proteínas recombinantes

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Produção de Proteínas 
Recombinantes 
 São proteínas produzidas artificialmente a partir de genes clonados. 
 Técnica de DNA recombinante. 
 
 A produção de proteínas recombinantes permite obter benefícios em várias 
áreas: 
 - saúde; 
 - biologia; 
 - bioquímica; 
 - microbiologia; 
 - genética; 
 - biotecnologia; 
 - agricultura; 
 - etc. 
 
 
 
Por que expressar proteínas recombinantes? 
 
•Dificuldade de se purificar do tecido original 
 
•Proteínas do tecido podem estar contaminadas 
 
•Proteínas recombinantes podem ser engenheiradas 
 
•Processo completamente controlado 
 
•Especificidade 
 
•Quantidade 
• Terapia gênica 
Possibilidade de introdução de um gene num organismo e 
consequente correção de doenças genéticas. 
 
• Melhoramento animal e vegetal 
Plantas resistentes a pragas e a 
diferentes meios nutritivos. 
Animais de maiores dimensões, mais férteis 
e carne com maior qualidade. 
 
• Criação de modelos animais 
Ideais para o estudo da estrutura, função e regulação de um gene, 
além de facilitar a compreensão da fisiopatologia da doença. 
Algumas aplicações 
www.dqb.fc.ul.pt 
Técnica de produção de proteínas recombinantes 
 
 
• Isolar e preparar o DNA; 
• Escolher o vetor apropriado; 
• O fragmento de DNA a clonar é 
introduzido em vetores de clonagem, 
formando-se o DNA recombinante. 
• O DNA recombinante é inserido na célula 
hospedeira – transformação, que possui 
mecanismos enzimáticos para a replicação 
do DNA e para a síntese proteica; 
• Seleção e identificação de células que 
incorporam o DNA recombinante; 
• Verificar se a proteína foi expressa; 
• Remoção e purificação das proteínas. 
The Cell- A Molecular Approach;Cooper, Geoffrey M.. 
Algumas enzimas envolvidas no processo 
Enzimas Função 
Tipo II (endonuclease de restrição) Cortam os DNAs em sequências de 
bases específicas. 
DNA ligase Juntam duas moléculas de DNA ou 
fragmentos. 
Taq DNA polimerase Adiciona os nucleotídeos na 
extremidade 3´ da cadeia de DNA. 
Transcriptase reversa 
 
Produz uma molécula de DNA 
através de uma molécula de RNA. 
● Enzimas de restrição - Endonucleases 
 Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas 
recombinantes são normalmente gerados por digestão através de 
endonucleases de restrição. 
 
 . Recoonhecem pequenas sequências específicas com 4 a 6 
pares de bases - palíndromes. 
 . São designadas por três letras: EcoRI, HindIII. 
 
Vetores de clonagem 
 Capaz de transportar uma sequência de DNA estranha dando origem a um 
DNA híbrido ou recombinante. 
 Capacidade de se auto-replicar. 
 Conter pelo menos um gene que confira resistência a antibióticos. 
 Possuir locais de restrição únicos, polylinker, MCS. 
 Fácil de purificar. 
 
Tipos de vetores de clonagem 
• Plasmídeos (pBR322) 
• Fosmídeos 
• Cosmídeos 
• Bacteriófagos λ, YACs, BACs 
 
 
 
www.biologianaweb.com/ Livro2/C11/pbr322.html 
 
http://www.biologianaweb.com/Livro2/C11/pbr322.html
Vetores de expressão 
 
• Promotor 
• Codon de iniciação seguido de polylinker 
• Local de ligação ao ribossomo 
 
 
 
 
 
www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html 
 
 Promotor 
Local de ligação ao 
ribossoma 
Sítio de clonagem e 
sequência codificante de 6 
histidinas 
 
www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html 
http://www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/Expression-Ecoli/trans-15.jpg
http://www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/Expression-Ecoli/expression.html
http://www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/Expression-Ecoli/expression.html
Transformação 
 
 Ocorre quando uma célula incorpora e 
expressa um fragmento de material 
genético. 
 
 Para a introdução do DNA recombinante 
(“delivery” de DNA) podem ser utilizados 
vários métodos: 
 
• Células competentes (choque térmico); 
• Eletroporação; 
• Bombardeamento de DNA revestido em 
partículas de Tungstênio ou ouro; 
• Microinjecção; 
• Transfecção. 
 
 
 
Modern Genetic Analysis. 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=mga.TOC
Extração e purificação de proteínas 
 • Extração lise celular 
 
• Purificação 
 Cromatografia de afinidade 
 Cromatografia de troca iônica 
 Cromatografia de gel filtração 
 
 
Gel filtração 
Cromatografia de afinidade 
 
Vantagens dos sistemas de 
expressão eucarióticos 
 - Dobramento das proteínas 
eucarióticas mais semelhante. 
- Modificações pós-traducionais. 
- Pode produzir grandes quantidades 
de proteínas com o uso de 
equipamentos próprios 
(fermentadores). 
Desvantagens dos sistemas de 
expressão eucarióticos 
- Sistemas caros 
-Necessitam equipamentos 
adequados 
- Poucos vetores disponíveis - Adequado para proteínas ricas em 
cisteínas- pontes dissulfeto. 
- Níveis de expressão mais baixos. 
Tags moleculares de fusão 
Fusion Tag Immobilized 
Ligand 
Binding Conditions Elution Conditions Available Formats 
Glutathione (S-
transferase(GS
T) 
Reduced glutathione Neutral (physiologic) pH, 
and non-denaturing; 
glutathione must be 
reduced and GST must be 
active 
Free reduced 
glutathione at neutral 
pH (competitor) 
Prepacked column 
kits, spin cup column 
kits, SwellGel Discs, 
coated microplates 
Histidine-tagged Chelated Nickel or 
Cobalt 
Neutral (physiologic) pH 
without reducing or 
oxidizing agents; small tag 
must be accessible in 
fusion protein structure; 
high ionic strength and 
denaturants (chaotropes 
such as 8 M urea) 
compatible. 
>200 mM Imidazole, 
low pH, or strong 
chelators 
Prepacked column 
kits, spin cup column 
kits, SwellGel Discs, 
Swell- Gel Discs in 
96-well filter plates, 
coated microplates 
Maltose 
Binding 
Protein (MBP) 
Dextrin Neutral (physiologic) pH 
and non-denaturing; NaCl 
added to reduce 
nonspecific binding 
Maltose at neutral pH 
(competitor) 
Gel slurry, coated 
microplates 
Green 
Fluorescent 
Protein (GFP) 
Anti-GFP antibody Neutral (physiologic) pH 
and non-denaturing 
Usual 
antibody/antigen 
elution buffers (e.g., 
low pH or chaotropic 
salts) 
Coated microplates 
Exemplos de Proteínas Recombinantes 
 Hormônio de crescimento humano – durante a infância permite a 
correção dos casos de nanismo. 
 
 Anticoagulantes – ativadores de tecido plasminogênico que por sua 
vez ativam a plasmina, enzima que dissolve os trombos (evita ataques 
cardíacos). 
 
 Superóxido Dismutase – previne danificação de tecidos quando 
expostos à falta de oxigênio. 
 
 Anticorpos monoclonais –usados em testes 
 diagnósticos; transporte direcionado (drogas, 
 toxinas, componentes radioativos utilizados na 
 terapia cancerígena), assim como outras 
 aplicações. 
 
 
ioh.medstudents.com.br/ humoral.htm 
Cronologia 
 
• 1922 - Frederick Grant Banting descobre a insulina. 
 
• 1978 - É produzida insulina humana recombinante. 
 
• 1982 - Esta insulina é disponibilizada no mercado. 
Insulina 
Insulina 
- Duas cadeias peptídicas- cadeia A e cadeia B. 
- Duas pontes dissulfureto entre as cadeias A e B e outra na própria cadeia A. 
 
 
Insulina recombinante 
Insulina lispro 
http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm 
http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm 
Monômeros- Insulina é 
ativa na forma de 
monômeros. 
 
Dímeros – pontes de 
hidrogênio entre as 
 extremidades C da 
cadeia B. 
 
 Hexâmeros – na 
presença de Zn 2+ 
 
Produção de insulina 
• Insulina proveniente de suínos e bovinos 
• Insulina humana biossintética 
 
 
 
Introduction to Genetic Analysis. 
 
Β-gal 
Purify β-gal- insulin 
fusion proteins