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E S T A D O D E G O I Á S
Universidade Estadual de Goiás
Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas
	
Universidade Estadual de Goiás - CCET
Anápolis; 31 de maio de 2016.
Professora: MSc. Caroline
Acadêmicas: Bianca de Souza, Geovanna Kelly, Ianca Ramos, Lorene Fernandes e Sarah Gomes
Estudo Dirigido de Análise Instrumental - Curso Farmácia 2016/1
1- Conceitue cromatografia líquida de alta eficiência e diferencie cromatografia líquida de fase normal e cromatografia líquida de fase reversa. 
É uma técnica utilizada para separar e determinar espécies em uma grande variedade de materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos. Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, com alta resolução, eficiência e sensibilidade. É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel (solvente) que é eluída sobre altas pressões. 
Diferença cromatografia líquida de fase normal e cromatografia líquida de fase reversa é que na fase normal a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, enquanto que na fase reversa a fase estacionária é menos polar que a fase móvel. 
2- Explique os fundamentos das técnicas de cromatografia líquido-sólido (ou adsorção), cromatografia por bioafinidade e cromatografia por exclusão.
A principal etapa ao se utilizar essa técnica em cromatografia líquido-sólido (ou adsorção), é o empacotamento, o qual, entre outros fatores, definirá a eficiência da separação. As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionária líquida. Fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases estacionárias líquidas por partição. O soluto é retido pela superfície da fase estacionária através de interações químicas ou físicas. Esta técnica é muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas.
A cromatografia por bioafinidade é um tipo de cromatografia que se baseia nas propriedades biológicas das macromoléculas biológicas e permite o isolamento seletivo destas, através da utilização das propriedades dessas substâncias de unirem-se reversivelmente a ligantes específicos que se encontram imobilizados covalentemente à matriz ou suporte. A eluição das moléculas ligadas pode ser feita por alteração do pH e/ou força iônica do meio, que tornam o complexo molécula-ligante menos estável, levando à dissociação do mesmo, o que conduz à sua purificação. 
A cromatografia por exclusão, também conhecida como filtração gel, permeação em gel e peneira molecular, é um método que promove uma seletiva e dinâmica distribuição das moléculas do soluto entre duas fases líquidas separadas, e dependentes de uma estrutura estacionária, contendo poros de tamanho controlado. 
O termo gel refere-se a um material elástico que contém água. Este possui uma estrutura tridimensional, cuja estabilidade mecânica é dada pelo material contendo espaços (poros) que contém líquido. Partículas pequenas dão melhor resolução e eficiência. O aumento do tamanho das partículas resulta em espalhamento da zona no interior dos poros. O gel quimicamente definido deve permitir variações para o fracionamento em diferentes intervalos de massa molecular.
3- Sobre a fase móvel:
a) Cite alguns cuidados a serem tomados na preparação da fase móvel.
Ao se trabalhar com água, tomar todos os cuidados para que não se forme fungo dentro da coluna. Lavar sempre o sistema abundantemente e passar um agente de esterilização (por ex, MeOH ou Acetonitrila). Para análise de açúcares utilizar água ligeiramente acidificada. O mesmo cuidado se deve ter quando se trabalha com solução tampão. Nesse caso uma atenção a mais deve ser dada. Não deixar o sistema parado quando se trabalha com tampão, pois pode cristalizar sal na região do pistão da bomba. Ao se reiniciar o trabalho, esse sal cristalizado pode danificar o corpo do pistão. Embora existam vários solventes, é importante ter cuidado na escolha, três deles são mais utilizados: água, metanol e acetonitrila. No preparo da fase móvel deve-se filtrar o solvente e desgaseificá-lo, já em mistura de acetonitrila e água a desgaseificação deve ser feita em temperatura baixa devido à grande volatilidade da acetonotrila.
b) Qual a diferença entre eluição isocrática e gradiente?
A eluição isocrática utiliza o mesmo solvente em todo o desenvolvimento cromatográfico. A eluição por gradiente, no entanto, tem uma variação da composição do eluente.
4- Qual o principal tipo de detector usado em HPLC? Quais vantagens este apresenta em relação aos outros?
Espectrofotômetro UV-Visível (UV-VIS) É o detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das substâncias absorvem radiação UV. 
As vantagens em relação aos outros são:
•O comprimento de onda é variável entre 190nm e 800nm selecionado através do monocromador (UV = lâmpada de deutério e VIS = lâmpada de tungstênio).
•Possui maior aplicação, pois permite selecionar o comprimento de onda mais adequado para os componentes a serem analisados;
•Maior sensibilidade: escolha do comprimento de onda de maior absorbância;
•Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto de interesse absorve e outros não;
•Permite a utilização de análise por gradiente: escolha do comprimento de onda onde os constituintes da fase móvel não apresentam variação de absorbância;
•Permite obter o espectro de absorbância de cada componente separado interrompendo o fluxo da fase móvel e assim selecionar o melhor comprimento de onda.
5- Quais são os parâmetros de adequação do sistema que são considerados na fase de desenvolvimento de um método analítico por HPLC? Explique.
Para que o HPLC tenha a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de compostos com grande eficiência, é necessário que o método analítico, siga os seguintes parâmetros para a adequação do sistema : Resolução (especifica se os compostos estão resolvidos um do outro, ligado a seletividade), simetria de pico ( se o pico for assimétrico quer dizer que ele não é seletivo pois tem várias substâncias no mesmo), nº de pratos teóricos (quanto maior números de pratos teóricos maior será a eficiência da coluna), seletividade (separação adequada dos constituintes da amostra) e fator de capacidade ( K' prime ). 
6- Quais são os testes realizados durante a validação de métodos analíticos? Descreva-os. Qual resolução da Anvisa descreve o processo de validação de métodos analíticos?
A resolução da Anvisa nº 899 de 29 de maio de 2003, estabelece um guia para o processo de validação de métodos analíticos e bioanalíticos. A metodologia será considerada validada, desde que sejam avaliados os seguintes parâmetros: especificidade e seletividade, linearidade, precisão, limite de detecção e quantificação, exatidão e robutez. O primeiro teste realizado é determinante para a validação, a especificidade, é a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz (placebos).
 A linearidade é a capacidade que a metodologia analítica tem de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. O coeficiente de correlação (r) deve ser = ou > 0,99. A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Esta é considerada em três níveis: repetibilidade, reprodutibilidade e precisão intermediária (inter-corrida). O Limite de detecção é a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, é estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível detectável. Já o limite de quantificação é a menor quantidade doanalito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.
A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro. E a robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos (ex: tempo de extração, temperatura, diferentes fabricantes de solventes, etc.). Ela indica sua confiança durante o uso normal.
7- Quais são as principais vantagens da cromatografia líquida de alta eficiência em comparação à cromatografia de coluna aberta? Quais são as principais vantagens da cromatografia de coluna aberta?
As principais vantagens da cromatografia líquida de alta eficiência em comparação com a de coluna aberta é que a CLAE é mais versátil. A versatilidade desta técnica reside no grande número de fases estacionárias existentes, as quais possibilitam análises e separações de uma ampla gama de compostos com alta eficiência. As separações em CLAE podem se dar por adsorção, partição ou ambos. Na CLAE emprega-se uma coluna fechada, reaproveitável; portanto, até centenas de separações individuais podem ser realizadas com a mesma coluna diferenciando-se assim da cromatografia de coluna aberta. Como vantagem da cromatografia de coluna aberta podemos citar o baixo custo financeiro, a fácil purificação de produtos de reações químicas, entre outras vantagens.
8- O que é volume morto da coluna? Como e porque calculá-lo?
O volume morto (VM	) é o volume de fase móvel necessário para eluir um componente não retido, correspondendo ao volume ocupado pela fase móvel dentro da coluna. Podendo ser calculado a partir do tempo morto e a velocidade de fluxo, F, em mL/min: VM = tM x F. Através de sua determinação é possível saber o tempo real de retenção da amostra ao material adsorvente.
9- Descreva as partes do equipamento HPLC e suas funções. 
As partes do equipamento são: Bombas de alta pressão: Permitem vencer a resistência à passagem da F.M. exercida pelas partículas da F.E. Proporcionando um fluxo constante e reprodutível de F.M. a todo o sistema. Injetor sistema de introdução de amostra: Injeção da amostra é realizada com auxílio de válvulas especiais que permitem introdução com grande precisão e exatidão de volumes que variam, em geral, de 5 a 20l. A amostra é introduzida na válvula com auxílio de uma microseringa com agulha sem ponta e a injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição de carga para a posição de injeção. Válvula de purga: Dispositivo que permite a troca rápida de solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno. Misturador: Dispositivo que homogeneíza a mistura de solventes quando operando com gradiente de eluição. Colunas cromatográficas: A separação é efetuada nas colunas cromatográficas, feitas em aço e resistentes a altas pressões (até 500 atm) Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária conveniente, geralmente sílica ou seus derivados, com granulometria de 3, 5, 7 ou 10 m (em alguns casos, até de 1 m) de diâmetro médio. Devido a queda de pressão elevada nos tubos, as colunas são relativamente curtas e de paredes espessas. Pré-coluna (Guard column): Removem partículas; substâncias que teriam forte interação com a coluna, e substâncias que possam precipitar quando em contato com a F.M. e F.E. . De forma geral, aumentam a vida útil das colunas. Detectores: identificar a presença de substâncias de interesse que estejam eluindo da coluna cromatográfica, proporcionando uma identificação e quantificação continua dos componentes da amostra. Podendo ser: Detectores baseados na absorção de luz UV/VIS; Detector no UV/VIS com arranjo de fotodiodos (DAD); Detectores baseados na fluorescência (> sensibilidade UV ); Detectores baseados no espalhamento da luz; Detectores baseados no índice de refração e Espectrômetro de massas (HPLC‐MS/MS). Registrador, um integrador ou um microcomputador: Processam os dados de cromatograma; Armazenam e registram; Controlam a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente), vazão da bomba, amostrador automático, temperatura da coluna.
10- Quais são as vantagens de usar um HPLC com bomba quaternária? E as desvantagens?
 Com a bomba quaternária pode-se fazer análise de amostras para as quais se necessita reduzir o tempo de eluição de compostos que apresentam alta interação com a fase estacionária da coluna (sem prejudicar a separação dos analitos menos retidos presentes na mesma amostra). Onde a mesma, proporciona a mistura da fase móvel, sob baixa pressão e de forma segmentada, de maneira que a mistura entre os solventes atravessa o sistema de bombeamento antes de, efetivamente, chegar ao misturador do sistema. Com esta bomba, pode-se alterar a concentração da fase móvel de modo que ocorra uma maior afinidade da F.M. pelos componentes presentes na coluna, separando-se os compostos.
Todavia, o uso da bomba quaternária causa maiores problemas na linha de base do detector e são mais problemáticas na transferência do método entre diferentes equipamentos. Em casos de insuficiente volume ou ineficiência para uma adequada homogeneização, o problema mais comum é o aumento do ruído da linha de base (na forma de ondulações). Nesse caso, quanto mais sensível for o detector às variações na composição da fase móvel, mais críticos serão os problemas com ondulações da linha de base. Outro problema que pode ocorrer em alguns casos é a deterioração da eficiência cromatográfica. Isso pode acontecer por causa de pequenas diferenças de interação localizadas ao longo do pico cromatográfico, em função das diferentes forças de eluição encontradas na fase móvel, e que levam à deformação da banda cromatográfica.