél?, primeira vez a
palavra biotecnologia.
Comercialização do milho híbrido, isto éí de sementes de um milho
. mais prodtltivo... -
Obtenção de. ácido cítrico por fermentação.
Na França, produção comércial de um biopesticida (Bacillus
thuringiensis).
Produção em grande escala da penicilina (d~scoberta por Fleming em
1928, desenvolvida por Florey eChain).
É descoberto o código genético. Desenyolyimento de uma protease
alcalina para uso emsab6es para o lavado de: roupas pela empresa
dinamarquesa Novo.
Produção industrial de aminoácidos utilizando enzil'nas imobilizadas.
Havendo desénvolvido técnicas. de corte e reunião doDNA, Cohen e
Boyer, tranferem um'gene a um organismocde outra espécie.
Lançado no Brasil um programa de prodtlção de álcool a partir de
biomassa (Pro-álcool).
Obtenção da primeira planta geneticamente modificada.
Com a criação do National Center for Human Genome Research se
inicia o mapeamento do genoma humano.
Decifra-se o primeiro genoma de uma bactéria, Haemophilus
influenzae.
Células-tronco embrionárias são utilizadas para regenerar tecido.
Seaüenciamento do Drimeirocromossomo humano.
I.b - As definições de "Biotecnologia"
o impacto causado pelas primeiras experiências de Engenharia Genética levou a
numerosas tentativas de redefinição do campo da Biotecnologia. Mediante a substituição da
expressão "intervenção de organismos vivos" por "utilização de processos celulares e
moleculares" tratou-se de diferenciar a Biotecnologia clássica da moderna.
Por outro lado, como a definição de um setor de atividades depende dos interesses dos
grupos envolvidos, muitas vezes reflete-se a visão dos setores profissionais predominantes.
Entre as definições encontradas com maior freqüência, estão as seguintes:
"A aplicação dos princípios da ciência e da engenharia ao tratamento de matérias por agentes
biológicos na produção de bens e serviços".
"Biotecnologia, de uma forma abrangente, inclui qualquer técnica que utiliza organismos vivos
(ou partes deles) para obter ou modificar produtos, melhorar plantas e animais, 'ou
desenvolver microrganismos para usos específicos".
"A utilização de sistemas celulares para a obtenção de produtos ou desenvolvimento de
processos industriais".
"O conjunto de processos industriais que englobam processos tecnológicos".
Consideraremos a biotecnologia de uma maneira ampla, definida como uma atividade
baseada em conhecimentos multidisciplinares, que utiliza agentes biológicos para fazer
produtos úteis ou resolver problemas.
Ciênciae tecnologia
I
CONHECIMENTOS
Células.OI'ganelas.moléculas
I
AGENTESBIOLÓGICOS
~~,~.l'
FAZERPRODUTOSÚTBS RESOLVERPROBLEMAS
I.c - Aplicações
A Biotecnologia encontra muitas aplicações importantes nas seguintes áreas de atividade:
. Agricultura
Pecuária
Saúde
Preservação do meio ambiente
Indústria
Energia
Alimentação
....
Pecuária
Tipos de Produtos ou Serviços
Etanol, biogás e outros combustíveis.
Butanol, acetona, glicerol, ácidos, vitaminas etc. Numerosas enzimas para
outras indústrias (têxtil, detergentes etc.).
Recuperação de petróleo, biorremediação (tratamento de águas servidas e de
lixo, eliminação de poluentes).
Adubo, silagem, biopesticidas, biofertilizantes, mudas de plantas livres de
doenças, mudas de árvores para reflorestamento. Plantas com características
novas incorporadas (transgênicas): maior valor nutritivo, resistência a pragas e
condições de cultivo adversas (seca, salinidade, etc.).
Embriões, animais com características novas (transgênicos), vacinas e
medicamentos para uso veterinário, hormônios.
Panificação (pães e biscoitos), Laticínios (queijos, iogurtes e outras bebidas
lácteas), bebidas (cervejas, vinhos e be~idas destiladas) e aditivos diversos
(shoyu, monoglutamato de sódio, adoçantes, etc.); proteína de célula única
PUC)para rações, alimentos de origem transgênica com propriedades novas.
Antibióticos e medicamentos para diversas doenças,hormônios, vacinas,
reaaentes e testes Dara diaanóstico. etc.
Meio
Ambiente
Agricultura
Alimentação
Saúde
11 - Agentes Biológicos
II.a -As células e os cromossomos
Um dos primeiros testes de diagnóstico genético está baseado na observação
microscópica dos cromossomos de células somáticas durante a divisão celular (mitose). Os
testes de diagnóstico genético envolvendo a análise de cariótipos estão amplamente difundidos
na prática médica.
Células vegetais cultivadas in vitro produzem substâncias de alto valor agregado,
importantes para as indústrias alimentar, cosmética e farmacêutica.
A síntese de algumas substâncias importantes para a indústria farmacêutica, como o
fator ativador de plasminogênio, depende do cultivo in vitro de células animais. Estas também
substituem os animais nos testes toxicológicos, e se utilizam na multiplicação de vírus para a
preparação de vacinas. Também possibilitam a produção de anticorpos.
Combinando as técnicas de cultivo celular com o desenvolvimento de materiais biológicos
semelhantes ao colágeno, uma área nova de engenharia de tecidos visa a reparação ou
substituição de tecidos lesionados.
Vegetais-[
Indústria aliment:ar e cosmética
(Adoçantes. cOI'8ntes. flavorizantes e aromatizantes)
Indúst:ria farmacêutica
rAlcalóides e ester6idesJ
Es1:udos toxicológicDS
Animais
ou
Humanas
Diagnóstico clínico
(Cariótipos)
Indúst:ria farmacêutica
(Produção de anticorpos. soros e vacinas)
Medicina regenerativa
(Produção de tecidos de substituição)
II.b - Os microrganismos
As bactérias
A participação das bactérias na reciclagem dos elementos é fundamental do ponto de
vista ecológico, possibilitando o tratamento de resíduos e de águas servidas e, também, a
eliminação de compostos recalcitrantes (biorremediação) ou a extração de minérios
(biolixívia). Por outro lado, a fixação de nitrogênio e a produção de toxinas pesticidas
contribuem para melhorar as práticas agrícolas.
Devido a suas propriedades metabólicas, muitas eubactérias são utilizadas na produção
de alimentos (laticínios, vinagre, picles e azeitonas) e de aditivos (vitaminas, aminoácidos,
gomas emulsificantes e estabilizantes), na indústria química (acetona, butanol e plásticos
biodegradáveis) e na indústria farmacêutica (vacinas, toxinas e antibióticos). Também se
utilizam na produção de enzimas para uso industrial e médico.
Nos últimos anos tem-se acelerado a prospecção de arqueobactérias com propriedades
potencialmente interessantes para serem utilizadas em processos industriais que exijam
condições ambientais extremas.
Meio ambiente
. (fratamentoderesíduosedeáguasservidas.biorremediação.
extraçãodeminério)
Energia
[Produçãodebiogás)
Indústriaquíinica
[Acetona.butanol.ácidoláctico.ácidoacético.enzimasindustriais)
Agricultura
[FIXaçãodenitrogêniõ.biopesticidasJ
Alimentos e rações
(laticínios.vinagre. picles.azeitonas.silagemJ
Indústria alimentar
[vitamina812e!3-caroteno;amínoácidoslisinaeácidoglutâmico;
polissacarídeosxantanaedextranax)
Indústria Farmacêutica
[Enzimasdeusodoméstico.antibióticos.vacinasetoxinas)
Os Protozoários
De importância fundamental para o ser humano do ponto de vista médico, sua
caracterização molecular pode dar origem a testes diagnósticos e vacinas.
As Algas
Situadas na base das cadeias alimentícias aquáticas, as algas cumprem um papel
fundamental na biosfera por serem capazes de fixar gás carbônico e produzir oxigênio.
Algumas participam na formação de solos e na fixação de nitrogênio.
As macroalgas marinhas são utilizadas na alimentação humanas e também como
adubo. Devido a sua capacidade de formar géis e emulsões, os ficocolóides extraídos delas
(agar, carragenina, alginato) se empregam em análises clínicas (preparação de meios para a
cultura de bactérias e fungos) e em várias indústrias, tais como a alimentícia (sorvetes,
cremes, geléias etc.), a farmacêutica (laxantes, cápsulas de remédios) e a cosmética (cremes,
sabonetes, xampus, dentifrícios etc.).
Em alguns sistemas de tratamento de efluentes, as microalgas se incorporam nos
tanques para remover nutrientes inorgânicos e adicionar oxigênio. Também se usam como
indicadores de poluição.
Um gás combustível (metano) resulta da degradação de biomassa de algas por
microrganismos anaeróbios. E a produção de hidrogênio por algas representa uma alternativa
energética promissora.
As microalgas são utilizadas na alimentação animal como ração para a avicultura e a
aqüicultura. Algumas das substâncias que elas sintetizam se incluem na alimentação humana
como complementos nutricionais; trata-se de aminoácidos, ácidos graxos e vitaminas. Os
ácidos graxos, assim como várias outras substâncias, entram na formulação de cosméticos. E
a indústria farmacêutica se interessa por outros compostos biologicamente ativos, tais como
toxinas, antibióticos, antivirais e antitumorais.
Meio ambiente
[Tratamentodeefluentes,biomonitoramentodepoluição]
.Biomassa Energia
(Biomassa'paraproduçãodeenergia]
Agricultura
!Adubo]
Alimentos e rações
(Alimentaçãohumana,raçãoparaaviculturaeaquacultura]
Moléculas
Indústria de alimentos
!Aditivosespessanteseemulsionantes,
substitutosprotéicosecomplementosnutricionais]
Indús1õriil cosmética
Indús1õria farmacêu1õica
Os Fungos
Pertence a este grupo um dos microrganismos de maior importância econômica:
Saccharomyces cerevisiae, o popular levedo de cerveja (ou simplesmente "levedura") utilizado
tradicionalmente na preparação de alimentos e de bebidas, assim como na produção de etanol,
vitaminas e outros metabólitos. Transformada mediante técnicas de engenharia genética, esta
levedura produz uma vacina contra a hepatite B.
Dentre os bolores destaca-se Aspergil/us niger, um produtor de ácido cítrico.
Neste grupo também se encontra o Penicillium,um gênero que conta com diversas
espécies, uma das quais é utilizada na indústria farmacêutica, para a produção de penicilina, e
outras na indústria de alimentos, para a maturação de queijos como o Roquefort, o Gorgonzola
e o Camembert.
Dentre os cogumelos há os comestíveis como o Agaricus ou champignon, o Shiitake e o
Pleurotus, que são cultivados e comercializados pelo homem.
Os liquens resultam da simbiose entre um fungo e uma alga. O grupo não tem sido
muito explorado economicamente, apesar de se ter encontrado aplicações como corantes e
como fixadores na indústria de perfumes. Também são indicadores de poluição
(biomonitoramento ).
Em contrapartida, outra associação, desta vez entre um fungo filamentoso e as raízes
das plantas vasculares, os micorrizos, ocupa um lugar de destaque na agricultura em solos
tropicais por facilitarem a solubilização dos fosfatos.
Agricultura
(Controlebiológicode insetose nematodes.micornzos)
Indústria químiCa'
(Etanol.g!icerol;ácidocítrico,enzimasindustriais]
Alimentos e rações
(Mii:oproteínal
Indústria de, alimentos
(Fermentodepadaria.panificação.qUeJjaria)
Indústria de bebidas
(Cervejase vinhos:destilados]
Indústria farmacêutica
(Hormôniosdecrescimentovegetal.antibióticos.
vitaminas,vacinas.esteróides)
Os Vírus
Como parasitas obrigatórios de bactérias, plantas ou animais, ao infetar uma célula viva
passam a utilizá-Ia para sua própria reprodução. Alguns se integram no genoma da célula
infetada (bacteriófagos, retrovírus). Devido a esta propriedade, os vírus têm sido utilizados
como vetores para introduzir genes em uma célula hospedeira.
Os vírus que infectam insetos podem ser utilizados no controle de pragas. Na luta
contra a lagarta da soja, o Baculovírus evita a aplicação de 1,2 milhão de litros de inseticidas
por ano nas lavouras brasileiras.
EUBACTERIAS
Bactérias lácticas
Bacillus thuringiensis
Streptomyces
Pseudomonas
Agrobacterium tumefaciens
Bactérias butíricas
Escherichia colí
ARQUEOBACTÉRIAS
Thermos aquaticus
Saccharomyces cerevisiae
Aspergilll.Js
Penicillium
Os gêneros Lactobacillus e Streptococcus são usados na
elaboração de queijos e de iogurtes; no envelhecimento dos
vinhos; na conservação de alimentos; na produção de ácido
láctico. .
Sintetiza uma toxina fatal para as larvasde insetos; inseticidas
biológicos.
Substâncias antibióticas (streptomicina, tetraciclina,
eritromicina), antirungicas (nistatina), herbicidas, antitumorais e
supressoras de rejeição a transplante. /
Eliminação de poluente; quebram moléculas de hidrocarbonetos
existentes em derramamento de petróleo; removem o mercúrio
aquático..
Utilizada na engenhària genética de vegetais.
Na rndústria têxtil Clostridium butiricum. C/ostridium
acetobutyricum se utiliza. na produção industrial de acetona e
butanol. C/ostridium botulinum, toxina botulínica é utilizada em
concentrações muito peqlienas para reduzir as rugas e marcas
de expressão durante um-certo tempo (efeito cosmético).
IAdispensáwel para estudos bioquímicos e genéticos, incluindo a
Engenharia Genética. A introdução de transgenes em Escherichia
coli K12,.uma linhagem inofensiva de laboratório, possibilitou os
primeiros' processos de produção de insulina, de interferon e de
hormô'Oiode crescimento..,
Esta ba.ctéria produz umaenzima que copia o DNA a uma
temperatura alta;. PCR.
TransfQrmam'ô acetátoem metano. um
Utilizada na" preparàçã6- de alimentos (pão, biscoitos, fermento
de padaria) e de bebidas (cerveja, vinho e. destilados) assim
como na produção de outras substâncias de impotância
indústrial (etanol, vitaminas e outros metabólitos)
A. Niger.é utiJizada na produção de ácido cítrico ou de enzimas.
Algumas espécies se utilizam na indústria farmacêutica
(penicilina) ou indústria de alimentos (queijos "azuis" como o
roquefort e o gorgonzola; queijo camembert).
Enzimas
lI.c - Asenzimas e os anticorpos
As enzimas apresentam numerosas vantagens como agentes biológicos em processos
tecnológicos: especificidade, operação em condições facilmente controláveis e
biodegradabilidade. De um modo geral, os tratamentos enzimáticos diminuem a carga
poluidora dos efluentes industriais.
Das 25.000 enzimas que, segundo as estimativas, existiriam na natureza, até o
momento só foram classificadas umas 2.800, sendo comercializadas 400. O mercado se
distribui fundamentalmente entre as proteases (59%), as carboidrases (28 %) e as lipases
(3 %), três grandes conjuntos de enzimas que são utilizadas por diversas indústrias; o 10%
restante do mercado corresponde às enzimas analíticas e farmacêuticas.
9
Indústria de alimentos e bebidas
(Clarificaçãodevinhose sucosdefrutas: tratamento do amidoem substituição
do malteadona elaboraçãode cervejas.fabricaçãode pão,biscoitoe bolachas,
produçãode adoçantes.fabricação'delaticínios.suplementaçãode raçõesanimais).
Produtos de limpeza
(Detergentese Iava-roupasparaa remoçãodemanchasdifíceis,produtos para
limpardentadurase lentes de contato).
Indústria têxtil
IDesengornagemdetecidos, acabamentode jeansJ
Curtumes
lAmaciamentode couros)
Indústrias de papel e celulose
!Branqueamentode polpade celulose)
Indústria farmacêutica
(Reagentesparausoemanálisesclínicase paraa manipulaçãogl!nica).
Tratamentos médicos
lCombatedeinftamllÇÕes,edamas,e lesões:dissolventesde coágulossanguíneos;
agentesterapêuticasem transtomos digestivosJ.
Anticorpos
Os anticorpos ocupam um lugar de destaque nos testes de diagnóstico clínico, por
reunir duas propriedades que os transformam em uma ferramenta ideal: especificidade e
diversidade.
Anticorpos específicos fixados nas partículas de uma coluna de afinidade permitem
separar moléculas de uma mistura que circule por ela. Outra utilização extremamente
engenhosa está na separação de populações celulares em um aparelho denominado Rcel!
sorter". As células são marcadas com anticorpos ligados a uma molécula fluorescente; ao
passar através de raios laser adquirem cargas elétricas, sendo separadas mediante uma placa
defletora do equipamento.
A visualização da reação entre o antígeno e o anticorpo se vê facilitada quando estes
últimos recebem alguma marcação. Em cortes histológicos, o antígeno é localizado pelos
anticorpos acoplados a uma molécula fluorescente que possa ser identificada
microscopicamente.
Nos ensaios imunoenzimáticos, utilizam anticorpos acoplados a uma enzima que reage
com seu substrato formando um produto colorido podendo ser utilizado como reagente para
diagnósticos clínicos.
Ferramenta no laboratório
(Purificaçãode moléculas. reagentes)
-~~-~
- ~--'~r
ANTlCORPPS~
Diagnósticos
! ..~~
TratamentDs
(lmunoterapias)
II.d - Os ácidos nucléicos e os genes
A Genômica
o termo genoma designa o conjunto completo de cromossomos haplóides que contém
toda a informação genética de um indivíduo.
Em 1990 teve início o Projeto Genoma Humano (HGP, Human Genome Project), um dos
projetos científicos mais ambiciosos já realtzados, envolvendo pesquisadores de mais de 18
países na tarefa de mapear e seqüenciar o DNAhumano e também o de outros organismos.
O plano Genoma não teria ido adiante sem o desenvolvimento da Bioinformática, um
conjunto de novas tecnologias que utiliza métodos computacionais e matemáticos para o
seqüenciamento dos genes.
A genômica tem aplicações imediatas no campo médico e farmacológico, através dos
testes genéticos e dos novos medicamentos.
Paralelamente ao mapeamento do genoma humano, 'mais de 800 outros organismos
foram também estudados (microrganismos, plantas, animais). O número de genomas
conhecidos aumenta continuamente, fornecendo uma informação que em curto ou médio prazo
se reverterá também no desenvolvimento da agricultura, da pecuária e da indústria química.
Identificação de microrgani5mo5 patogênicos
Controle de qualidade de alimentos
Medicina molecular
!Diagnósticos. tljltamentos personalizados. terapias gênicas)
Testes genéticos
!Diagnósticos.avafiaçãodosriscosdesaúde)
Indústria farmacol6glca
INovasmedicamentos.soboimpactodagenômicaedaproteômica)
Prática forense
(Identificaçãodaspessoas)
Estudos antropol6gicos e evolutivos
III - Elementos de Enzimologia
111.a - Termodinâmica e Cinética das reações
Uma transformação, representada, por exemplo, por uma reação química, pode ser
analisada sob dois aspectos fundamentais: a variação de energia envolvida (a tea.odinâmica
da transformação) e a velocIdade com que ocorre (a cinética da reação).
Em relação ao aspecto energético, só interessam os estados inicial e final da
transformação, não importando o processo pelo qual ela se dá ou a velocidade com que
ocorre. Nas transformações em que há liberação de energia, o sistema que sofreu a
transformação tem, no estado final, um conteúdo energético menor do que o do estado inicial;
estas transformações são ditas espontâneas, O grau de espontaneidade das transformações é
avaliado pelo valor da diferença de energia entre os estados inicial e final. A expressão
"espontânea", quando aplicada a reações químicas, precisa ser bem compreendida. O fato de
uma reação ser espontânea não significa que ela ocorrerá imediatamente, tão logo se ponham
em contato os reagentes; significa, tão-somente, que, se ocorrer, haverá liberação de energia.
Em outras palavras, a espontaneidade da reação está completamente desvinculada de
parâmetros cinéticos, como a velocidade. A reação de oxidação de glicose por oxigênio é
-;
espontânea, por liberar energia quando ocorre. Entretanto, é possível manter glicose em
contato com oxigênio sem que ocorra reação em tempo mensurável. Neste caso, a reação é
espontânea, mas sua velocidade é praticamente igual a zero.
Em resumo: Qualquer reação química é acompanhada de uma variação de energia livre,
que corresponde à diferença entre o conteúdo energético dos produtos e reagentes (~G).
Representação esquemática de uma reação: A+B - C+D
R-P
Quando ~G é negativo a reação é espontânea (P< R). Quando ~G é positivo a reação
não é espontânea (P> R).
Reação espontânea é aquela que pode realizar trabalho útil - Há liberação de energia
.no sistema. O conteúdo energético do produto é men~r que o do reagente.
~G =- 2870 kJjmol
Nos parâmetros termodinâmicos, os organismos não podem interferir. Como será visto
adiante, sua intervenção incide exclusivamente sobre o aspecto cinético, isto é, sobre a
velocidade das reações.
A maior parte das reações químicasprocessadas nos organismos são complexas, por
envolverem pelo menos três moléClilasdiferentes e por serem, geralmente, reverSíveis.
Nesses casos, a velocidade da reação é explicada pela teoria das colisões. Essa teoria
estabelece que, para reagir, as moléculas presentes em uma solução devem colidir com
orientação apropriada e que a colisão deve levá-Ias a adquirir uma quantidade mínima de
energia que Ihes permita atingir um estado reativo, chamado estado de transição. Para levar
todas as moléculas de um moi de uma substância até o estado de transição, necessita-se de
uma quantidade de energia definida como energia de ativação. Essa energia é, portanto, a
barreira que separa os reagentes dos produtos. A decorrência direta desse modelo é que a
velocidade das reações pode ser aumentada pelo menos de três maneiras diferentes: (1)
aumentando o número de moléculas em solução, ou seja, sua concentração, como previsto
pela equação da velocidade; (2) aumentando o número de choques entre as moléculas; (3)
diminuindo a barreira imposta pela energia de ativação.
A redução no vaJor da energia de ativação pode ser obtida pela presença de
catalísadores, compostos capazes de aumentar a velocidade da reação sem alterar a proporção
entre reagentes e produtos encontrada no final da reação e sem serem efetivamente
consumidos durante o processo. Podem, portanto, atuar em quantidades mínimas, ditas
catalítícas, várias ordens de grandeza menores do que a concentração dos reagentes. O
catalisador participa efetivamente da reação, sofrendo alterações de sua estrutura química
durante o processo; invariavelmente, porém, retoma à sua forma original no final da reação.
O processo pejo qual os catalisadores aceleram uma reação química consiste em criar
um novo RcaminhoRde reação, para o qual a energia de ativação requerida é menor.
Estado de
ltansição
~
Energia
- h - ~.
I
sem
- E com catalisador
Reage;;tes - - - - - - :r.~..!...aJ~- -
Produtos
Caminho da reação
12.
III.b - Enzimas
A manutenção da vida celular depende da contínua ocorrência de um conjunto de
reações químicas, que devem atender duas exigências fundamentais: precisam ser altamente
específicas, de modo a gerar produtos definidos, e devem ocorrer a velocidades adequadas à
fisiologia celular.
Praticamente todas as reações químicas que se processam nos organismos são
catalisadas. Os catalisadores biológicos são proteínas chamadas enzimas. A catálise das
reações biológicas é imprescindível para a conservação e reprodução dos seres vivos, uma vez
que a maioria das reações químicas que ocorrem nos organismos têm, na ausência de
catalisadores, velocidades muito baixas. É comum encontrarmos nas células reações que, na
ausência de catalisadores, demoram várias horas, dias ou anos para completarem-se ou têm
velocidades iguais a zero, quando medidas em tempo finito. Por exemplo, a oxidação de
glicose a C02 tem velocidade praticamente nula: pode-se conservar uma solução de glicose
em contato com o oxigênio do ar por muito tempo, sem que sua concentração sejç:l
perceptivelmente alterada. Nas células, entretanto, graças à presença de enzimas, a reação
completa-se em minutos. O fato de muitos microrganismos multiplicarem-se com velocidades
de divisão menores do que uma hora, só é possível pela catálise de suas reações. De fato, as
reações catalisadas por enzimas têm velocidades muito altas, entre 106 a 1012vezes maiores
que as reações não catalisadas e algumas ordens de grandeza maiores que as reações
catalisadas por catalisadores inorgânicos.
Além disso, as enzimas apresentam sobre os catalisadores inorgânicos outras
vantagens. Graças à sua estrutura complexa, podem apresentar um alto grau de
especificidade, propriedade ausente nos catalisadores inorgânicos e, portanto, sua presença
permite a seleção das reações que poderão ocorrer em um organismo, ainda que milhares de
compostos diferentes estejam presentes no interior das células. É também devido às
propriedades estruturais das proteínas que a regulação da atividade enzimática se processa,
permitindo um ajuste contínuo da velocidade da reação catalisada às condições celulares
vigentes. Além disso, as enzimas são, geralmente, sintetizadas nas próprias células onde
atuam e sua concentração celular também está sob rígido controle.
Resumindo, as enzimas (1) diminuem a energia de ativação, levando a altas
velocidades de reação, (2) são muito específicas, (3) são sintetizadas pelas próprias células
onde atuam, (4) têm concentração celular variável, de acordo com as condições fisiológicas e
(5) podem ter sua atividade modulada, permitindo um ajuste fino do metabolismo ao meio
ambiente. O conjunto desses aspectos favoráveis justifica o alto investimento energético
necessário para a síntese de enzimas e possibilita a manutenção da vida como a conhecemos.
Estrutura das enzimas
A melhor compreensão das características e propriedades das enzimas depende do
conhecimento de sua estrutura. As enzimas são proteínas globulares e, como todas as
proteínas, são heteropo1ímeros de vinte diferentes aminoácídos; algumas incluem em sua
estrutura um componente não-protéico, designado grupo prostético. São macromoléculas, com
peso molecular variando entre cerca de 5.000 até mais de 1.000.000 de dáltons.
A organização espacial da proteína é resultante do tipo de aminoácidos que a compõem
e de como eles estão dispostos uns em relação aos outros. A seqüência dos aminoácidos irá
determinar o tipo de interação possível entre as cadeias laterais. A organização tridimensional
de uma proteína, desde a sequência de aminoácidos, passando pelo enrolamento da cadeia
polipepitídica até a associação de várias cadeias, pode ser descrita em níveis estruturais de
complexidade crescente (primária, secundária, terciária e quaternária).
Ação catalítica das enzimas
A partir da estrutura protéica pode-se entender melhor as propriedades catalíticas das
enzimas. O primeiro ponto a considerar é a grande diferença de tamanho entre a enzima e
seussubstratos. Umexemplo numérico: a enzima urease, que catalisa a reação de hidróliseda
uréia, tem peso mole eu lar aproximado de 500.000 dáltons, enquanto a uréia tem peso
molecular de 60 e a água de 18. O investimento energético para a síntese de uma molécula
protéica tão grande justifica-se pela obtenção de uma estrutura muito precisa, com
reentrâncias de forma apropriada e com grupos químicos localizados em posições exatas para
servir à catálise. Para que esta seja exercida, os reagentes (aqui chamados substratos) devem
ligar-se à molécula da enzima em uma região específica de sua superfície, chamada sítio ativo.
O sítio ativo é uma cavidade com forma definida, aberta na superfície da molécula globular da
enzima. I constituída por grupos R de aminoácidos que podem estar distanciados na estrutura
primária da proteína, mas que os dobramentos da estrutura terciária trouxeram à proximidade
uns dos outros. É essa forma definida do sítio ativo que confere especificidade à catálise
enzimática: para ser reconhecida como substrato uma molécula deve ter a forma adequada
para acomodar-se no sítio ativo e os grupos químicos capazes de estabelecer ligações com os
grupos R.ali presentes.
A relação espacial entre substrato e enzima não deve ser vista segundo um modelo
rígido de chave-fechadura. A aproximação e a ligação do substrato à enzima altera o delicado
balanço de forças responsáveis pela manutenção da estrutura tridimensional da enzima,
amoldando sua forma à forma do substrato e fazendo-a adquirir uma nova conformação, ideal
para a catálise.
A B c D
D + o + o
Inibição da atividade enzimática
A catálise enzimática pode ser impedida por compostos, que, quando presentes no
meio, ligam-se diretamente à enzima, impedindo sua ação. Existem basicamente dois tipos de
inibidores: competitivos e não-competitivos.
Os inibidores competitivos são substâncias que têm forma estrutural suficientemente
semelhante à do substrato para poderem ligar-se ao sítio ativo da enzima. Faltam-Ihes,
entretanto, grupos químicos que pudessemlevar a reação a cabo; o resultado da sua presença
no meio de reação é o estabelecimento de uma competição entre as moléculas do inibidor
competitivo e as do substrato pela ligação com o sítio ativo da enzima.
Os inibidores não-competitivos têm mecanismo de ação completamente diverso. Sua
forma estrutural não guarda qualquer semelhança com a do substrato e a inibição é exercida
pela sua capacidade de ligar-se a grupos R específicos, geralmente fora do sítio ativo. Essa
ligação, altera a estrutura da enzima, impedindo a catálise.
Os inibidores competitivos, pela sua especificidade têm tido largo emprego terapêutico
e constituem um instrumento potencialmente interessante no controle de vias metabólicas. A
presença de inibidores não-competitivos nos organismos é, geralmente, acidental.
Influência do meio sobre a atividade enzimática
A estrutura e a forma do sítio ativo são uma decorrência da estrutura tridimensional da
enzima e podem ser afetadas por quaisquer agentes capazes de provocar mudanças
conformacionais na estrutura protéica. Isso toma a atividade enzimática dependente do meio
ambiente, notadamente do pH e temperatura.
A maioria das enzimas apresenta um valor de pH para o qual a sua atividade é máxima
- a velocidade da reação diminui à medida que o pH se afasta desse valor ótimo, que é
característico para cada enzima mas, com freqüência, está próximo do pH neutro.
A influência do pH sobre a catálise enzimática é exercida sobre os grupos dissociáveis
de vários aminoácidos. Alguns desses grupos podem fazer parte do sítio ativo ou serem
importantes na manutenção da estrutura espacial da molécula. A cada valor de pH, alguns
desses grupos apresentam-se protonados ou desprotonados. Existe uma concentração
hidrogeniônica que propicia um determinado arranjo de grupos protonados e desprotonados,
que leva a molécula de enzima à conformação ideal' para exercer seu papel catalítico. Esse pH
ótimo depende, portanto, do número e tipo de grupos ionizáveis que uma enzima apresenta,
ou seja, depende de sua estrutura primária. Por outro lado, quando o substrato contém grupos
ionizáveis, as variações de pH também poderão afetar sua carga. A eficiência da catálise
dependerá, então, de encontrarem-se, enzima e substrato, com conformação e carga
adequadas para permitir sua interação.
A influência da temperatura sobre a cinética da reação enzimática deve ser entendida
em duas fases distintas: em princípio, aumentos de temperatura levam a aumentos de
velocidade de reação, por aumentar a energia cinética das moléculas componentes do sistema,
aumentando a probabilidade de choques efetivos entre elas. Esse efeito é observado em um
intervalo de temperatura compatível com a manutenção da estrutura espacial da enzima.
Temperaturas mais altas levam à desnaturação da enzima, ou seja, à perda de sua estrutura
nativa, catalítica, por alterarem as ligações químicas que mantêm sua estrutura tridimensional.
Rompidas as pontes de hidrogênio, que são ligações bastante termolábeis, desencadeia-se
uma cascata de alterações estruturais, levando a enzima a uma nova conformação ou a um
estado sem estrutura definida; a enzima é dita, então, desnaturada. A temperatura que
provoca desnaturação naturalmente varia para cada enzima mas, geralmente, está pouco
acima de sua temperatura ótima.
A desnaturação protéica é entendida como a perda da estrutura que propicia a função
da proteína. Habitualmente, os agentes desnaturantes preservam apenas as ligações
covalentes da estrutura protéica, ou seja, as ligações peptídicas (da estrutura primária) e as
pontes dissulfeto (da estrutura terciária). Não só temperaturas elevadas levam à
desnaturação. Outras variáveis do meio que afetam as ligações químicas têm o mesmo efeito.
Assim, valores extremos de pH, provocando protonação ou desprotonação de grupos,
ocasionam perda da atividade da enzima. Os detergentes contêm porções hidrofóbicas em
suas moléculas e sua presença em solução interfere fortemente nas interações hidrofóbicas
entre os grupos R, importantes na manutenção da estrutura protéica. Solventes apoIares,
mudando a constante dielétrica do meio, alteram a força das ligações eletrostáticas,
provocando desnaturação. Na maior parte dos casos, a desnaturação é um processo
irreversível.
Co-fatores e coenzimas
Muitas enzimas necessitam da associação com outras moléculas ou íons para exercer
seu papel catalítico. Esses componentes da reação enzimática são genericamente chamados
co-fatores. Os co-fatores podem ser íons metálicos ou moléculas orgânicas, não protéicas, de
complexidade variada, que recebem o nome de coenzimas.
Os íons metálicos ligam-se a grupos R de aminoácidos da cadeia protéica ou estão
presentes em grupos prostéticos. Cumprem papel decisivo na catálise, participando
efetivamente da reação. química. Algumas enzimas aceitam vários íons metálicos bivalentes
como ativa dores, como Ca2+,Mg2+ou Mn2+,enquanto outras exigem um íon específico para a
catálise. Esse íon pode ser de Fe ,Cu, Ni,Co, Zn, Se ou de outros metais.
As coenzimas atuam como aceptores de átomos ou grupos funcionais retirados do
substrato em uma dada reação e como doadores destes mesmos grupos ao participarem de
uma outra reação e, por isto, diz-se que as coenzimas são transportadoras de determinados
grupos. Durante a catálise, coenzima e substrato acham-se alojados no centro ativo da
enzima, consistindo a reação na remoção de determinado grupo químico do substrato e sua
transferência para a coenzima, ou vice-versa. Vê-se, portanto, que as coenzimas não apenas
sofrem modificações em sua estrutura ao participar de uma reação enzimática, mas são
necessárias em quantidades estequiométricas em relação ao substrato. Todavia, o fato de as
coenzimas estarem sendo constantemente recicladas, oscilando entre apenas duas formas,
permite que suas concentrações celulares possam ser bastante reduzidas, muito menores do
que as concentrações de substrato.
COENZIMA
Adenosina trifosfato (ATP)
Blotina
Coenzima A
Flavina adenina dinucleotídeo (FAD)
Tetraidrofolato
Nicotinamida adenina dlnucleotídeo (NAD+)
Tiamina pirofosfato (TPP)
GRUPO TRANSPORTADO
Fosfato
C02
Acila
Hidrogênio
Carbono
Hidreto
Aldeído
Nem sempre é imediata a diferença entre substrato e coenzima. No entanto,um critério
diferencial é o fato de o substrato sofrer novas alterações nas reações metabólicas
subseqüentes, enquanto a coenzima, através de outra reação, volta à sua forma original.
Em alguns casos, a coenzima encontra-se covalentemente ligada à molécula
enzimática, constituindo, portanto, um grupo prostético da proteína; em outros casos, a
coenzima é uma molécula "livre", reunindo-se à enzima apenas no momento da catálise.
. A estrutura química das coenzimas é bastante variável. Algumas coenzimas,como o ATP
e o GTP (guanosina trifosfato), são integralmente sintetizadas pelas células. Outras
apresentam em sua molécula um componente orgânico que não pode ser sintetizado pelos
animais superiores. Esse componente, ou um precursor imediato, deve então ser obtido
através da dieta, constituindo uma vitamina.
Na Microbiologia as vitaminas incluem-se entre os compostos que, genericamente, são
chamados de fatores de crescimento, assinalando a necessidade de sua presença do meio de
cultura para o desenvolvimento do microorganismo.
Medida da atividade enzimática
As medidas de concentração de soluções, expressas em unidades de massa por
unidades de volume, de uso corrente na Química, não têm aplica ção para soluções
enzimáticas, já que para estas o que importa não é a massa, mas a atividade. Uma solução de
enzimas desnaturadas conserva a massa protéica mas a propriedade catalítica está perdida.
Desnaturações parciais podem levar duas soluções de mesma concentração enzimática a ter
atividades muito diferentes.
Em virtude do exposto, a dosagem de enzimas é sempre feita através da medida de sua
atividade, que é avaliada pela velocidade da reação que a enzima catalisa. Dada a
especificidade das enzimas, essa medida é possível, mesmo na presença de outras proteínas.Para efetuar essas dosagens, uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com
concentrações altas de substratos (para garantir a velocidade máxima e impedir que pequenas
variações na concentração do substrato possam afetar as medidas). A velocidade da reação é
medida e expressa em Unidades Internacionais. Uma Unidade Internacional (U) é a quantidade
de enzima capaz de formar lJJmol de produto por minuto em condições ótimas de medida (pH,
temperatura etc.), especificadas para cada caso.
Classificação e nomenclatura
Pelas regras oficiais de classificação e nomenclatura, as enzimas são divididas em seis
grupos, de acordo com o tipo de reação Que catalisam. Cada um desses grupos é ainda
subdividido em classes e subclasses, numeradas de tal forma Que cada enzima possa ser
identificada sem ambigüidade. Assim, por exemplo, a enzima Que cata lisa a remoção de
elétrons do etanol (portanto, uma oxidorredutase) é designada álcoo:NAD+:oxidorredutase e
recebe o número de classificação EC 1.1.1.1. (EC, de Enzyme Comission). Essa nomenclatura
oficial é, na prática, muitas vezes desobedecida, em favor de nomes mais simples ou Que se
tomaram clássicos. Assim, por exemplo, a enzima citada Que catalisa a oxidação do etanol é
comumente referida como álcool desidrogenase; na nomenclatura usual, o nome é dado
indicando o substrato, seguido de uma outra palavra terminada em ase Que especifica o tipo
de reação Que a enzima catalisa.
CLASSE TIPO DE"REAÇÃO
Oxidorredução
1 - Oxidorredutases A- + B A + B-'
1----' ---..,-_-r ----..- .----.--------
2 - Transferases Transferência de grupos
A-X + O A + O-X
1-----'-"". -- -' ,- ..- ._- --
Hidrólise
3 - Hidrolascs
A-B O A-H + B-OH+ +->
.- -.--. - -
Adição de grupos a duplas ligaçõcs ou
remoção de. grupos, deixando dupla ligação
4 - Uases X y
I I A=B ... X-V
A-B
_. ,.-... -?".-'--'--' --.-
Rearranjos intramolecularcs
5 - Isomerases X y y X
I I I I
A-B A-B
.. ---'-------'-' ..-.-...-.-.,-----.. --
Condensação de duas moléculas, associada
6 - Ligases à hidrólise de uma ligação de alta
energia (em geral, do ATI')
A + B A-B
IV - Caminhos metabólicos
Introdução
Todas as reações químicas que acontecem no contexto da célula e, portanto são
reações bioquímicas, são importantes para o aparecimento e continuação da vida sobre a
Terra.
Metabolismo Primário - Denominamos metabolismo o conjunto de reações químicas
de degradação (catabolismo) e de síntese (anabolismo) de substâncias em um organismo. As
primeiras liberam energia, as outras a consomem.
ViaS
CatabóHcas
Nutrientes
liberadores
de energia
Macromoléculas
celulares
Proteínas
Poissacarideos
lipídeos
Ácidos nucIéicos
Carboidratos
Gorduras
Protefnas
. Energia
VIiIS
Anabóracas
Produtos finais
pobres em energia
C02
H20
Mia
Moléculas
precursoras
Amino6cidos
Açúcares
ÁciIos graxos
Bases nitrugenadas
As células e a maioria dos microrganismos retiram dos compostos orgânicos a energia
de que precisa para a manutenção de sua estrutura e para suas atividades. Nas vias
catabólicas, a degradação de compostos orgânicos em moléculas menores libera energia; uma
parte desta será acumulada sob a forma de ATP (trifosfato de adenosina), e a restante,
dissipada como calor.
As principais vias catabólicas são a respiração e a fermentação. A quantidade de
energia liberada e os produtos finais diferem se a oxidação do composto orgânico for total ou
parcial. Na glicólise, a glicose é degradada até uma molécula de três carbonos, o piruvato. Em
presença de oxigênio, a entrada do piruvato no ciclo de Krebs e a fosforilação oxidativa
permitem a quebra total da glicose em C02 e H20 liberando uma grande quantidade de
energia sob a forma de ATP (respiração aeróbia).
Mediante a redução do piruvato ou de algum de seus derivados (fermentação), vários
microrganismos geram-outFas. sub&tâR€ias- orgâRieasr-a€-etORa,n.~. etanol, ácido láctico,
ácido acético, glicerol etc. Estas reações ocorrem geralmente em ambientes onde o substrato é
abundante sendo pequena a quantidade de energia obtida. Dependendo das condições
ambientais, isto é, da presença ou ausência de oxigênio, algumas leveduras e bactérias (assim
como as células musculares) podem respirar ou fermentar.
Na respiração. onde o úmmo aceptor de elétrons ó o oxigênio, a
oxidação de glicose se completa até chegar a CO, e H"O,
pnxIuzindo 36-38 moléculas de ATP.Na fennentaçao, o úmmo
aceptor de elétrons é o piruvatD ou algum outra derivado,
pnxIuzindo 2 ATP.
00,. ",0 e 36 - 38 AIP
Metabolismo Secundário - Além de vias metabólicas primárias comuns a todos os
microrganismos, existem outras secundárias que são específicas. A ativação de umas e/ou de
outras depende do microrganismo e das condições em que ele se desenvolve em seu ambiente
natural ou naquele em que irá ser cultivado.
Os metabólitos primários estão relacionados com o crescimento dos microrganismos e a
transformação de nutrientes em biomassa. Já os metabólitos secundários, mesmo sendo
desnecessários no metabolismo microbiano, permitem a sobrevivência em ambientes
extremamente competitivos que contam com escassos nutrientes.
De um modo geral, quando os microrganismos se desenvolvem em um meio com uma
quantidade limitada de nutrientes, a população passará por diversas fases.
A produçIo de metabóli1Ds.
A) As fases de CI8SCÍmefItO de UJft2 ~ Célulase
meIa.bóIl!Ds primilrios... pooduz2m na fase iDI:...
meta.bóli1Ds secundários...1im da fase iog e Irído da fase
1!5Iae:IoIWta.
Número
da cóIuIas
Faselog
I
I Fase
esI3I:ioMriB
Tempo
I
FaseI
Iag
Fasede
deci1iu
SIAreIaçáo_osmeta_pd_.~nos,Os
nutrientes do meio pOrmib!ma muitiplk:açio - e a
formaçJo do _iIo primário, que pode ....-
pelas células para sinteIilar o metabólilo sec:undm> (a);
esIe pode também sinti!Iizadó din!lamente a partir d.
.~ su.bstAnda do meio (1)).
. Fase lag: período de adaptação em que, apesar de não se multiplicar, os organismos
sintetizam enzimas e constituintes celulares.
. Fase log: a população cresce de maneira exponencial, sendo sintetizados numerosos
metabólitos primários.
. Fase estacionária: devido ao esgotamento dos nutrientes e à acumulação de
excretas, algumas células morrem enquanto outras se dividem. No fim da fase log e
início da fase estacionária começam a ser sintetizados os metabólitos secundários.
. Fase de declínio: em a renovação dos nutrientes, as células morrem em um tempo
variável.
Processos de obtenção de energia
Glicólise
Para obterem ATP a partir de glicose, todas as células lançam mão de sua oxidação
parcial a piruvato. Nas células anaeróbias, a degradação pára neste ponto. A conversão de
glicose a piruvato permite aproveitar somente uma pequena parcela - menos de 10% - da
energia total da glicose, ficando a maior parte conservada como piruvato.
Apesar disso, as células anaeróbias podem suprir, com a degradação parcial, toda sua
demanda energética. Nas células aeróbias, entretanto, o piruvato é subseqüentemente
oxidado, trazendo, naturalmente, um enorme ganho na produção de ATP.
A seqüencia geral das bioquímicas envolvidas no processo glicolítico, está visualizada na
figura abaixo.
Õ
Glucose
«H3
co
I
COOH
Piruvato
ATP+-J@
I--ADP
COOHI
C-O-P.
CH2
PEP
~@
~ Mg2+
2-PGA .
2,3 - OPGA
9H20P
c=o
I
CH20H
POHA
~G)
Glucose - 6 -P
Jt @
. Frutose- 6 - P
@ Jf @
VHPP
Frutose - 1.6 - diP
1l@
@
CHO
I
CHOH
I
... CH20P
Frutose
lG)
@
GA-3P +
0lkNAOH+H ATP
NAD~ ~ 3-PGA
1.3-0PGA~
AOP
2-0
Fermentação
A degradação anaeróbia da glicose é chamadafermentação. Nas bactérias ocorrem
muitos tipos diferentes de fermentações, obedecendo, entretanto, a um padrão comum. A
glicose é sempre convertida a piruvato,.e nesta conversão, como foi descrito, produz-se NADH.
A partir deste ponto as fermentações diferem pelas reações que levam à regeneração do
NAD+. Segundo as enzimas de que a célula dispõe, o piruvato é convertido a lactato, etanol,
propionato, butirato etc. Estas reações têm em comum o fato de produzirem NAD+ e de o
produto final ser excretado para o meio. As fermentações são então diferenciadaspelo produto
final: fermentação lática, alcoólica, propiônica etc. As fermentações são processos auto-
suficientes, ou seja, independem de outras vias por serem capazes de regenerar as coenzimas
que utilizam para a produção de ATP.
Fermentação alcoólica
É um processo anaeróbio para produção de energia, que energia ocorre com
degradação de carboidratos e formação de etanol e COz como compostos principais e, como
subprodutos glicerol, ácidos pirúvicos e succínico e alcoóis superiores. É realizada por
leveduras, principalmente do gênero Saccharomyces e bactérias como a Zymomonas mobilis.
A seqüência das reações é a mesma do processo glicolítico até a formação do piruvato.
A partir de piruvato as seguintes reações ocorrem:
Ação da descarboxilase pirúvica
COOH
I
CO
I
aI3
Piruvato
~ + aIO
I
aI3
Acetaldeído
A descarboxilase pirúvica exige pirofosfato de tiamina (TPP) como co-fator e a atividade
é prejudicada pela presença de sulfito, pois este destrói TPP. A enzima não é altamente
específica atuando sobre outros cetoácidos.
Ação da desidrogenase alcólica
aIO
I
CH3
Acetaldeído
+ NADH + H+
CH20H
~ I
CH3
Etanol
+ NAD
A enzima é inibida por sulfito, porque o acetaldeído forma um composto de adição com
o ânion HS03-.
FORMAÇÃODE GUCEROL: durante a fermentação alcoólica cerca de 5% do açúcar
consumido pode ser convertido em glicerol a partir de um desvio da fosfodiidroxiacetona da
glicólise:
CH20H
I
C=O
I
CH20P
Fosfodiidroxiacetona
+
CH20H
I
NADH + H+ ~ CHOH
I
CH20P
Glicerolfosfato
~
CH20H
I
CHOH
I
CH20H
Glicerol
+ Pi
A formação de glicerol durante a fermentação alcoólica foi explica da por NORDSTROM
como conseqüência da produção de biomassa pelas leveduras, pois é um processo oxidativo
que exige NAD oxidado e também por OURAsegundo o qual a formação do ácido succínico
seria a principal causa da formação do glicerol.
FORMAÇÃODE ÁLCOOIS SUPERIORES:durante o processo de biossíntese de alguns
aminoácidos como valina, treonina, leucina e isoleucina são produzidos cetoácidos
intermediários como descrito por WEBBiINGRAHAM.
Ocorre descarboxilação e redução desses áCidos pela descarboxilase pirúvica e
desidrogenase alcoólica com produção dos álcoois como esquematizado:
~ isoamílico
~ isobutílico
~ amílico ativo
~ n-propílico
Leucina
Valina -
Isoleucina
Treonina
~ alfacetoisocapróico
~ alfacetoisovalérico
~ alfaceto betametilvalérico
~ alfacetobutírico
FORMAÇÃO DE ÁaDO SUCCÍNICO: o ácido succínico é formado durante a fermentação
alcoólica, através da fase oxidativa do ciclo de Krebs:
Piruvato ~ Aceti1-CoA
Oxaloacetato + Acetil-CoA ~ atrato
~
Isocitrato
~ -7 NADH
Alfacetoglutarato
~-7 NADH
Succini1-CoA
~
Succinato
Como em meio anaeróbio não há formação de mitocôndrias ativas, a desidrogenase
succínica não apresenta atividade e portanto acumula-se succinato.
Fermentação lática
As bactérias lacticas homofermentativas como Lactobacillus acidophilus, L. lactis, L.
delbrueckii, Streptococcus thermophilus e Pediococcus damnosus fermentam glicose, frutose,
galactose, manose, lactose com produção de ácido lático através da seqüência glicolítica.
Como o meio é anaeróbio, há necessidade de regeneração de NADpela desidrogenase lática:
glicólise
glicose - - - pirúvico+ NADH + H+ . LACTATO
No processo heterofermentativo pode ocorrer, dependendo da espécie envolvida,
produção de lactato, etanol, gás carbônico e acetato. A formação de etanol pode ser
esquemati~ada pelas reações:
glicose ~ glicOSEH>P
~ xilulose-SP
~ 6P-gluconato ~ ribulose-SP
ribulose-SP ~
acetil-P04
..
acetil-CoA
..
acetaldeido
..
ETANOL
+ Ga-3P
Alguns subprodutos da fementação lática, como acetaldeído, acetona, acetoína e
diacetil são importantes para o aroma em alimentos produzidos com essas bactérias.
Acetaldeído origina-se do piruvato e dos aminoácidos aspártico, metionina e treonina; diacetil
e acetoína são produzidos a partir de citrato.
Fermentação acetona-butanol
A fermentação de açúcares com produção de ácido butírico foi descoberta por PASTEUR
em 1861 (GOTTSCHALK).De modo geral, apenas anaeróbios obrigatórios como Clostridium
são capazes de formar ácido butírico como produto principal de fermentação.
Algumas espécies de Clostridium, como Clostridium acetobuty/icum são capazes de
produzir pequenas quantidades de butanol e acetona, como pode ser visto nas passagens.
Glicose
glicólise
~ piruvato ~ acetil-CoA ~ acetoacetil-CoA
Acetoacetil-CoA
~
Butiril-CoA
~ acetoacetato ~ ACETONA
~ butiraldeído ~ BUTANOL
Pormação de metano
Outro processo anaeróbio interessante é a formação de metano pelas bactérias
metanogênicas como as Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina e Methanolobus,
que conseguem obter energia a partir dos substratos hidrogênio molecular, gás carbônico,
ácido fórmico, metanol, metilamina e ácido acético, dependendo da espécie.
A formação de CH4,a partid do metanol e H2está acoplada, em Methanosarcina barkeri,
com a formação de ATPpela ATPsintase.
Exemplos de capacidade energética de algumas reações:
CH3 -OH+H2 --4 CH4 +H20
CO2 + 4H2 --4 CH4 +2H20
~ F = -26,9 kcal
~ F = -32,4 kcal
M1 = -34,5 kcal
Mecanismo de Entner-Doudoroff
o processo glicolítico ou de EMBDEN-PARNAS-MEYERHOFdescrito anteriormente é
encontrado em considerável número de organismos: microorganismos, vegetais e animais.
Porém, há microorganismos como Pseudomonas saccarhophila, Alcaligenes euthropos,
Rhizobium japonicum, Xanthomonas phaseoli, Thiobacillus ferrooxidans que apresentam outro
mecanismo para a degradação de açúcares, mecanismo conhecido como de ENTNER-
DOUDOROFF(ED). No caso da Escherichia colí pode ocorrer a presença das duas vidas em
função do substrato: na presença de glicose ocorre glicólise e na presença de gluconato a via
de Entner-Doudoroff. Esse mecanismo é encontrado em grande número d(..bactérias
gramnegativas.
CHO
I
CHOH
I
CHOH
I
CHOH
I
CHOH
I
CH20P
Glicose-6P
NADP
NADPH :;.
+ H20
COOH
I
CHOH
I
CHOH
I
CHOH
I
CHOH
I
CH20P
6P-gluconato
COOH
I
c=o
I
~ CH2
I
CHOH
I
CHOH
I
CH20P
2-ceto-3-deoxi-
6P-gluconato
6P-fosfogluconato desidratase
Ação da 2-ceto-3-deoxi-6P gluconato aldolase:
COOH
I
c=o
I
CH2
I
CHOH
I
CHOH
I
CH20P
2-ceto-3-deoxi-
6P-gluconato
.::.
COOH
I
c=o
I
CH3
piruvato
+
CHO
I
CHOH
I
C~OP
gliceraldeld0-3P
Como pode ser observado na Fig. , a glicose-6P é desidrogenada até 6P gluconato,
reação que envolve a presença de NADPe água. Em seguida, 6P-gluconato é convertido em
uma molécula de gliceraldeído-3P e uma de piruvato, através da ação das enzimas desidratase
e aldolase. Gliceraldeído-3P é oxidado até piruvato pelas enzimas do processo glicolítico. Um
ponto interessante para destacar é a produção de ATP: enquanto na seqüência glicolítica o
rendimento líquido é de 2 ATP/mol de glicose, na Entner-Doudoroff é de apenas 1 ATP/mol de
glucose.
Exitem muitas enzimas comuns aos dois processos, sendo que as enzimas chaves do
processo Entner-Doudoroff são:
6P-gluconato desidratase
2-ceto-3-deoxi-6P gluconato aldolase
Processo do ciclo das pentoses
A maioria das células de microorganismos, vegetais e animais utilizam o ciclo das
pentoses para a produção de pentoses necessárias para a formação de nucleotídeos dos ácidos
nucléicos, ATP, coenzimas etc, além da formação de NADPH + H+ para os processos
biossintéticos.
Alguns microorganismos como Thiobacillus novellus e Brucella abortus são deficientes
em enzimas chaves dos processos glicolíticos e ÉD, entretanto crescem em meio de glicose.
Essas bactérias utilizam-se do ciclo das pentoses, desviando gliceraldeído-3P para oxidação até
piruvato e posteriormente do ciclo de Krebs para a produção de energia acoplado ao transporte
de elOétrons. Também há a possibilidade de excreção do acetato, como ocorre na
Gluconobacter, bactéria acética que apresenta o ciclo de Krebs operando parcialmente.
Glicose-6P .. 6P-Glucônico
NADPH2~.
~ )Ih.CO z
Ribulose-5P
~~
Xilulose-5P
~
Ribose-5P
TPP transcetolase
sedoeptulose-
~
7P GA-3P
transaldolase
Frutose-6P Eritrose-4P
TPP ) transcetolase
 Xilulose-5PFrutose-6P GA-3P
0rutose-6p .-<tHA
Glicose-6P Fenóis
~
NADPHz
Lactona-6P
6 glucose-6P + NADP -.. glucose-6P + 6 COz+ 12 NADPH
Processo Aeróbio
Os organismos, que se utilizam do ciclo de Krebs (ciclo do ácido cítrico ou dos ácidos
tricarboxílicos) para a produção de coenzimas reduzidas para a cadeia respiratória e de
compostos precursores para as biossínteses, são mais eficientes no processo de ob8ter energia
a partir da glicose, podendo ainda realizar essa obtençãoa partir da degradação de ácidos
graxos e aminoácidos.
Pra a operação do ciclo de Krebs a partir de piruvato há necessidade de r~ação inicial de
ativação com a formação de acetil-coenzima A. O complexo enzimático da piruvato oxidase
que exige os co-fatores NAD,coenzima A, pirofosfato de tiamina, ácido lipóico e magnésio,
converte piruvato em acetil-CoA conforme a reação:
ÁcidoIip6ico. Acetil-CoA+ NADH+ H+
TPP Mg+2
Piruvato + NAD + HS-CoA
Acetil-CoA pode ainda ser formado a partir da betaoxidação dos ácidos graxos e da
oxidação de aminoácidos.
Componentes do ciclo de Krebs como alfacetoglutarato e oxaloacetato são precursores
para a síntese de glutamato e aspartato, respectivamente. Succinil-CoA é precursor para a
síntese das porfirinas.
As reações do ciclo de Krebs estão sumarizadas na figura abaixo:
+H20
Acetil-CoA
7
OxaJoacetato
NADH,-fNAD
Malato
+ H,O 1
Fumarato
HS-CoA
L . Citrato
j Fe"2
Isocitrato
NAD- f" C02
~NADH2
Cetoglutarato
~ NADH2NAD Mg+2TPP+ H5-CoA CO2
Succinil-CoA
FAD HS-CoA
+H20
GDP+ Pi
Succinato
COOH
I
c=o+ HS-CoA + NAD
I
CH3
acetil - CoA
to C02 + NADH2 + COSCoA
TPPMg I
LlPÓICO CH3
As coenzimas FADH2 e NADH + H+ são reoxidadas no processo do transporte de
elétrons acoplado à fosforilação oxidativa, conforme esquema apresentado na próxima figura.
Deve-se chamar atenção para a necessidade de algumas vitaminas do complexo B para a
formação das coenzimas atuantes no processo aeróbico de obtenção de energia: niacina
(NAD), tiamina (TPP), riboflavina (FAD), ácido pantotênico (coenzima A).
NAD~2 Nl
Rotenona- - - - - ...~
Flavoproteína I
~
~ CoenzimaQ
/
Antimicina A - - - - -~ Citocromob
!
Citocromo c
+
Citocromo aIa3
Claneto-- - - - - - -~ í\
Sulfeto - - - - - - -. I \ ATP
o 0-2
ATP
FADH2
, -., Aavoproteína\I
FAD~
ATP
Desacopladores: Arsenato, Dicumarol,
2,4 Dinitrofenol tiroxina
Bactérias acéticas
As bactérias acéticas do gênero Acetobacter são organismos estritamente aeróbios, que
obtêm ATPa partir da oxidação do etanol até ácido acético:
+ Coenzima ox. ~
CfI3
I
CHO
acetaldeído
CH3
I
CH20H
etanol
+ Coenzima red.
+ Coenzima ox.
CH3
I
COOH
ácido acético
+ Coenzima red.
As coenzimas reduzidas são transferidas para citocromos da cadeia respiratória,
gerando força protonmotiva para a formação de ATP. O ácido acético é excretado, podendo
atingir concentrações elevadas no meio, por exemplo, de 100 g/L em condições ideais de
oxigenação.
Se etanol não está mais disponível, o ciclo de Krebs passa a operar de modo completo e
o ácido acético pode ser oxidado até gás carbônico e água.
Biossíntese
Carboidratos
Nos vegetais e em algumas bactérias, encontra-se uma via alternativa de metabolismo
de acetil-CoA, chamada ciclo do glioxilato, Que permite a produção líquida de intermediários do
ciclo a partir de acetil-CoA. Esta via conta com a participação de enzimas do ciclo de Krebs,
além de duas enzimas ausentes de tecidos animais: a isocitrato liase e a malato sintase.
a glioxilato formado, reage com acetil-CoA, formando malato, que passa para o
citossol, onde origina oxaloacetato, que pode ser transformado em glicose pelas reações da
gliconeogênese.
a ciclo de glioxilato, dessa forma, permite a conversão da acetil-CoA e, portanto, de
ácidos graxos, a glicose. Esta é uma impossibilidade metabólica dos animais, pois, no ciclo de
Krebs, para cada molécula de acetil-CoAintroduzida, são liberadas duas moléculasde Ca2,
não havendo, assim, ganho líquido de carbonos para a formação de oxaloacetato. Este ciclo
possibilita, ainda, a certas bactérias, crescerem em meios contendo apenas ácidos graxos
como fonte de carbonos.
A trealose, dissacarídeo não redutor constituído por duas unidades de glicose unidas
pelo carbono anomérico, é um carboidrato com função de proteção contra agentes
estressantes e de reserva nas células vegetativas de leveduras e esporos de fungos.
A biossíntese da trealose é realizada pelas enzimas sintetase de trealose-P e trealose-p
fosfatase apartir de glicose.
ÁCIDOS GRAXOS
betaoxidação
~ CH3 Acetil-CoAI
COSCoA
CO-COOH ~
6H2 - COOH \
Oxaloacetato CH -COOH
I 2
HO-C-COOH
I
CH2-COOH
Citrato +
CH2-COOH
I
CH-COOH
I
CHOH-COOH
Isocitrato
COOH
I
CH2I
CH2
I
COOH
Succinato~ gliconeogênese
AÇÚCARES
/
COOH
I
CHOH
I
CH2
I
COOH
Malato
CHO
I
COOH
Glioxilato
CH3
I
COSCoA
Acetil- CoA
Ácidos graxos
o sistema para síntese de ácidos graxos saturados a partir de acetil-CoA está localizado
no citosso!. A acetil-CoA carboxilase, enzima alostérica inibida por acil-CoA de cadeia longa, é
o primeiro passo para a síntese, produzindo malonil-CoA a partir de acetil-CoA e exigindo ATP
e biotina, sendo ativada por citrato e frutose-I,6-diP.
Acetil-CoA + CO2-- malonil-CoA
o complexo enzimático da sintetase de ácidos graxos realiza a condensação do malonil
com o acetil CoAe exige que este esteja ligado ao grupo sulfidrila da proteína carregadora de
grupos acil (ACP).
Poli-OH-alcanoatos
São polímeros produzidos principalmente por bactérias com a função de reserva de
carbono ou de energia. A produção é estimulada em determinadas condições, como por
exemplo a deficiência de nitrogênio, e pode atingir até 80% do material celular seco.
Bactérias do gênero Alcaligenes são capazes de produzir poli-OH-butirato a partir de
glicose e sacarose, o gênero Burkholderia a partir de glicose, frutose, sacarose e gliconato.
Poli-OH butirato é um polímero do D(-)-beta-OH butirato com peso molecular entre
60.000 e 250.000. É considerado como reserva de energia característica de procariotos como:
Alcaligenes eutrophus, Azotobacter vinelandii, Bacillus megaterium, Pseudomonas multivorans,
Rhodospirillum rubrum, Schaerotilus natans, bacilos de modo geral e bactérias fototrópicas.
Acumula-se nas células, como granulos cercados por membranas, em condições de deficiência
de nitrogênio. As reações de síntese estão apresentadas na seqüência:
+
2 CH3-Co-SCoA---7>CHTCO-CHTCO-SCoA
Acetil-CoA AcetoacetiJ-CoA
NADH
~ CH3-CHOH-CHTCO-SCoA
beta-GH-buritil-CoA,
~
POLI-OH-BUTIRATO
v - Processos fermentativos
V.a - Introdução
o primeiro processo fermentativo industrial foi a produção de vinhos e cervejas. Ao
longo do século XX, a expansão da Microbiologia Industrial e o desenvolvimento de
bioprocessos baseados no metabolismo microbiano possibilitaram a produção de diversas
substâncias.
Tradicionais ou revigoradas pelas possibilidades oferecidas pela manipulação gênica, as
"fermentações" ou bioprocessos visam um dos seguintes objetivos:
. A multiplicação de microrganismos (leveduras, por exemplo) para a obtenção de
biomassa (proteína de célula única). .
.A obtenção de produtos microbianos (antibióticos, aditivos, álcool, enzimas etc.).
. A conversão de um substrato em outro, por ação de microrganismos ou de enzimas
(transformação de esteróides, isomerização de glicose em frutose).
. A purificação de um solvente (tratamento de efluentes, transformação de algum
poluente em alguma substância facilmente degradável, etc.).
29
De uma forma geral, um processo fermentativo começa com' a escolha do agente
biológico adequado (microrganismo ou enzima); segue com a transformação da matéria-
prima, em condições que podem exigir esterilização, aeração e controle do processo (pH,
temperatura, etc.); e finaliza com a separação e purificação do produto final.
Em qualquer processo biotecnológico industrial, o elemento central é o reator, pois nele
se desenvolvem, devidamente controladas, as transformações que nos interessam.
Isso não quer dizer que o reator constitua a etapa mais importante do processo. Para
queo resultado que se tem em vista seja alcançado, dois outros conjuntos de operações
devem ser também cuidadosamente considerados, a saber:
1) Os tratamentos iniciais ("Upstream processes"), que antecedem a operação no reator
e cuja finalidade é colocar o sistema nas condições previamente escolhidas, para que as
transformações, no reator, se desenvolvam a contento;
. 2) Os tratamentos finais ("Downstream process-es"), que englobam a separação e a
purificação dos produtos e subprodutos obtidos, bem como o tratamento dos resíduos
formados.
Quando os agentes das transformações que ocorrem no reator são ou uma enzima
(purificada ou não), ou uma mistura de enzimas (também mais ou menos purificadas), ou
ainda células inativadas ou mortas (que, neste caso, funcionam como simples suportes das
enzimas), o processo recebe a denominação genérica de processo enzimático.
Por outro lado, se os agentes das transformações são microrganismos vivos, de modo
que as reações que se desenvolvem no reator são conseqüências da atividade vital das células
microbianas, o processo é denominado processo fermentativo. Nesse caso, o reator é, muito
freqüentemente, também chamado fermentador ou doma.
Cumpre não esquecer que a atividade vital dos microrganismos responsáveis por um
processo fermentativo é sempre o resultado de considerável número de reações enzimáticas. A
rigor, portanto, quer nos processos chamados enzimáticos, quer nos denominados
fermentativos, enzimas são, em última análise, os catalisadores das transformações que
ocorrem no reator.
Por motivos históricos, ainda hoje o termo "processos fermentativosn se aplica em
biotecnologia a qualquer processo microbiano operado em grande escala, independentemente
se este seja ou não uma fermentação.
Para Que o processo seja economica mente viável
deve-se contar com uma matéria-prima barata. um
procedimento passível de ser bem controlado e uma
forma de recuperar o produto Que simplifique ao
máximo sua purificação.
Esterilizaçãn
l.
FilSê de lAboratório
o !
Faseindustrial
I
~. -- F.steri~lAÇão_. 1\,
HlORREATOR
I
ProdUtu,; fiubprndutos
V.b - Linhagens Industriais
De um modo geral, para que o cultivo em um fermentador resulte economicamente
viável, o microrganismo deve ser capaz de se multiplicar rapidamente, sintetizando grande
quantidade do produto a partir de uma matéria-prima barata. Existem Bancos e Coleções de
Cultura especializados que vendem esse tipo de linhagens de microrganismos como culturas
puras, geneticamente estáveis e aptas para o cultivoem grande escala. .
Apesar de terem sido isoladas do meio ambiente, as linhagens industriais diferem
substancialmente das linhagens originais, em virtude de uma série de alterações genéticas
(mutações, recombinações) obtidas no laboratório. Algumas vias metabólicas, especialmente
as do metabolismo secundário, podem ter sido alteradas, de maneira a aumentar ao máximo a
síntese do produto desejado e de evitar a produção de algumas substâncias desnecessárias.
Em geral, por estarem tão selecionadas geneticamente, tendo inclusive algumas vias
metabólicas anuladas ou desbalanceadas, estas linhagens sobrevivem pouco tempo no meio
ambiente. Porém, come' norma geral, as linhagens industriais não devem ser patogênicas nem
produzir toxinas. A produção de medicamentos ou de vacinas é um caso especial que exige
medidas de segurança estritas.
Os microrganismos constituem um grupo biológico muito diversificado e ainda pouco
conhecido, motivo pelo qual existem muitas expectativas em relação à prospecção de
linhagens em ambientes extremos ou pouco usuais. Não se precisa desenvolver um processo
novo para cada microrganismo que apresente alguma característica comercial interessante. A
tendência atual é de transferir os genes correspondentes a algum dos microrganismos
conhecidos, adaptados às condições industriais.
V.c - A Escolha da Matéria-Prima
A composição do meio de cultura depende das necessidades metabólicas do
microrganismo escolhido. Este deve conter todos os nutrientes necessários nas concentrações
adequadas, que variam em função do microrganismo e do objetivo do processo. Em geral, os
meios de cultura utilizados no laboratório incluem:
. Água.. Uma fonte de energia e de carbono: glicose, amido, etc.
. Uma fonte de nitrogênio inorgânica (sulfato de amônia, nitrato de potássio etc.),
orgânica (asparagina, succinato de amônia, glutamato, uréia, etc.) ou complexa
(farinha de soja, peptona etc.).
. Sais minerais, tais como fosfato de potássio (K2HP04ou KH2P04),sulfato de
magnésio (MgS04 7H20), cloreto de cálcio (CaCI2),etc.
. Elementos-traço: ferro, zinco, manganês, cobre, cobalto, molibdênio.
Com vistas a uma exploração comercial, os meios definidos são substituídos na
indústria por matérias primas de baixo custo como, por exemplo, soro de leite, melaço de cana
ou de beterraba, amido de milho etc. Em alguns casos, a matéria-prima passa por um
tratamento prévio com métodos físicos el ou químicos.
No caso de se tratar de um processo enzimático, o meio deverá levar, além do
substrato adequado, os elementos necessários para que a enzima possa desenvolver sua
atividade catalítica (precursores, co-fatores etc.).
V.d - Os Processos Tradicionais
Algumas fermentações se desenvolvem sobre resíduos agroindustriais ou florestais,
como grãos, palha, bagaço, serragem etc. Este tipo de fermentação em meio sólido umedecido
se utiliza na produção de alimentos como, por exemplo, o levedo da massa na panificação, a
maturação de queijos por ação de fungos (Roquefort, Gorgonzola), o cultivo de fungos, a
fermentação do cacau, do café e do chá, etc. Na Ásia, estes processos são a base, através da
preparação do "koji", de alimentos tradicionais como o tofu, o misó, o shoyu e o saquê.
Em alguns lugares, estas fermentações ainda se desenvolvem artesanalmente dentro
de folhas de bananeira e cestas de bambu ou mesmo em montões, existindo hoje também
equipamentos sofisticados como bandejas, colunas, frascos e tambores rotativos, alguns
totalmente automatizados.
Outra variante interessante do processo fermentativo é a produção tradicional de
vinagre (processo Francês ou de Orléans) em barris de carvalho. O vinho é inoculado com
bactérias do gênero Acetobactel que formam na superfície a "mãe do vinagre", uma película
que flutua, presa a um quadriculado de madeira que a impede de afundar. Deste modo, o
microrganismo cresce na superfície de um meio líquido, em contato simultâneo com o ar e com
o meio.
O processo fornece excelentes vinagres, mas é lento e exige muito espaço, sendo a
capacidade de cada barril de 200 litros. Existem outros processos semelhantes, conduzidos por
fungos, que formam uma película de micélio na superfície do líquido.
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Controles de
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ii
V..e -Os Processos Submersos
Os Fermentadores ou Biorreatores
Atualmente, a maioria dos processos industriais se desenvolve em cubas de vidro de
até 20 Lou de aço.
O meio de cultivo ocupa aproximadamente 75% da cuba, já que às vezes é necessário
injetar ar, e em muitas fermentações se forma espuma; os agentes biológicos se encontram
submersos no meio.
Motor
Vapor o Entrodo de ãédoou de bese Indicador depressão
Entrada de células
ou nutrientes
Vapor
bltrad. de ar
Saída do produto
o desenho do biorreator deve se adequar ao objetivo do processo, respondendo
eventualmente a diversos imperativos, tais como a esterilização do sistema, a aeração e
homogeneização do meio, o acréscimo de nutrientes e de aditivos anti-espuma, a manutenção
do pH, etc. Os modelos de fermentadores mais utilizados com microrganismos são aqueles que
contam com aeração e agitação mecânica. Esta facilita a distribuição dos nutrientes na cuba,
mas gera calor que deve ser eliminado mediante a circulação de água fria.
Se o processo exigir assepsia, esta se consegue mediante:
. A esterilização domeio (dentro ou fora do fermentador).
. A desinfecção ou esterilização do equipamento por injeção de vapor ou mediante o
calor gerado por serpentinas, sendo esta medida extensiva a todos os duetos de
entrada e saída e às válvulas correspondentes.
. A esterilização do ar mediante filtros adequados.
Em outros tipos de biorreatores em coluna ou torre, a homogeneização depende da
injeção de ar. Nestes modelos os tanques podem chegar a 3.000 m3de capacidade, tal como os
fermentadores para a produção de proteínas de Imperial Chemical Industries (ICI).
Os sistemas submersos são apropriados para o cultivo de microrganismos livres, mas
resultam pouco econômicos quando se trabalha com células ou enzimas caras. Estas podem
ser imobilizadas em fermentadores menores, seja por adesão a um suporte inerte, seja por
inclusão dentro de um polímero que permita o contato com o meio de cultura. Além de
simplificar a purificação do produto, a imobilização possibilita a reutilização das células ou das
enzimas, que permanecem dentro do biorreator.
( lIV~ESj
em
I
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Reatores de leito fixo
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Reatores de leito
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Reatorescom
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~:~~g~gIj'.;~,j::~
33
CLASSIFICAÇÃO GERAL DOS BIORREATORES
(I) Reatores em fase aquosa (fermentação submersa)
(~.1) Células/enzimas livres. Reatores agitados mecanicamente (STR: "stirred tank reactor"). Reatores agitados pneumaticamente
Coluna de bolhas (IIbubble column")
Reatores 11 air-lift". Reatores de fluxo pistonado ("plug-flow")
(1.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes. Reatores com leito fixo. Reatores com lei~ofluidizado. Outras concepções
(1.3) Células/enzimas confinadas entre membranas. Reatores com membranas planas. Reatores de fibra oca ("hollow-fiber")
(11) Reatores em fase não-aquosa (fermentação semi-sõlida). Reatores estáticos (reatores com bandejas). Reatores com agitação (tambor rotativo) .. Reatores com leito fixo. Reatores com leito fluidizado gás-sólido
A Mudança de Escala
A capacidade de uma cuba varia entre 1 e 10 L para um fermentador de laboratório,
alcançando 5.000 Lem uma planta-piloto e 100.000 L em uma planta industrial.
Uma operação simples de laboratório pode ser impraticável ou pouco econômica quando
realizada em grande escala. Após as primeiras experiências de bancada, o processo passa a
ser estudado no laboratório, em um biorreator de até 10 litros de capacidade. Neste, as
variáveis físico-químicas são analisadas, com vistas a uma mudança de escala.
~.~~-_.~-.~..
Bancada
..
c. -:;
.j
'. 2DO.4COml. .". ..-~..-.
li!
i
+
',-.
Fermentador de laboratório
1 10L
Fcrmen-",dJr poota
50-200-500L
Fermentador :ndustnal
5.000- 50.000- 200.000L
Como, ao aumentar o tamanho do equipamento, se altera a relação superfíciejvolume,
as condições de operação do fermentador na planta-piloto devem ser ajustadas de forma a se
aproximar das correspondentes a um processo comercial. Se a experiência na planta-piloto for
bem-sucedida, o processo poderá ser desenvolvido em um fermentador industrial.
A automatização do monitoramento e do controle da fermentação permite que a
informação relativa aos parâmetros físicos e químicos (PH, temperatura, oxigênio, velocidade
de agitação, o nível do meio, etc.) seja recolhida on-line por sondas e sensores. Para que o
processo se aproxime das condições ideais, a informação é analisada em relação a um modelo
previamente estabelecido. Mas como por outro lado o modelo se elabora a partir da
experiência obtida com cubas menores (laboratório, piloto), os ajustes à mudança de escala
são de grande complexidade.
A Condução ~o Processo
o processo fermentativo pode ser conduzido de maneira contínua ou descontínua
(batelada), sendo que ambas as formas apresentam vantagens e inconvenientes.
Em um sistema de produção descontínuo, uma vez carregado o fermentador com a
matéria-prima e o inóculo correspondente, a fermentação prossegue até o esgotamento dos
nutrientes. Uma vez concluído o processo e extraído o produto, o fermentador é esvaziado,
limpo e esterilizado antes de receber outra carga.
Apesar do tempo improdutivo entre uma batelada e a seguinte,
relativamente flexível, já que o mesmo equipamento pode ser utilizado na
produtos diferentes. Sendo o risco de contaminação relativamente baixo, a
bateladas é bastante utilizada na indústria farmacêutica.
Já no sistema de produção contínuo, o acréscimo de nutrientes e a retirada do produto
ocorrem continuamente ao longo do processo, eliminando-se quase totalmente o tempo
improdutivo. Como o risco de contaminação aumenta, o sistema se adapta aos processos que
não exigem assepsia, como a produção de proteína microbiana e de álcool e, obviamente, o
tratamento de água.
Entre o sistema em batelada e o sistema contínuo existe um sistema intermediário de
batelada alimentada, em que periodicamente uma parte do meio de cultivo é retirada junto
com o produto e substituído por meio fresco.
o sistema é
fabricação de
produção em
V.f -A Recuperação do Produto
A recuperação do produto representa uma fração considerável do custo de um processo
fermentativo. Se o produto for secreta do fora da célula, se encontrará disperso em um volume
grande de água, sendo necessário separá-Io por decantação ou filtração. Mas se o produto
permanecer dentro das células, estas terão que ser desintegradas para que seja extraído.
Uma vez obtido o produto, este pode ser concentrado por sedimentação, precipitação,
filtração, centrifugação, extração por solventes, destilação, evaporação do soe vente e
secagem. Sua purificação envolve outros procedimentos, como a cristalização e os métodos
cromatográficos.
.35
VI - Biotecnoloaia na Prodllcãn.de JUimAntns
Alimentos .fermentados
o alimento não consumido, particularmente em climas mais quentes, estraga devido ao
crescimento .de microrganismos. .E sabido .quealgumas bactérias., .como .as SalmoneUas .ou
toxinas de bactérias como as do C/ostridium botulinum e Staphy/ococus aureus, podem causar
intoxicação .alimentaL D.esde .os .anos .6.0v.erificau-se .que .algumas .espécies .de .fungos .de
Aspergillus, Penicillium e Fusarium produzem metabólitos tóxicos ou micotoxinas,
principalmente .em .condições .de umidade .e.calor~
De qualquer modo, o crescimento e a atividade de microrganismos desempenham um
papel .essenciaJ no .controleambientaJ .e .do .ecossistema., .uma parte .do .qual .consisteem nossa
font~ de alimento. Os microrganismos e suas enzimas são responsáveis pelas mudanças
bioquímicas .que .ocorrem .dur.ante .afermentação .de .alimentos. .os .tipos .de .organismos .que se
desenvolvem em algum sistema particular de alimento dependem da atividade de água, do pH,
.da temperatura., .da .composição .do .al.ime.nto.e também .dapresença .de .compostos tampões. A
prática de usar o mesmo recipiente em sucessivas quantidades de alimento, ou a adição de
culturas primárias .ajuda .a r.egu.Lar.a .fermentação., .e .a .estabeLecer .a .daminância.Bactérias
ácido-Iáticas são talvez os microrganismos desejáveis mais difundidos em alimentos
fermentados, .encontr.a.dos .em produtos .de .cereais .fermentados, leites, .queijos .e .carnes
f-ermentadas.
C1~ssific~ção .dos alimentos fermAnt~dos
.os .alimentos fermentados -podem ser .classificados.em 9 .classes.:
1 - Bebidas
2 - Pmdut-GS -de <:-er-eéNs
3 - Produtos lácteos
4 - Produtos .de peixes
5 - Produtos de vegetais e frutas
.6 -Legumes
7 -Produtos cárneos
g --Produt-os amiláceos
9 -Miscelânea .de produtos
IOGURT-E
Entre todos os leites fermentados, é o iogurte o mais popular e o mais consumido no
Brasil.
Vários são os processos de produção de iogurte, mas basicamente as operações
.envolvidas na .fabricação são .as mesmas, para .os.diversos produtos.
Matéria-prima
.o .Leiteselecionado.a ser