Leveduras: Generalidades e Ciclo Vital

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Sumário
1Introdução
11. Generalidades
22. Composição aproximada das Leveduras
33. Morfologia e Estrutura
33.1. Formas
54. Reprodução e Genética
54.1. Reprodução Assexuada
74.2. Reprodução Sexuada
105. Ciclo Vital
106. Classificação
147. Utilidades da Levedura
157.1 Leveduras de Panificação
167.2 Produção de Levedura de Panificação
227.3 Aplicação das Leveduras em Processos Fermentativos
237.4 Obtenção da Cerveja
247.5 Obtenção do Vinho
258. Desvantagens das Leveduras
279. Atualidades
279.1. Proteínas Recombinantes Produzidas em Leveduras
309.2. Expressão heteróloga em P. pastoris
319.3. Perspectivas futuras
329.4. Referências bibliográficas
3310. A produção de etanol
3410.1. Introdução
3510.2. Vacinas recombinantes
3810.3. A importância dos subtipos virais
3810.4. Eficácia da vacina
3910.5. Esquema de vacinação, dosagem e vias deimunização
4010.6. Vacina recombinante com HBsAg mutante
4010.7. O papel dos adjuvantes na potenciação das vacinas
4110.8. Vacinas de DNA
4110.9. Vacinas combinadas
42Conclusão
43Referências Bibliográficas
LEVEDURAS
Introdução
Com o presente trabalho, procuraremos trazer ao conhecimento do leitor o máximo de informações que possam propiciar o entendimento sobre o ciclo vital de leveduras de diferentes espécies. Suas generalidades, aspectos positivos e negativos e atualidades que envolvem este tipo de fungo, serão apresentadas na forma mais abrangente e clara possível, podendo relacioná-las assim, com o meio ambiente em que vivemos. 
1. Generalidades
As leveduras são fungos geralmente unicelulares. Seu tamanho varia bastante, de 1-5 m m de diâmetro a 5-30 m m de comprimento. Sua forma também é muito variável, desde elementos esféricos até células elípticas bastante alongadas, quase filamentosas. Suas células apresentam as características dos seres eucarióticos. Têm membrana citoplásmica lipoprotéica, cuja principal função é regular as trocas com o meio ambiente. Possuem, também, uma parede celular rígida, constituída principalmente de dois polissacarídeos: manana e glucana; além disso, contêm proteínas e lipídeos. No citoplasma, encontram-se (além dos componentes usuais em solução) um ou mais vacúolos, delimitados por uma membrana; mitocôndrias – estruturas membranosas relacionadas com o processo respiratório; retículo citoplásmico; ribossomas e, freqüentemente, grânulos de material de reserva – hidratos de carbono, gordura e proteínas. O núcleo, tipicamente eucariótico, é envolvido por uma membrana nuclear.
A semelhança dos bolores (fungos), as leveduras pode, se reproduzir assexuada ou sexuadamente. No primeiro caso, o processo mais comum é o brotamento, do qual resultam células-filhas inicialmente menores que a célula-mãe. Algumas leveduras reproduzem-se por divisão binária, a semelhança das bactérias.
A reprodução sexuada se faz pela formação de ascósporos, isto é, esporos contidos no interior de um asco. Algumas leveduras não apresentam um processo de reprodução sexuada; são chamadas de "falsas leveduras" e classificadas entre os Fungi imperfecti.
São largamente encontradas na natureza: são comuns no solo, nas superfícies de órgãos dos vegetais, principalmente em flores e frutos, no trato intestinal de animais, em líquidos açucarados, e numa grande série de outros locais.
Apresentam grande importância sob vários aspectos, tais como:
Industrialmente, apresentam os seguintes pontos de interesse:
1. São agentes de fermentação alcoólicas, na produção do álcool industrial e de todas as bebidas alcoólicas destiladas ou não destiladas;
2. São utilizadas na panificação;
3. São, pelo menos potencialmente, importantes fontes de proteína e de fatores de crescimento, passíveis de serem utilizadas na alimentação animal e, mesmo, humana. 
Como agentes de fermentação são prejudiciais à conservação de frutos, e de sucos vegetais. Algumas espécies são patogênicas a plantas, animais e ao homem. 
 
2. Composição aproximada das Leveduras
As leveduras contêm proteínas e compostos nitrogenados diversos, amino ácidos livres, purinas pirimidinas e outros em menores quantidades. Contêm também ácidos nucléicos nos grãos de volutina. A síntese de proteínas em certas espécies como Torula Utilis (Candida Utilis) é rápida e produz elevada percentagem de proteínas. Por isso, em certos países esta levedura é empregada para fortificar os alimentos em proteínas.
As leveduras contêm ácidos ribonucléicos (RNA) que podem ser extraídos com NaOH a 0 – 10 oC ou com ácido tricloracético a 5% a 90 ºC. As leveduras são ricas em aminoácidos, contendo principalmente ácido glutâmico, lisina e leucina. Torula é também rica em tirosina. Os carboidratos podem se distinguir estruturais da parede celular como a celulose e metabólicos relacionados com a glicose. O glicogênio é armazenado em células bem nutridas e a tealose existe no Saccharomyces cerevisiae.
	TABELA 2.1
Composição aproximada de leveduras (em percentagem) 
	 
	Saccharomyces cerevisiae 
	Candida utilis 
	Rhodotorula gracilis 
	Nitrogênio
	50 
	59 
	13 
	Carboidratos (celulose, gomas)
	7 
	- 
	24 
	Glicogênio
	30 
	30 
	34 
	Lipídeos
	2 
	3 
	60 
	Cinzas (minerais)
	9 
	8 
	3 
3. Morfologia e Estrutura
As leveduras são, geralmente, unicelulares. Saccharomyces cerevisiae e outras leveduras comuns apresentam forma oval ou cilíndrica. Outras formas encontradas no grupo são: apiculada ou em forma de limão, esférica (Torulopsis) elípticas, elipsóides ou filamentosas (pseudo-micelio constituido por células unidas entre si).
3.1. Formas
3.1.1. Células das Leveduras
As células vegetativas da maioria das leveduras industriais variam em tamanho, de 4 a 8 micras de largura por 7 a 12 de comprimento, havendo, evidentemente, espécies maiores e espécies menores que as citadas. Forma e tamanho das células, mesmo em espécies monomorfas, podem variar de acordo com o nutriente, as condições ambientais, o estado fisiológico ou a idade.
Estrutura: As leveduras apresentam membrana celular bem definida, pouco espessa, em células jovens; rígidas em células adultas, de constituição variável, com predominância de hidratos de carbono, e menor quantidade de proteínas e graxas. Internamente delimitando o citoplasma, existe a membrana citoplasmática, mais evidente em células adultas, por plasmolise. No geral, as leveduras se apresentam sem cápsula, se bem que algumas espécies de Torulopsis se apresentem com cápsula, constituída de hidratos de carbono. 
Citoplasma - de células adultas apresenta inúmeros vacúolos e granulações variadas. Entre estas, são encontradas:
A) - Grânulos metacromáticos, constituídos de polimetafosfato inorgânicos, e de função em parte conhecida. 
B) - Glicogênio, hidratos de carbono encontrado em células adultas. 
C) - Grânulos lipóides, em quantidade variável com a espécie de levedura, a idade da célula e o substrato. 
D) - Mitocôndrios - se apresentam com aspectos filamentosos, constituídos de lipoproteínas com pequena quantidade de ácido ribonucleico, e contendo enzimas respiratórias.
O núcleo é bem definido, pelo menos em células em vias de reprodução; pequeno, esférico ou reniforme, de localização variável, associado a vacúolo nuclear.
 
4. Reprodução e Genética
Como nos zigomicetos e ascomicetos também no caso das leveduras, há duas formas reprodutoras: a assexuada e a sexuada. Em oposição à maioria dos cogumelos filamentosos, a reprodução assexuada não é feita por meio de órgãos especificamente formados. 
As leveduras, tanto esporógenas quanto asporógenas, reproduzem-se por meio da formação de blatosporos (brotamento) ou por meio da formação de oidios (mitose celular). A reprodução sexuada é levada a cabo por meio de ascosporos; mas estes são formados diretamente na célula de levedura e não, como nos ascomicetos, em órgãos especiais de frutificação. 
4.1. Reprodução Assexuada
A maioria das leveduras se reproduz por gemação, que é levada a cabo de forma que a célula produz uma pequena invaginação que aumenta gradualmente e é estruturado gradualmente comouma célula de levedura. A célula na qual foi formada a invaginação se chama célula materna, e a célula nova recebe o nome de célula-filha. Quando esta última alcança certo tamanho e certa idade, ela se separa da materna por meio de estrangulação; mas, por regra geral, ela forma uma célula-filha, e por sua vez uma célula-filha, etc, e isto acontece até que seja formada uma cadeia celular inteira gradualmente. A célula-materna originária pode formar sucessivas células-filhas em outros pontos de sua superfície, quer dizer, a gemação é multilateral. J.W. Bartholomew e T. Mittwer demonstraram em 1953, com o microscópio eletrônico que a gemação deixa uma cicatriz na parede da célula-materna e que uma única célula pode ter até 20 cicatrizes semelhantes. A longitude das cadeias celulares e o tempo que passa até que elas separam-se; elas variam em espécies diferentes de leveduras. 
Na levedura que é designada com o nome de levedura alta as cadeias celulares são formadas de forma geral relativamente grandes e ramificadas. Por esta razão é suposto que a levedura é sustentada pelo líquido no qual fermenta e cresce. Pelo contrário, as cadeias celulares de baixa levedura são curtas e encontra-se com facilidade muitas células isoladas, razão pela qual as leveduras deste tipo descem depressa ao fundo. 
Mas quando a levedura alta envelhece, as células separam-se uma da outra, então esta levedura também se cai ao fundo. 
A velocidade com que se processa a gemação depende de vários fatores. Deste modo, a quantidade de oxigênio desempenha um papel importantíssimo, porque com a abundância de oxigênio a gemação se favorece. Também é de vital importância a temperatura no meio onde são cultivadas as células. A temperatura mínima para a qual uma gemação foi observada, oscila entre o 0,5 oC e 3 ºC; a máxima, aproximadamente 47 ºC. Também, tem grande importância a composição do substrato nutritivo, cujo conteúdo em probióticos, etc., deve ser exato. 
O tempo que passa durante o desenvolvimento total de uma célula nova, quer dizer, o espaço de tempo que transcorre desde que fica visível como uma pequena invaginação na célula materna até o momento em que ela mesma está qualificada para formar células novas, se chama período gerador. Como capacidade proliferativa (o coeficiente de reprodução) se entende pelo número de células que podem ser formadas uma vez por uma dada célula. 
Com relação a isto se lembre de você que a capacidade reprodutora, também depende do número de células de leveduras presentes no líquido nutritivo. Quanto menor é este número, maior é o rendimento da capacidade reprodutiva de uma célula. 
Como já foi mencionado, há uma espécie de levedura, Schizosaccharomyces no qual a reprodução vegetativa não é levada a cabo por meio de gemação, mas por meio de divisão celular. Esta começa a ser formada na célula, a partir de uma fissão que é aumentada e divide a célula em duas células. Por meio de divisão da fissão, podem separar-se as duas células em seguida ou depois de decair algum tempo. No último caso pode acontecer uma segunda divisão, de forma que são formadas cadeias celulares pequenas. Na mitose de Schizosaccharomyces a pode-se falar da formação de oidios. 
A gemação polar é uma forma de reprodução intermediária entre a gemação em vários lugares e a mitose. A gemação polar só acontece nos pontos extremos de uma cela oval, de forma que a célula-filha e a célula-materna, antes da separação, não estão unidas em um único ponto, mas em uma extensão larga, quer dizer, a célula-filha parte da célula-materna em vez de ser estrangulado. Isto se chama estrangulação em base larga ou estrangulação "incompleta". Esta forma de reprodução vegetativa ocorre, por exemplo, em Saccharomycodes ludwigii e no gênero Nadsonia.
Reprodução por Mitose Celular
 
4.2. Reprodução Sexuada
A formação de ascósporos nas leveduras foi observada por J. De Seynes que comunicou em 1868 que as células de leveduras cultivadas em vinho poderiam formar células novas no interior delas e que estas células poderiam ser liberadas por meio de reventazón da parede das células maternas. Em 1870, M. Reess fez uma descrição detalhada destes esporos e pôde demonstrar que o mesmo ocorre nas diversas formas de levedura e que a germinação dos esporos foi levada a cabo por gemação. M. Reess que não trabalhou com cultivos puros, juntou estas leveduras esporógenas como um grupo especial que designou com o nome de Saccharomyces, proposto por J. Meyen em 1837 para os cogumelos fermentadores do açúcar. 
Em 1882-83, Emil Hansen levou a cabo os primeiros estudos sistemáticos no esporogênese nas leveduras, com isso que, graças á esporogênese endógena, era possível definir com clareza o grupo Saccharomyces. Os resultados mais importantes nas investigações deles relativo às condições para a esporogênese nos ensaios de laboratório que encontraram nos meios analíticos por meio dos quais a espécie diferente de leveduras pode diferir, eles serão tratados à frente. Aqui nós nos limitaremos a indicar que, em ensaios de laboratório, o esporogêese pode ser obtido colocando uma gota de uma suspensão concentrada de levedura em água ou mosto (quase sempre levedura do lodo de um cultivo jovem) em um bloco de estuque estéril; então derrama-se água na cápsula que contém o bloco de estuque, de forma que o bloco é saturado de água, depois, o preparado deve ser colocado num termostato a 25 ºC. Depois de transcorrer o tempo característico para a espécie, estará sendo formado um número maior ou menor que esporos a partir das células de levedura que se encontram no bloco de estuque. 
A esporogênese começa com a formação de algumas concreções protoplasmáticas arredondadas que são os esboços dos esporos. No desenvolvimento ulterior eles são cercados de uma parede que se salienta com mais ou menos clareza em espécies distintas. 
O tamanho dos esporos varia em diferentes espécies de 2 – 6 m m. Os esporos de um mesmo asco quase sempre são iguais. 
Em geral, são formados quatro esporos em um asco, mas devido a fenômenos degenerativos eles podem ser formados em quantidade menor. Na espécie Schizosaccharomyces é formado oito esporos em cada asco. No citoplasma dos esporos, entre outras substâncias, são encontrados o glucógeno, a voluntina e gotas de gordura. O citoplasma pode ser cercado por uma ou, mais raramente, duas membranas, como por exemplo, em Endomicopsis capsularis; no último caso é chamado então de um endospório e um exospório. 
Quando os esporos germinam, isto quase sempre acontece de forma que os esporos diferentes, enquanto eles ainda estão na célula materna, são aumentados de forma que por meio da pressão que exercitam a um ao outro, na célula materna formações aparentes de uma membrana divisória. Por meio disto, uma quantidade de plasma está comprimida entre os esporos, ou as paredes destes prendem-se fortemente a um ao outro. Devido a estes dois fatos, a célula na qual se encontramos esporos parece ter vários espaços. 
Em cada ponto da superfície dos esporos aumentados pode ser formada uma descendência, sendo explodida a célula materna, de forma que os esporos são liberados. 
Na película de uma superfície de um substrato líquido que é formado por muitas espécies de leveduras, por exemplo, espécies Pichia e Hansenula, com freqüência esporos aparecem. 
Agora a pergunta seguinte pode ser formulada: A esporogênese das leveduras faz parte de um processo sexuado de princípio como a formação de ascósporos dos ascomicetos, ou os esporos das leveduras são formados partogenéticamente ? (parthenos, gr = uma virgem). 
Emil Hansen mostrou em 1891 que os esporos de S. ludwigii podem fundir-ser, mas este fenômeno não o caracteriza como um processo sexuado. 
H. Schiönning, colaborador de Hansen, observou em 1895 que as células de Schizosaccaromyces octosporus também podem fundir-se, mas em oposição a Hansen acreditou que esta coalizão era talvez um processo sexuado. Os colegas do tempo deles contradisseram com veemência esta convicção. Mas em 1900, C. Hoffmeister confirmou as observações de Schiönninge estabeleceu que o fenômeno era acompanhado por uma coalizão nuclear. Mais tarde foi falado que a copulação de esporos ou células - é até mesmo também bastante estranho - pode ser dado em outras leveduras, e pouco a pouco estes fenômenos copulativos foram considerados como parte de um processo sexual que por meio de formação que células de levedura e ascos (ou vice-versa) eles formaram esporos novos; mas muitos sintomas fizeram pressupor que os esporos foram formados na maioria dos casos para por partenogenética.
Agora então, a genética moderna reconhece que o ciclo vital da maioria dos seres vivos entende um processo de fecundação e uma mitose redutiva, quer dizer, um haplóide de fase só aconteceu por um jogo de cromossomos em cada núcleo e um diplóide de fase para dois jogos de cromossomos em cada núcleo. 
Por que esta lei não deveria ter também validez para as leveduras? 
Em 1933, Ö. Winge começou no Laboratorio Carlsberg, de Copenhague, uma série de estudos para esclarecer esta pergunta. 
Mas os cromossomos das leveduras são tão minúsculos que com muita dificuldade eles podem ser visíveis por meio de matiz. Então, Ö. Winge começou a isolar os esporos de uma levedura esporágena com um instrumento especial, o micromanipulador, sendo, com ajuda deste instrumento, debaixo de condições determinadas abaixo que tornou-se possível ver o que aconteceu quando um esporo germinou. 
Os estudos de Winge (isso foram levados a cabo em colaboração com O. Lausten em muitos casos) eles deram para algumas espécies do gênero Saccharomyces o seguinte resultado:
Para uma esporogênese, sempre precede uma fecundação em qualquer uma das fases, até mesmo quando um único esporo funde uma colônia. O que este último faz possível, ele se desprenderá de 2b.
Na germinação de um esporo eles podem ser formados por duas espécies de células de levedura:
a) Células haplóides, esferoidais, pequenas, que podem copular-se em duplas na primeira ou em uma das gerações seguintes. O resultado desta copulação é um zigoto que germina dando células normais diplóides prolongadas. 
b) Células prolongadas diplóides cujo dobro do número de cromossomos deve ser atribuído ao núcleo haplóide do esporo ser "diploidizado". Foi dividido e os dois núcleos novos fundiram-se.
Também é possível a copulação do esporo com uma das células haplóides mencionado em 2a e é um zigoto que produzirá exclusivamente células de levedura diplóides normais. 
As células haplóides mencionadas em 2a e as haplóides eventuais descendente delas não pôde formar esporos no bloco de estuque. Só quando, como isto foi mencionado acima, eles tinham se copulado em duplas, foi formado uma geração que teve a habilidade para produzir esporos. 
Em alguns casos, as células haplóides pequenas se multiplicam durante várias gerações antes que eles se copulem. 
Os ensaios acima mencionados de Ö. Winge têm, do ponto de vista lógico, duas conseqüências muito importantes. 
A primeira é a seguinte: nosso conceito deveria ser revisado sobre o termo "um cultivo puro de levedura".
Embora um cultivo isolado é obtido, a partir deste cultivo a pessoa pode obter uma multidão de tipos diversos, quando a levedura tem a oportunidade para formar esporos e estes acham as condições apropriadas de germinação. Ö. Winge e O. Laustsen têm demonstrado por via experimental que isto é assim: porque eles isolaram quatro esporos de um asco de uma levedura apertada que tinha sido induzida a esporogênese em um bloco de estuque e eles permitiram germinar estes quatro esporos em uma gota de líquido nutritivo. O resultado foi quatro tipos de leveduras de aspectos muito diversos. A diferença apareceu principalmente no aspecto das colônias gigantes, que formaram os quatro tipos de levedura sobre o mosto-gelatina. Esta descoberta explica muitas "variações de leveduras" que antes pareciam misteriosas. Por exemplo, quando a pessoa tem um cultivo de leveduras em um substrato líquido em um frasco Freudenreich, freqüentemente formam-se esporos na parede do vidro, sobre a superfície do líquido. Quando estes esporos se caem ao líquido e eles germinam, uma possibilidade foi determinada para a formação de um tipo de levedura novo. 
A segunda conseqüência importante que se encontra nos descobrimentos de Ö. Winge são as que tornam possíveis cruzar as leveduras quando elas permitem se copular com dois esporos de espécies diferentes, por exemplo, colocando-os um ao lado de outro em uma gota de líquido nutritivo. 
 
5. Ciclo Vital
Os fungos, na sua fase vegetativa, a de maior duração, são geralmente haplóide; a fase diplóide, compreendida entre a cariogamia e a meiose é geralmente muito curta. As leveduras, porém, apesar de pertencerem ao grupo dos fungos, comporta-se de maneira variável, a esse respeito, dependendo da espécie envolvida. Entre elas são encontrados vários tipos de ciclo vital, entre os quais são mais comuns os que seguem:
Ciclo com predominância da fase haplóide, encontrado em Schizosaccharomyces octosporus. 
Ciclo com predominância da fase diplóide, como em Saccharomycodes ludwigii. Neste caso, a fase vegetativa, reproduzindo-se por brotamento, é constituída de indivíduos diplóides. 
Ciclo sem predominância de fase haplóide ou diplóide, encontrado em Saccharomyces cerevisiae; a reprodução assexuada, por brotamento ocorre tanto em células haplóides como em células diplóides. 
 
6. Classificação
Atualmente, a classificação das leveduras se baseia nas características reprodutivas (sexuada ou assexuada), bem como, na capacidade de utilização de certos hidratos de carbono.
A família Saccharomycetaceae compreende cinco sub famílias. Cujos gêneros mais importantes são:
	SUB FAMÍLIA
	GÊNERO 
	Eresmacoideae
	Eremascus 
	Endomycetoideae
	Endomyces Schizosaccharomyces 
	Saccharomycetoideae
	Saccharomyces 
Pichia
Hansenula
Debaryomyces
Saccharomycodes
Nadsonia 
	Nematosporoideae
	Nematospora 
	Lipomycetoideae
	Lipomyces 
 
A família Sporobolomycetaceae apresenta blastosporos, considerados por algumas micologistas como sendo o basidiosporo. Pertencem a esta família os gêneros Sporobolomyces e Bullera. Por fim a família Cryptococcaceae agrupa levedura que se reproduzem unicamente por brotamento ou por cissiparidade. Os principais representantes pertencem aos gêneros Torulopsis e Rhodotorula.
Apresentam maior interesse que os demais, os seguintes gêneros e espécies de leveduras.
Gênero: Saccharomyces
· Produção de etanol e bebidas: S. cerevisiae e S. uvarum.
· Fermento de panificação: S. cerevisiae.
· Deterioração de alimentos:
· Espécies osmofílicas: S. bailii e S. rouxii 
· Deterioração de vegetais fermentados. 
· Deterioração de sucos e refrigerantes. 
Gênero: Kluyveromyces
· Deterioração do leite e derivados;
· Produção de proteínas a partir do soro de leite;
Gênero: Pichia e Hansenula
· São responsáveis pela formação de filme na superfície de líquidos de origem vegetal, ácidos. 
· Deterioração em vegetais fermentativos: P. membranaefaciens, H. anômala; 
· Deterioração de frutas; 
Gênero: Debaryomyces
· Formam película (mas não ascendente). Toleram altas concentrações de sal. São importantes na deterioração de salsichas (produção de limosidade ou "slime"), e crescem em salmouras de queijos. 
Gênero: Zygosaccharomyces
· Têm capacidade de se desenvolverem em líquidos com alta concentração de açúcar. E por isso são responsáveis pela deterioração de mel, melaço, sucos concentrados e xaropes. 
Gênero: Schizosaccharomyces
· São comuns nas superfícies de frutos, no solo, no bagaço e em substratos. Algumas espécies são osmofílicas. 
Gênero: Endomyces vernalis
· É utilizável na síntese de produtos graxos. 
Gênero: Endomyces fiberliger
· Levedura capaz de produzir amilase. 
Gênero: Rhodotorula
· As espécies desse gênero não são fermentativas. Têm pigmentos tipo carotenóide, que lhes confere coloração do laranja ao vermelho intenso. 
· Causam problemas em carnes, aves, produtos de laticínios e vegetais fermentados. 
Gênero: Kloeckera
· São leveduras apiculadas, encontradas principalmente no início da fermentação delíquidos açucarados, tais como o caldo de cana e sucos de frutas. Fermentam com rapidez. 
Gênero: Candida
· Compreende espécies que são importantes na deterioração de alimentos, tais como gorduras, manteigas e margarinas (C. lipolytica), azeitonas (C. mycoderma) e outros. São oxidativas ou facultativas. C. utilis é muito utilizada como levedura alimentar (levedura Torula).
Gênero: Torulopsis, Trichosporum e Cryptococcus
· São espécies que também podem estar envolvidas na deterioração de alimentos. 
 
Figuras de alguns gêneros:
 
Fig. (6.a e 6.b) - Saccharomyces cerevisiae
 
Fig.(6.c) – Candida curvata Fig. (6.d) – Candida albicans
Fig. (6.e) – Cryptococcus neoformans
 
7. Utilidades da Levedura
(Emprego nas indústrias)
O primeiro processo industrial para a produção de microorganismos úteis ao homem constituiu-se na produção de levedura de panificação, Saccharomyces cerevisiae, a qual, revelando qualidades nutritivas, passou a ser, posteriormente, também produzida para exclusiva e direta utilização como alimento humano ou animal. Paralelamente, levedura obtida por certos processos fermentativos, tais como os de cervejaria e os de produção de álcool de cereais ou melaço, começou a ser recuperada como subproduto e comercializada como alimento protéico e vitamínico. Essa nova forma de utilização de Saccharomyces inspirou o estudo de outras leveduras que apresentassem eventuais vantagens, salientando-se, nesse processo, a levedura Cândida utilis, produzida como alimento, na Alemanha, durante a Primeira e Segunda Guerra Mundial.
Mais recentemente, maior atenção às condições de má e de subnutrição, a que estão sujeitos largos contingentes de população, associada a prognósticos autorizados e pouco tranqüilizante, concernentes ao problema do aumento populacional frente as dificuldades de correspondente aumento da produção de alimento, tem despertado profunda preocupação. Esta resultou num grande volume de trabalhos buscando fontes não-usuais de proteína. Entre estes, os que se referem ao desenvolvimento de microrganismos como fontes potenciais de proteína são bastante numerosos. 
Microalgas, bactérias, leveduras e fungos têm sido extensivamente estudados em conexão com este assunto, e a vantagem da produção de proteína microbiana sobre produção de proteína animal e vegetal tem sido realçada, com base nas considerações apresentadas a seguir.
Os microrganismos têm um tempo de geração extremamente curto, o que propicia um rápido aumento de massa celular. As bactérias e as leveduras, sob condições propícias de desenvolvimento, dobram sua população em períodos de 0,5 a 2 e de 1 a 3 h, respectivamente, enquanto as algas e fungos completam esse aumento populacional em 2 a 6 e 4 a 12 h, respectivamente. 
O genótipo dos microrganismos pode ser mais facilmente modificado. A indução de mutações por agentes químicos e físicos pode levar a obtenção de mutantes capazes de se desenvolver nas mais variadas condições de cultura, de mutantes de desenvolvimento mais rápido e de mutantes de estrutura química e morfológica modificadas. 
O conteúdo em proteína dos microrganismos é geralmente mais elevado do que o da maioria das outras fontes de proteína. 
A produção de microrganismos como fonte de proteína pode ser obtida em uma grande variedade de substratos, inclusive resíduos industriais, o que torna viável sua produção em diferentes regiões, desde que se escolha ou se adapte adequadamente o microrganismo ao substrato disponível. Além do mais, a utilização de resíduos industriais contribui para que se alivie o problema de poluição. 
A produção de proteína microbiana pode ser executada independente de condições climáticas, exigindo pequena disponibilidade de água e de espaço. 
Como conseqüência, a possibilidade de utilização em larga escala de microrganismos como fonte de proteína tem sido seriamente considerada.
No sentido de se evitar a conotação, geralmente desagradável ao leigo, dos termos de proteína bacteriana, proteína de fungo e proteína microbiana, foi recentemente criado, para substituí-los, o termo "single cell protein", que em tradução livre, significa proteína unicelular.
7.1 Leveduras de Panificação
Na primeira metade do século XIX, as leveduras de panificação eram obtidas como subproduto de destilarias, as quais visavam apenas ao esmero do processo da produção de álcool, não havendo preocupação em obter-se, concomitantemente, uma produção maior e mais aperfeiçoada desses microrganismos. As leveduras, assim obtidas, supriam suficientemente a demanda, apresentando características adequadas para a produção domestica de pão e para a incipiente indústria de panificação da época.
O crescimento populacional, nas áreas de concentração industrial, determinou o desenvolvimento das industrias de panificação. O estabelecimento dessas indústrias em bases mais sólidas passou assim, a requerer uma crescente produção de leveduras de melhor qualidade, com razoável grau de padronização. Em razão dessa demanda, desenvolveu-se o interesse por processos de fermentação alcoólica, também eficientes na produção de leveduras de panificação. O resultado foi que, em 1860, surgiu o "processo Viena", o qual, pelo emprego de moderada aeração, permitia que, de uma fermentação alcoólica de leveduras, em substrato de cereais, fosse obtida, sem prejuízo da produção de álcool, uma produção maior desses microrganismos, os quais, após separação do substrato e prensagem, eram comercializados aos panificadores. Posteriormente, em 1870, Fleischman, que em 1868 havia iniciado, nos Estados Unidos, a produção de leveduras prensadas, patenteou um processo para produção desses microrganismos e álcool, a partir de cereais. Neste, detalhava a operação de separação das leveduras do substrato, como realizada no processo Viena.
Entre 1860 e 1915, enquanto os preços do álcool obtido por fermentação eram compensadores e a disponibilidade de cereais era abundante, o processo Viena constitui-se na principal fonte de leveduras de panificação. Acompanhando a demanda crescente de leveduras e decrescente de álcool, ocorrida ainda nesse período, observações sobre as melhores condições para a produção do microrganismo, em detrimento da produção de álcool, foram, gradativamente, postas em prática. Constituíram fatores importantes no aumento da produção de leveduras, o aumento de aeração, a acidificação dos substratos, a utilização de nitrogênio amoniacal em lugar de nitrogênio orgânico, a substituição parcial de cereais por melaço de beterraba, aliados a aperfeiçoamento de controle dos processos de produção. Dessa maneira, um rendimento de 3% de levedura (levedura seca/peso seco de matéria-prima), obtido em um processo que permitia um rendimento de 30% de álcool, foi elevado para 13% em um processo em que o rendimento em álcool se reduzia de 10%. Inovações adicionais, representadas pela utilização de substratos exclusivamente constituídos de melaços, vigorosa aeração, fornecimento gradativo de substrato em função do desenvolvimento celular, métodos de cultura pura e seleção de linhagens de leveduras, permitiram alcançar, atualmente, uma produção de levedura de rendimento tão alto quanto 50% sobre o peso de matéria seca do substrato, acompanhada por uma produção negligenciável de álcool. Isso atende aos interesses das regiões de maior consumo de leveduras de panificação, onde o álcool é produzido mais economicamente por via sintética.
7.2 Produção de Levedura de Panificação
7.2.1. Substrato
Como salientado anteriormente, a evolução dos processos para produção de levedura de panificação deveu-se, entre outras inovações, a seleção do melaço como substrato mais adequado.
Atualmente, as indústrias produtoras desse tipo de levedura utilizam-se dessa matéria-prima como fonte de energia, de nitrogênio orgânico, de elementos minerais e de vitaminas necessários aos microrganismos. Tanto melaço de cana como melaço de beterraba pode suprir, ao menos parcialmente, as exigências nutricionais das leveduras, dada sua composição em elementos minerais, tais como potássio,magnésio, fósforo, zinco, ferro e cobre; em vitaminas, tais como biotina, ácido pantotênico, inositol, piridoxina e tiamina, e em nitrogênio amínico na forma de aspirina, ácido aspártico, alanina, ácido glutâmico e glicina. O melaço de beterraba apresenta-se mais rico em nitrogênio orgânico de que o melaço de cana, porém isto não o coloca em melhor posição como substrato para a levedura de panificação, desde que cerca de 50% desse nitrogênio se apresenta de forma de betaína que não é assimilável pelo microrganismo. Por outro lado, o melaço de cana é consideravelmente mais rico em magnésio, cálcio, biotina, tiamina e ácido pantotênico que o melaço de beterraba. Apesar disso, entretanto, a composição do melaço de cana não é suficiente para suprir fósforo e nitrogênio em concentrações adequadas para o melhor desenvolvimento das leveduras, sendo necessário que esses elementos sejam suplementados ao meio de cultura. Ácido fosfórico, seus sais de amônio, amônia anidra e sulfato de amônio são geralmente utilizados para essa suplementação. Evidentemente, a composição dos melaços de diferentes origens é variável, o que se torna necessário o conhecimento da composição de cada tipo de melaço a ser empregado, para que se possa proceder a uma suplementação racional. Tanto o melaço de beterraba como o melaço de cana, alem das suplementações anteriormente citadas, exigem, para constituírem em substrato adequado à propagação de levedura, um tratamento prévio de diluição e clarificação. O melaço de cana, submetido a diluição e clarificação, por sedimentação e decantação, em alguns casos, é finalmente submetido a uma operação de centrifugação. A mistura de melaço de beterraba e melaço de cana é também comumente utilizada na produção de levedura de panificação.
7.2.2. Culturas e sua conservação
As leveduras propagadas para utilização nas indústrias de panificação são linhagens de Saccharomyces cerevisiae, cuidadosamente selecionadas, de modo a atender conjuntamente as condições do processo de propagação e as exigências do processo de panificação. Essas linhagens devem apresentar as seguintes características:
· Estabilidade durante a conservação da cultura; 
· Capacidade de crescimento sob condições de elevada aeração; 
· Elevada capacidade de propagação em substratos à base de melaço; 
· Ativa capacidade fermentativa em massas de farinha; 
· Resistência à autólise e conservação de suas características fermentativas durante o armazenamento e comercialização na forma de levedura prensada ou levedura seca ativa; 
· A levedura prensada deverá manter-se ativa e com boa aparência, mesmo quando conservada à temperatura ambiente por vários dias; 
· A levedura seca ativa deverá suportar as condições específicas de sua conservação e da reidratação que precede o uso. 
Usualmente as linhagens de S. cerevisiae, utilizadas em panificação, são resultantes de seleção entre linhagens selvagens; entretanto algumas das linhagens utilizadas foram obtidas por hibridação de genótipos conhecidos.
As culturas de levedura deverão ser conservadas, na indústria, sob condições de refrigeração, em meio adequado, procedendo-se, periodicamente, a seu subcultivo. O estado diplóide dessas leveduras deve ser permanentemente mantido. Periodicamente, uma série de culturas, reisoladas a partir de células únicas, é examinada com o fim de se verificar se o microrganismo está mantendo suas características originais. A conservação de culturas por liofilização não constitui prática generalizada nas indústrias produtoras de leveduras de panificação.
7.2.3. Propagação das culturas
A partir de subcultivos da levedura conservada na indústria, inicia-se a preparação do inóculo, que se constitui na fase inicial do processo industrial de propagação, esquematizado na fig. 12.1. Uma alça carregada das células do microrganismo é assepticamente transferida ao um meio de xarope de malte, com 6% de açúcares fermentecíveis, ajustado a 3,5, enquanto que, nos processos norte-americanos, este ajuste é feito dentro da faixa de 4,5 a 5,0. Após o desenvolvimento do microrganismo nesse meio líquido, por um período de tempo variável de 24 a 48 horas, a temperaturas entre 25 – 30 ºC e condições de moderada aeração com ar esterilizado, procede-se à transferência asséptica de todo o conteúdo do frasco para um tanque, onde, em um maior volume de substrato (melaço enriquecido com os elementos minerais necessários), a população de levedura aumenta-se sensivelmente. Após este estágio, geralmente se procede a mais uma ou duas transferências para volumes crescentes de substratos. Em cada uma dessas transferências, o peso de levedura desenvolvida deverá aumentar cerca de dez vezes. Esse esquema de duas ou três transferências após o frasco Pasteur é geralmente posto em prática nos Estados Unidos, enquanto que as práticas mais usuais na Europa envolvem cinco ou mais transferências. 
O número e os volumes dos tanques, através dos quais se promovem a propagação progressiva das leveduras, deverão obviamente depender do fermentador utilizado no estágio final de propagação, uma vez que, a esse fermentador, geralmente se adiciona um volume de inóculo igual a 20% do peso de melaço nele contido. Essa propagação progressiva da levedura é feita a uma mesma temperatura ou a temperaturas ligeiramente crescentes, desde o primeiro até o último tanque da série. O conjunto de tanques é conectado por tubulações e selado de forma a evitar contaminação do exterior. Neles o substrato é esterilizado por vapor sob pressão.
A massa de leveduras resultante dessa propagação é, após separação do substrato por centrifugação, transferida a um tanque esterilizado, ao o qual são também adicionados após prévia esterilização os componentes do meio. De acordo com a massa de leveduras a receber, este tanque tem um volume variável de 20 mil a 40 mil litros. 
Nele, as leveduras são propagadas sob condições de aeração intensa e de ajustes periódicos de pH, que, em alguns casos, é também acompanhado por uma adição progressiva de substrato de acordo com o crescimento de microrganismo. As leveduras assim obtidas (geralmente determinadas leveduras-semente) são separadas por centrifugação, ressuspensas em água, e novamente centrifugadas, tantas vezes quantas necessárias para a obtenção de um creme de leveduras livre de substrato. De acordo com a programação da indústria, esse creme é diretamente transferido ao fermentador para a propagação final ou armazenado em tanques refrigeradores.
7.2.4. Propagação final das leveduras de panificação
O melaço, a água, os sais minerais e a massa de leveduras são concomitantes e vagarosamente introduzidos no fermentador de propagação final, sob intensa aeração, a qual, nessa operação, facilita a mistura desses componentes. O ar purificado por aquecimento e filtração é disperso no fermentador, através de tubulação perfurada, localizada em sua parte inferior. Uma concentração de 1% de açúcar fornecido como melaço durante a fase inicial da operação é gradativamente aumentada até que se atinja um fornecimento adequado de açúcar, o qual deve ser mantido durante toda a operação. Entende-se por fornecimento adequado aquele que não permite ao açúcar residual do meio ultrapassar 0,1%. Obedecendo-se a esse procedimento, evita-se desperdício da fonte de carbono. Concomitantemente as adições constantes de melaço, são também adicionados os elementos minerais necessários, que não somente atendem as exigências nutricionais do microrganismo como também atuam nos ajustes de pH.
Nos fermentadores metálicos, o sistema de serpentinas disposto em seu interior, pelo qual circula água fria, complementado ou não por um sistema de refrigeração externo, também com água, garante a manutenção de temperatura adequada (cerca de 30 ºC), principalmente nas fases de mais intensa propagação das leveduras, quando a temperatura tende a elevar-se consideravelmente. Os fermentadores, antigamente construídos de madeira, ferro ou cobre, hoje são construídos, assim como toda tubulação, em aço inoxidável, tendo uma capacidadevariável de 4 mil a 200 mil litros.
Os volumes de ar a serem fornecidos durante a propagação da levedura devem ser aumentados gradativamente em função da mesma. Esses volumes, entretanto, dependem das características de cada sistema de aeração, características estas que comandam o nível em que o oxigênio é absorvido pelo substrato. Deve se considerar que as temperaturas mais elevadas durante a fase de maior propagação, a presença dos solúveis e dos agentes antiespumantes, constituem-se em fatores que determinam uma redução na solubilidade de oxigênio no substrato. O fornecimento de ar num processo para propagação de leveduras deve, pois, ser estudado em função da fase de propagação, do sistema de aeração e das condições físicas do substrato, para que o ar fornecido seja, durantes todo o processo, suficiente para atender às necessidades em oxigênio do microrganismo.
Várias maneiras são utilizadas usualmente, para relatar os requisitos em aeração exigidos pelos diferentes processos de propagação de leveduras; entretanto todas apresentam como característica comum à mensuração do volume de ar por unidade de tempo, relacionada a uma determinada variável do processo. É comum, pois, encontram-se, na literatura, um determinado volume de ar fornecido por minuto relacionado ao volume de substrato, a área de sua superfície, a porcentagem de levedura produzida, ao peso da matéria-prima utilizada em sua preparação ou ao peso de levedura nele produzida. 
Para dar uma idéia geral do volume de ar a ser empregado num processo de propagação de levedura, pode-se generalizar que, dependendo do nível de absorção de oxigênio pelo substrato e da fase de propagação da levedura, aproximadamente um volume de ar por volume de substrato por minuto é suficiente para uma propagação eficaz desse microrganismo. Obedecendo a essa relação, exemplifica-se na literatura que 185 litros de ar são suficientes para atender a demanda de oxigênio de uma população de leveduras próxima de máxima propagação em um volume de 140 mil litros de substrato. Generalizando-se, também se afirma que, para se produzir 1 kg de levedura com 45% de proteína, são necessários 2 kg de melaço, 0,4kg de amônio, 0,14 kg de NH4H2PO4, 0,5 kg de (NH4)2SO4 e 2,8 kg de ar.
Como conseqüência da aeração, resulta, nos processos de propagação de leveduras, uma excessiva formação de espuma, que se constitui num problema cuja solução requer cuidados especiais. Geralmente várias gorduras ou óleos de origem animal e vegetal, ou seus derivados, podem ser empregados como agentes antiespumantes. Tem-se observado uma correlação entre a matéria-prima empregada no substrato e a eficiência de um dado agente antiespumante. Como substitutos desses agentes antiespumantes, alguns dispositivos mecânicos de destruição de espuma têm sido sugeridos, mas seu uso não se generalizou nos processos comerciais. Atualmente o controle de espumas na propagação de leveduras é feito pela adição periódica e automática de agentes antiespumantes constituídos de frações de óleos animais e vegetais, considerados inócuos à saúde.
7.2.5. Recuperação das leveduras
Após o termino do processo de propagação, as leveduras são separadas do substrato por centrifugação, em centrifugas de capacidade de operação de cerca de 20 mil litros de substrato por hora. As leveduras, que nesse ponto apresentam-se na forma de um creme, correntemente denominado creme de leveduras, são ressuspensas em água e centrifugadas tantas vezes quantas forem necessárias para a obtenção de um produto livre de toda a coloração, comunicada pela presença de remanescentes do substrato. O creme de leveduras assim obtido é, em seguida, submetido a filtração sob prensagem, de tal forma a obter-se uma massa de leveduras contendo cerca de 70% de água. O tratamento subseqüente dessa massa se fará de acordo com a forma em que a levedura será comercializada, tal como descrito a seguir.
Levedura prensada – na preparação deste produto, a massa de levedura é misturada com gelo moído ou água contendo elementos emulsificantes ou plastificantes, que comunicando-lhe a consistência desejada, facilitam as posteriores operações de extrusão e corte. Estes elementos, adicionalmente, garantem a plasticidade do produto durante a estocagem, favorecendo também a sua coloração. As operações de extrusão, corte e embalagem das leveduras são feitas mecanicamente e delas resultam embalagens variáveis, de acordo com a demanda de mercado. O envolvimento em papel altamente poroso, recoberto de folha de alumínio, permite a absorção de gotículas de água que, se formadas na superfície do produto, determinariam regiões descoloridas que o depreciariam. Os melhores emulsificantes auxiliam, também, a prevenção desse defeito, impedindo a migração de água para a superfície de massa de levedura. Para proteção contra contaminação por fungos, a adição de álcool etílico, propílico, isopropílico tem sido preconizada, enquanto que, para melhorar as qualidades fermentativas da levedura, tem se preconizado a adição de ácido múcico, uréia, papaína e outros compostos. No sentido de prolongar a preservação do produto, principalmente daquele que se destina ao uso domestico, algumas indústrias incorporam, juntamente aos inibidores de fungo, uma certa porcentagem de amido de cereal. As leveduras comercializadas nessa forma contêm 68-72% de umidade e requerem condições de refrigeração durante o armazenamento. Mesmo sob essas condições, entretanto, as leveduras prensadas conservam suas propriedades por um período que não excede três a cinco semanas.
Levedura seca ativa – o procedimento básico, para preparação desse produto consiste em extrudar a massa de leveduras em fios finos, os quais, após fragmentação em pequenos cilindros, são submetidos à desidratação. As condições de desidratação, o conteúdo em umidade e o conteúdo em nitrogênio são fatores críticos na estabilidade e atividade das leveduras resultantes desse procedimento. Por essa razão, a desidratação deve ser feita sob condições moderadas de aquecimento, tais como ventilação com ar aquecido a 25-30 ºC por um período de cerca de 6h.
Concentrações de umidade de 7,5 a 8,3% e concentrações de nitrogênio de 6,5 a 7,2% comunicam as melhores características para o armazenamento e desempenho da levedura seca ativa. Esse tipo de levedura apresenta algumas vantagens no conforto com a levedura prensada. Dispensando-se a refrigeração e tendo-se menor conteúdo de água, torna-se mais econômico o transporte. Além disso, a levedura, nessa forma, resiste a estocagem por um período de tempo mais longo, podendo ser armazenada em muito maior quantidade. Contrabalanceando essas vantagens, entretanto, a levedura seca ativa exige cuidado especial no que se refere à temperatura para sua desidratação e apresenta uma capacidade fermentativa inferior a da levedura prensada. Novos produtos semelhantes à levedura seca ativa, porém obtidos na forma de pó, constituem um aperfeiçoamento na produção de leveduras de panificação. Eles reuniram as principais características favoráveis da levedura prensada e da levedura seca ativa.
A levedura seca ativa é comercializada em embalagens de diferentes tamanhos, de acordo com o emprego a que se destina e, geralmente, sob condições de ausência de oxigênio ou presença de gases inertes principalmente o nitrogênio. 
Esse cuidado permite estender o período de armazenamento, que geralmente não pode ultrapassar um a dois meses em presença de ar, para um período tão longo quanto um ano. Entretanto, independente da presença ou ausência de ar nas embalagens, a conservação desse produto é inversamente proporcional a temperatura de armazenamento. Sendo assim, embora não necessária, a refrigeração do produto é vantajosa.
Uma levedura denominada "levedura ativa seca protegida", obtida pela incorporação de agentes antioxidantes antes da desidratação, constitui-se na mais recente inovação nesse campo. Esse produto apresenta resistência ao armazenamento em presença de ar igual à obtida quando o produto é conservado sob condições de ausênciade ar ou presença de nitrogênio. Essa inovação permite a comercialização de produtos de panificação pré-crescidos, por ação de leveduras previamente incorporadas, sem que se torne necessária à ausência de ar ou a presença de nitrogênio nas embalagens.
Como alternativa ao uso de melaço, em regiões madeireiras (Canadá, países escandinavos), onde essa matéria-prima é escassa e onde existem numerosas indústrias de papel, o licor sulfítico, resíduo dessas indústrias, tem sido utilizado com sucesso na produção de leveduras para panificação. Alterações profundas no processo convencional, utilizando melaço, tornam-se necessárias. Essas alterações estão relatadas em um grande número de métodos patenteados.
7.3 Aplicação das Leveduras em Processos Fermentativos
Comentário: Em bebidas alcoólicas fermentadas, como o vinho e a cerveja, as leveduras são uns dos principais agentes de transformação da matéria orgânica. Esses microrganismos somados aos demais constituintes do processo de fabricação proporcionam a conversão da matéria-prima em um produto específico, com odor, sabor, cor e diversas outras características próprias. Mas, a qualidade do produto final somente é alcançada quando todos esses constituintes do processo estão funcionando adequadamente, isto é, tanto a função das leveduras como o controle das operações unitárias, o controle de temperatura, pressão, pH e demais variáveis.
Nem todos os tipos de levedura podem ser utilizados em determinado processo. O fato de conhecer quais os tipos de microrganismos ideais e como eliminar a presença dos indesejáveis é de extrema importância na indústria. Por exemplo, o produto que está sendo desenvolvido com leveduras ideais sofrerá grandes alterações caso também estejam presentes leveduras indesejáveis. É o que se chama de contaminação microbiológica, no caso da cerveja a contaminação por leveduras selvagens é um caso muito temido.
Um trabalho que vem sendo desenvolvido pela ciência é a obtenção de linhagens especiais de leveduras. Diversos fatores positivos relativos a esse trabalho podem ser analisados. Por exemplo, no passado a elaboração de um levedo era uma arte empírica, isto é, o cervejeiro não tinha nenhuma base teórica para fazer uma seleção correta.
Tudo o que se conhecia era proveniente da prática, como uma tentativa de erro e acerto. Desde os tempos de Pasteur, o reconhecimento, prova, seleção e manutenção de boas linhagens de leveduras da cerveja foram colocadas em bases científicas. O pioneiro nesse campo, foi um contemporâneo dinamarquês de Pasteur, Hansen, que trabalhava na famosa cervejaria de Carlsberg, em Copenhague. Ele começou isolando e estudando muitas linhagens de leveduras da cerveja. Usando essas linhagens puras na produção de cervejas experimentais, conseguiu demostrar que o tipo e a qualidade da cerveja são enormemente influenciados pela levedura empregada. Inventou também um propagador de leveduras, que podia ser usado no cultivo de um levedo puro, em condições assépticas, e em quantidades suficientes para inocular uma cuba de fermentação. Mesmo em cervejarias modernas, o processo real de fermentação nunca é realizado assepticamente, mas, graças ao trabalho de Hansen, o cervejeiro pode iniciar sua fermentação com uma linhagem de levedura pura, de propriedades conhecidas, eliminando assim, grandemente, os riscos e incertezas que ocorriam na antiga prática da transferência, em massa, de culturas mistas, de cuba a cuba.
7.4 Obtenção da Cerveja
A cerveja e produtos correlatos são bebidas de baixo teor alcoólico (2 a7%) feita pela fermentação de diversos cereais com lúpulo, usualmente adicionado para dar um gosto mais ou menos amargo e para controlar a fermentação. Os cereais empregados são a cevada, maltada para desenvolver as enzimas necessárias e adquirir o sabor desejado, assim como adjuntos do malte; arroz descascado, aveia e milho. Açúcares e xaropes de fermentação (açúcar de milho, ou glicose) e leveduras completam as matérias-primas. Para a cerveja o cereal mais importante é a cevada, que é parcialmente convertida em malte por germinação.
7.4.1 Preparação do mosto frio com lúpulo a partir da infusão inicial
Maltagem: maceração dos materiais moídos com a água, com controle de pH. Em cozinhador a pressão, o amido insolúvel passa a amido solúvel que é convertido a dextrina e aos açúcares do malte. 
Filtração: depois de todos os ingredientes terem sido dissolvidos o mosto é filtrado para a separação de grãos usados insolúveis. 
Cozimento: o mosto é cozido em contato com o lúpulo em um cozinhador de cobre. O objetivo é concentrar o mosto, esterelizá-lo, destruir todas as enzimas, coagular certas proteínas, modificar o odor de malte e extrair o tanino das resinas do lúpulo e o cheiro do lúpulo. Após, faz-se a lavagem e separação do lúpulo. 
Resfriamento: além da redução da temperatura, realiza-se a absorção de ar para facilitar o início da fermentação. 
7.4.2 Fermentação
O mosto resfriado é misturado a castas selecionadas de leveduras. A temperatura inicial da fermentação é entre 4,4 a 6,1° C; à medida que a fermentação avança, a temperatura sobe a 14,4° C. Isto pelo fato da conversão do açúcar a dióxido de carbono e álcool etílico, provocada pelas enzimas das leveduras, gera 280 Btu lb de maltose convertida.
O desprendimento contínuo de dióxido de carbono carrega as substâncias estranhas para a superfície, onde devem ser retiradas (escumação).
7.4.3 Armazenamento, polimento e acondicionamento para o mercado
Armazenamento: a cerveja é resfriada a 0° C e armazenada e uma adega. Durante este período, ocorrem a clarificação, a separação e a precipitação das resinas insolúveis, além da melhoria (maturação) do gosto.
Polimento e acondicionamento: a cerveja é carbonatada e bombeada através de um filtro de polpa com ou sem um auxiliar de filtração anódino ao gosto. Depois de engarrafada a cerveja é pasteurizada a 60° C.
7.5 Obtenção do Vinho
O vinho é feito há vários milhares de anos pela fermentação do suco de uva. Nos dias de hoje, como antigamente, a qualidade do produto depende em grande parte da uva, do solo e da insolação, que provocam modificações no paladar, no buquê e no aroma. A coloração depende em grande parte da natureza das uvas e do fato de as cascas serem prensadas ou não antes da fermentação. Os vinhos se classificam em naturais (álcool entre 7 a 14%), fortificados (14 a 30%), secos ou doces, suaves ou espumantes.
Vinho tinto seco: na fabricação são utilizadas uvas vermelhas ou pretas. As bagas passam por um esmagador, que as macera, mas não rompe as sementes, e remove parte dos engaços. A polpa resultante, ou mosto, é bombeada para tanques onde se adiciona ácido sulfuroso para obstar o crescimento de leveduras selvagens. Adiciona-se então uma cultura ativa e selecionada de leveduras, em volume da ordem de 3 a 5% do volume do mosto. Na fermentação a temperatura se eleva, de modo que são necessárias serpentinas de resfriamento para manter a temperatura abaixo de 29° C. O dióxido de carbono que se desprende arrasta os engaços e as sementes para a superfície, o que é parcialmente impedido por uma grade imersa na dorna. Com isso se efetua a extração da coloração e do tanino das cascas e sementes. Quando a fermentação amortece, o mosto é bombeado pelo fundo da dorna e retorna à superfície. O vinho é, depois, lançado em tanques fechados na adega, onde, durante um período de duas a três semanas, as leveduras fermentam o restante do açúcar. 
Na adega, o vinho recebe um tratamento para clarificar-se, ter o gosto melhorado e diminuir o tempo de envelhecimento. Durante esse tratamento, o vinho permanece em repouso por umas seis semanas, para remover parte da matéria em suspensão, e, depois, é trasfegado para clarificação ou para a filtração. O vinho é ajustado aos padrões comerciais mediante a misturação de várias partidas e pela adição de açúcar, de ácidos ou taninos.
 
8. Desvantagens das Leveduras
(Patologias)
  
Fig. (8.1 e 8.2) - Candidíase oral.
 
Fig. (8.3, 8.4 e 8.5) Candidíase mucocutânea crônica. Nessadoença o paciente tem infecções recidivantes crônicas das unhas, regiões periungueais, da pele e das mucosas por Cândida, usualmente Cândida albicans. Comumente há destruição total da unha. 
Fig. (8.6) - Balanite por Cândida. O microorganismo pode proceder do trato gastrointestinal do próprio paciente ou da vagina da parceira sexual. 
9. Atualidades
Artigos obtidos na internet (ver referência bibliográfica).
9.1. Proteínas Recombinantes Produzidas em Leveduras 
Fernando Araripe Gonçalves Torres
PhD, Professor Adjunto do Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília
Lídia Maria Pepe de Moraes
PhD, Professora Adjunto do Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília
Considerações sobre o uso de leveduras para a expressão de proteínas de interesse econômico
Fotos cedidas pelos autores
9.1.1. A levedura Saccharomyces cerevisiae
As leveduras são fungos que têm sido utilizados pelo homem há milhares de anos e cuja manipulação causou um grande impacto na produção de alimentos e, por conseguinte, influenciando o próprio processo de desenvolvimento sócio-econômico da humanidade. O pão, a cerveja e o vinho representam os produtos mais expressivos do processo de manipulação desses microrganismos ao longo do tempo. Em todos esses processos, a levedura Saccharomyces cerevisiae teve um papel de destaque. Além de ser considerada um dos microrganismos mais úteis ao homem, essa levedura é um dos sistemas eucarióticos mais bem conhecidos. Sua genética é bem dominada e seu genoma foi totalmente seqüenciado, fato este que representou uma das maiores conquistas da Biologia no século XX. Após o advento da tecnologia do DNA recombinante, a levedura S. cerevisiae pôde ser empregada em estudos de genética molecular a partir do final dos anos 70, quando ela foi geneticamente transformada pela primeira vez. Desde então, vários tipos de vetores moleculares foram desenvolvidos, inclusive cromossomos artificiais, mais conhecidos como YAC ("Yeast Artificial Chromosomes"). Com a obtenção de cepas de leveduras mutantes foi possível o isolamento de genes de outros organismos eucarióticos por complementação. Nos últimos anos, foi desenvolvida em S. cerevisiae uma das mais sofisticadas abordagens para a identificação de genes interativos. Trata-se de uma técnica conhecida como sistema duplo-híbrido ou "two hybrid", que propicionou a identificação de vários genes envolvidos em vias de transdução de sinal e no ciclo celular. 
No campo da pesquisa aplicada, a levedura S. cerevisiae logo se destacou como um interessante candidato para a expressão de genes heterólogos de interesse biotecnológico. Embora a bactéria Escherichia coli represente uns dos mais poderosos sistemas de expressão heteróloga, várias proteínas eucarióticas de interesse comercial não puderam ser expressas eficientemente nesse microrganismo.
Entre as razões para esses insucessos poderíamos citar: conformação incorreta, ausência de modificações pós-traducionais e baixos níveis de expressão. Alguns desses problemas puderam ser resolvidos quando as mesmas proteínas foram expressas em S. cerevisiae. O ambiente intracelular da levedura é adequado para a ocorrência de várias reações que normalmente ocorrem em células de mamíferos. 
Além do mais, S. cerevisiae goza do status de microrganismo "GRAS" ("Generally Recognized As Safe") o que é de suma importância no que se refere à produção de biofármacos por engenharia genética. No entanto, várias proteínas humanas sofrem hiperglicosilação quando secretadas por S. cerevisiae o que será discutido mais adiante. 
9.1.2. A levedura metilotrófica Pichia pastoris
Ao longo das últimas duas décadas, outras leveduras têm sido apresentadas como sistemas alternativos de expressão por apresentarem vantagens sobre S. cerevisiae. Entre esses novos sistemas, destaca-se Pichia pastoris, uma levedura metilotrófica, ou seja, que é capaz de crescer em meio de cultura contendo metanol como única fonte de carbono. O fato de crescer até alta densidade celular em um meio barato levou a empresa Phillips Petroleum Company a propor o uso dessa levedura como fonte de alimento ("single cell protein" - SCP). Após constatar que o processo de produção de SCP era inviável economicamente, a empresa decidiu transformar P. pastoris em um sistema de produção de proteínas recombinantes. 
A levedura P. pastoris apresenta duas características que a tornam uma atraente hospedeira para a produção de proteínas heterólogas. A primeira é o forte promotor usado para transcrever genes heterólogos, o qual é derivado do gene do álcool oxidase (AOX1) de P. pastoris. Esse promotor é regulado transcricionalmente por metanol, um indutor relativamente barato. Em células expostas a metanol como única fonte de carbono, o início da transcrição no promotor AOX1 é altamente eficiente e comparável aos promotores derivados dos genes altamente expressos da via glicolítica. No entanto, ao contrário dos promotores glicolíticos, o promotor AOX1 é firmemente regulado e reprimido sob condições de crescimento sem metanol. Uma vez que a maioria das proteínas heterólogas são de alguma forma deletérias para a célula, quando expressas em altos níveis, a habilidade de manter a cultura em um estado reprimido ou desligado é altamente desejável. Trata-se de uma importante precaução para minimizar a seleção de mutantes que não expressam o produto heterólogo durante o crescimento da cultura. Para ser ativado, o promotor AOX1 requer a presença de metanol e, na ausência desse indutor, ele se torna reprimido. Além de metanol, o sistema AOX1 necessita da ausência de glicose para ser plenamente ativado. Uma vez que o promotor AOX1 é controlado pela manipulação da fonte de carbono adicionado ao meio de cultura, o crescimento e a indução de cepas de P. pastoris, que expressam proteínas heterólogas, são facilmente obtidos em todas as escalas, desde frascos até grandes fermentadores. 
A segunda característica importante de P. pastoris é que esta levedura não é considerada uma forte fermentadora, como S. cerevisiae. A fermentação realizada por leveduras gera etanol, o qual, em culturas de alta densidade, pode rapidamente atingir níveis tóxicos ("efeito Crabtree"). Para uma produção economicamente viável de proteínas recombinantes a concentração de proteínas no meio deve ser proporcional à quantidade de células. É necessário, pois, atingir níveis de alta densidade celular os quais não são facilmente obtidos com S. cerevisiae. Em contraste, as cepas produtoras de P. pastoris são facilmente cultivadas a densidades celulares de aproximadamente 100 g/L de peso seco, ou até maiores. 
Vários genes de diferentes procedências (bactérias, fungos, invertebrados, plantas e humanos) já foram expressos em P. pastoris sob o controle do promotor AOX1. A maioria dos genes expressos tiveram seus produtos secretados para o meio extracelular e alguns, como o fator de necrose tumoral humano, foi produzido no ambiente intracelular. Os vetores de expressão em P. pastoris são geralmente do tipo integrativo. Esses vetores possuem um cassete de expressão formado pelo promotor e pela região terminadora de transcrição do gene AOX1 além de uma marca de seleção, sendo a mais utilizada o gene histidinol desidrogenase (HIS4) de P. pastoris. Essa marca permite a seleção de transformantes prototróficos His+ a partir de uma linhagem hospedeira his4. Um dos vetores mais utilizados é o plasmídio pPIC9 (Figura 1) desenvolvido e patenteado pela empresa Invitrogen. O gene de interesse é clonado na região do cassete de expressão em um dos sítios de clonagem que se localizam logo após o sinal de secreção, nesse caso, o peptídeo sinal do fator a de S. cerevisiae. O cassete de expressão é liberado pela digestão do plasmídio com a enzima de restrição BglII, e uma cepa his4 de P. pastoris é transformada por eletroporação. Como em S. cerevisiae, o DNA linearizado pode gerar transformantes estáveis quando se integra no genoma por recombinação homóloga. Esses transformantes podem se originar pela integração do cassete de expressãotanto no locus AOX1 quanto no his4. No primeiro caso, pode haver uma substituição completa do gene AOX1 pelo cassete de expressão, o que resulta em um fenótico denominado Muts, caracterizado por um crescimento lento na presença de metanol. Ocasionalmente, o cassete de expressão pode se integrar várias vezes no locus AOX1, o que pode ser confirmado por análise de "Southern blotting". Outros vetores, semelhantes ao pPIC9, não possuem sinais de secreção e, portanto, são empregados para a expressão intracelular. Existem variantes do pPIC9 que não possuem o sinal de secreção no cassete de expressão sendo, portanto, ideais para expressão intracelular. 
Embora muito utilizados, os vetores descritos anteriormente têm como desvantagens o grande tamanho (cerca de 8 Kb) e a presença de poucos sítios de restrição para a clonagem do gene heterólogo. Há uma família de vetores de P. pastoris que contém o gene Sh ble, que confere resistência à droga zeocina tanto em E. coli quanto em P. pastoris. Embora esses vetores sejam bem menores que o pPIC9, o preço proibitivo da droga de seleção inibe o uso desse sistema em escala industrial. Recentemente, novos plasmídios com promotores alternativos se tornaram disponíveis. Esses vetores contêm o promotor GAP, um forte promotor constitutivo derivado do gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAP).
Em culturas crescidas em glicose, os níveis de expressão obtidos pelo promotor GAP são similares àqueles obtidos com o promotor AOX1 em culturas crescidas com metanol em frascos. Uma das vantagens do promotor GAP com relação ao promotor AOX1 é que, por ser constitutivo, não é necessário mudar a cultura de um meio para outro para induzir expressão. No entanto, o uso do promotor GAP é apropriado somente para genes cujo produto não seja deletério para a célula. Além do mais, os níveis de expressão a partir do promotor AOX1 são geralmente aumentados quando o metanol é adicionado à culturas com taxas de crescimento limitantes em fermentadores. O mesmo fenômeno não é observado com o promotor GAP. 
9.2. Expressão heteróloga em P. pastoris
Sendo P. pastoris um organismo eucariótico, a produção de proteínas heterólogas neste sistema é um processo mais complexo do que em E. coli. Mesmo as proteínas que são produzidas em P. pastoris em concentrações acima de 1 g/L podem apresentar, em frascos, níveis desapontadores de produção inicial (menos de 1 mg/L). A geração de uma linhagem produtiva requer um grande esforço de investigação para se controlar os fatores que possam limitar a produção da proteína heteróloga, assim como desenvolver estratégias para otimização da produção. Para a detecção de baixos níveis de expressão, um fator chave para a obtenção de uma linhagem de P. pastoris produtiva é a disponibilidade de anticorpos específicos para a proteína heteróloga de interesse. É aconselhável que a seleção de clones prototróficos que expressam a proteína de interesse deva ser iniciada pela detecção imunológica do mesmo. Essa etapa permite selecionar clones expressando a proteína heteróloga em diversos níveis, o que poderia implicar a existência de clones com diversos números de cópias integradas do gene de interesse. 
A maioria das proteínas secretadas por P. pastoris são glicosiladas, o que pode ou não afetar a atividade biológica da proteína recombinante. A glicosilação é uma modificação pós-traducional que ocorre, primeiramente, no retículo endoplasmático e, posteriormente, no aparelho de Golgi. Observou-se que o tamanho da cadeia de carboidratos adicionados por P. pastoris é bem menor que aquele adicionado por S. cerevisiae. A estrutura destes oligossacarídeos é muito similar à adicionada em mamíferos e, por não ser capaz de adicionar manoses terminais com ligações a-1,3, como S. cerevisiae, as proteínas produzidas em P. pastoris são menos imunogênicas. Todavia, se a glicosilação não é desejada, as proteínas de interesse devem ser produzidas intracelularmente. Algumas proteínas expressas em P. pastoris apresentaram um núcleo de glicosilação pequeno, como no caso da invertase de S. cerevisiae. Outras, como a proteína gp120 do HIV, apresentaram um padrão de glicosilação semelhante ao obtido em S. cerevisiae. Ainda não está claro porque a algumas proteínas são adicionadas cadeias externas longas de carboidratos e a outras apenas o núcleo central. 
A levedura P. pastoris ganhou grande aceitação com organismo hospedeiro para a produção de proteínas heterólogas de interesse farmacológico. 
Entre essas proteínas, destacam-se: a albumina sérica humana - que já esta em testes clínicos para seu uso como produto de substituição de plasma -, e o antígeno de superfície da hepatite B - que foi aprovado para se fazer uma vacina contra esse vírus. Em nosso laboratório, temos empregado o sistema de expressão em P. pastoris para a expressão de várias proteínas de interesse biotecnológico. Algumas proteínas recombinantes serão utilizadas para fins farmacêuticos e outras para processos de conversão de biomassa. 
Dentre as proteínas já expressas por nosso grupo, destacam-se:
· a-amilase de Bacillus subtilis (sozinha ou fusionada a uma glicoamilase de Aspergillus awamori); 
· um fragmento de anticorpo (scFv) anti-Z-DNA; 
· celobiohidrolase I.2 de Humicola grisea var thermoidea.. 
No caso da proteína de fusão formada pelo gene da a-amilase de Bacillus subtilis e o cDNA da glicoamilase de Aspergillus awamori, a expressão foi realizada em duas linhagens de P. pastoris: uma protease negativa e a outra protease positiva. Os resultados preliminares mostraram que a melhor condição de expressão foi obtida quando a linhagem protease positiva foi usada e quando três cópias em sequência haviam sido integradas (Figuras 2 e 3). Aparentemente, o uso da linhagem protease negativa não é o ideal quando a expressão ocorre em altos níveis devido à necessidade de processamento pós-traducional da proteína de fusão. Por outro lado, no caso da expressão do fragmento de anticorpo scFv, o melhor resultado foi obtido com uma linhagem protease negativa já que a proteína recombinante mostrou ser suscetível à ação das proteases produzidas por P. pastoris. Como no caso da proteína de fusão, a expressão da clobiohidrolase I.1 de Humicola grisea var. thermoidea, o melhor resultado foi obtido com uma linhagem protease positiva. Experimentos preliminares demonstraram baixos níveis de expressão em frasco (cerca de 10 mg/L para a fusão e 1 mg/L para o fragmento scFv). No entanto, o rendimento poderá ser sensivelmente maior quando as condições de expressão em fermentador forem ajustadas. 
  
9.3. Perspectivas futuras
Com a finalidade de reduzir os custos das etapas "downstream" de produção de proteínas recombinantes a partir de P. pastoris, estamos construindo novos vetores que possibilitem a rápida purificação da proteína de interesse. Estamos também desenvolvendo novas estratégias que permitam a co-expressão de duas subunidades protéicas que formariam, então, uma proteína heterodimérica funcional. Essa estratégia seria útil para a expressão de alguns hormônios proteicos. Em longo prazo, pretendemos isolar, a partir da biodiversidade do cerrado, novas espécies de levedura que possam ser empregadas como hospedeiras alternativas para expressão heteróloga. Esses novos sistemas poderão, eventualmente, reduzir os custos de produção com o pagamento de royalties ao exterior quando são utilizados sistemas de expressão já patenteados. 
9.4. Referências bibliográficas
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10. A produção de etanol
O Brasil tem larga experiência na produção de álcool combustível. O Programa Nacional do Álcool desencadeado no final dos anos 70, decorrente da crise do petróleo, gerou uma série de tecnologias próprias, tornando o nosso país líder mundial nesse sentido. Não poderia deixar de ocorrer, portanto, o desenvolvimento de processos visando à produção de linhagens melhoradas da levedura Saccharomyces cerevisiae, responsável pela produção de etanol. Linhagens mais produtivas, com características desejáveis para produção de etanol e com monitoramento na indústria por técnicas de marcação molecular, foram desenvolvidas em vários laboratórios, salientando-se mais uma vez os da ESALQ/USP, em Piracicaba. Por tecnologia do DNA recombinante, os laboratórios de pesquisa das universidades de Brasília e da USP desenvolveram em conjunto linhagens de leveduras contendo genes de amilases capazes de utilizar o amido, por exemplo de mandioca ou batata-doce, na produção de etanol. Essas leveduras manipuladas geneticamente estão sendo aperfeiçoadas e poderão desempenhar um importante papel na produção de etanol. A tecnologia do DNA recombinante tem sido também usada por esses e outros laboratórios brasileiros e do exterior na clonagem e seqüenciamento de genes de interesse industrial em fungos.
A biotecnologia na enologia
Um outro exemplo, também brasileiro, é o do melhoramento via fusão de protoplastos com produção de híbridos, empregando-se espécies diferentes de leveduras utilizadas na fabricação do vinho. Por fusão de protoplastos, foi obtido um híbrido entre as leveduras Saccharomyces cerevisiae e Schizossaccharomyces pombe reunindo características favoráveis dos dois gêneros de fungos em uma só célula (figura 6). Esta, multiplicada e retrocruzada com a linhagem original de Saccharomyces cerevisiae, resultou em linhagem capaz de utilizar uvas ácidas, como as que ocorrem em certas safras na região Sul do país, na produção de vinhos finos, sem necessidade de utilização de fermentações mistas (duas espécies de leveduras) ou, o que seria pior, adição de açúcar. Esse trabalho resultou em patente que está em vigor, e a levedura melhorada desenvolvida na Universidade de Caxias do Sul (UCS), no Rio Grande do Sul, já está sendo utilizada com sucesso na produção de vinhos de alta qualidade.
 
HEPATITE B
SITUAÇÃO ATUAL E PERSPECTIVAS PARA O
CONTROLE DA HEPATITE B NO BRASIL
	Nikolai Granovski 
Assessor técnico-científico do Instituto Butantan, Presidente da N.G.Biotecnologia Ltda, São Paulo-SP. 
	Luzia Mitie Ioshimoto 
Pesquisadora do Instituto Butantan, São Paulo-SP. 
Fotos cedidas pelos autores 
 
10.1. Introdução
O progresso acelerado na área de Biologia Molecular, particularmente em relação ao conhecimento da resposta imune e da tecnologia do DNA recombinante, tem possibilitado o desenvolvimento de vacinas eficazes e muito mais seguras. Um dos melhores exemplos, é representado pela vacina recombinante contra a hepatite B, considerada totalmente segura pelo "FDA", após a aplicação de mais de 12 milhões de doses em bebês com até doze meses de idade. É recomendada para a vacinação em massa, por ter reduzido drasticamente a doença em vários países. 
Um programa global de imunização contra a hepatite B precisa ser bem caracterizado e executado, sob supervisão científica de especialistas, durante todo o longo processo, para garantir a sua eficácia.
O Brasil deve iniciar um programa baseado no conhecimento científico e na educação da população, e particularmente dos médicos, dos estudantes de medicina e de enfermagem. O conselho "Hepatitis Advisory Board", composto por especialistas em saúde de vários países, após uma pesquisa feita em 8 países europeus em 1997, descobriu que a hepatite B é uma doença menos conhecida que a AIDS, sendo que 60% dos entrevistados desconheciam que a hepatite B é uma doença hepática. Esta Comissão declarou "o vírus da hepatite B é 100 vezes mais infeccioso que o HIV, e no mundo a hepatite B mata em um dia mais pessoas do que a AIDS em um ano".
Esta revisão simplificada tem como objetivo orientar sobre os problemas que possam surgir no futuro em relação a vacinação contra a hepatite B no Brasil, e de contribuir para que a mesma seja feita de uma forma segura e eficaz. 
A hepatite B é a doença mais freqüente entre as hepatites infecciosas. É a nona causa de mortalidade no mundo (1,5 milhões de óbitos por ano), mas pode ser controlada por medidas profiláticas. O vírus da hepatite B (VHB) é transmitido por via parenteral através do sangue e seus derivados, pelo contacto sexual, por mães infectadas e seus bebês durante o parto, e pela exposição de mucosas a fluidos infectados. 
Há relatos de transmissão através de contatos íntimos por secreções como a saliva, urina, esperma, secreção vaginal e ainda através de agulhas entre drogados, por acupuntura, "piercing" e tatuagens. A transmissão é também observada entre membros de uma mesma família ou entre pessoas que convivem aglomeradas, em ambientes densamente povoados. 
A doença pode-se manifestar de forma fulminante, aguda, crônica ou inaparente (sem sintomatologia clínica). A fulminante e aguda (75 % em adultos e 10 % em bebês), são severas e causam mortalidade alta, mas a manifestação crônica (90 % em bebês) em 25 % dos casos leva o indivíduo à morte por cirrose e câncer de fígado. Mais de um milhão de portadores crônicos morrem a cada ano no mundo e só no Brasil há mais de três milhões deles, principais responsáveis pela disseminação do vírus na população. 
De uma forma didática o VHB é distribuído geograficamente em três áreas principais. A primeira, onde a prevalência do vírus é a mais baixa e engloba a América do Norte e o oeste europeu, com menos de 2 % de portadores crônicos e 4-6 % de indivíduos infectados, ou com marcadores virais presentes no sangue (antígenos ou anticorpos). A segunda, de prevalência média, engloba a América do Sul, Rússia, sul e leste da Europa onde 2-7 % são portadores crônicos e 20-55 % apresentam marcadores da presença do vírus. A terceira, de alta endemicidade é representada pelo sul e leste da Ásia, África Central e Bacia do Pacífico, onde 7-20 % são portadores crônicos e 70-90 % da população estão