Purificação de Produtos Biológicos

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UNIVERSIDADE DO VALE DO TAQUARI - UNIVATES 
CURSO DE ENGENHARIA QUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
 
PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS BIOLÓGICOS 
 
 
 
Wendell Dall Agnol 
Douglas Henrique Welter 
Nícolas Andrighi 
 
 
 
 
Lajeado, abril de 2020
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Wendell Dall Agnol 
Douglas Henrique Welter 
Nícolas Andrighi 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS BIOLÓGICOS 
 
 
 
Trabalho apresentado na disciplina de 
Biotecnologia Industrial, como requisito para 
aprovação da disciplina na Universidade do 
Vale do Taquari - Univates. 
 
Professora: Cleide Borsoi. 
 
 
Lajeado, abril de 2020
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1. EXERCÍCIOS 
 
1. Para purificação dos produtos, as etapas de clarificação (centrifugação, 
filtração e microfiltração) e purificação de baixa (extração em sistemas de duas 
fases aquosas, precipitação, ultrafiltração e gel filtração) podem ser aplicadas. 
Explique, de maneira sucinta, cada uma destas técnicas. 
1.1 Etapas de clarificação 
1.1.1 Centrifugação 
Os sólidos presentes em uma suspensão sofrem ação da gravidade, sendo 
que, ao longo do tempo, se estiverem em repouso, sedimentam até o fundo do 
recipiente que estiverem contidos. A centrifugação, nada mais é do que uma 
operação unitária, que visa a aceleração dessa sedimentação, por meio de aplicação 
de um campo gravitacional centrífugo, ou seja, aumenta em várias vezes a 
velocidade da gravidade, tornando o processo de separação mais rápido quando 
comparado a sedimentação. Enquanto que a filtração da origem a uma torta seca, a 
centrifugação promove a concentração das células presentes no produto. A operação 
unitária de centrifugação se baseia no gradiente de densidade entre o meio sólido e 
o meio líquido e um dos inconvenientes desse processo é o custo (SCHMIDELL et 
al., 2001). 
1.1.2 Filtração 
A filtração convencional é uma operação unitária que é muito difundida 
difundida na indústria biotecnológica. Aplica-se este método quando há um grande 
volume de suspensão diluída das células, sendo com uma capacidade de milhares 
de litros, em situações nas quais não se faz necessário a esterilização do processo. 
Utiliza-se esta operação quando se deseja separar partículas sólidas de um fluido 
através de um meio filtrante. Dessa forma, o líquido consiste no produto juntamente 
com as células, sendo que este passa sob pressão pelo meio filtrante, onde o que 
passa pelo filtro se denomina filtrado e o que fica retido se denomina de torta 
(SCHMIDELL et al., 2001). 
 
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1.1.3 Microfiltração 
A microfiltração com membranas, é um processo que vem se destacando no 
vasto mercado de engenharia e biotecnológico. Este método requer o uso de meios 
filtrantes compostos por materiais poliméricos ou cerâmicos, nesse contexto, esta 
operação contém um espectro de separação na escala dos micrômetros, permitindo 
a separação de sólidos tais como bactérias, proteínas, bolores, entre outros. No 
entanto, um dos inconvenientes é oriundo da colmatação das membranas filtrantes, 
o que diminui a eficiência do processo (DA SILVA et al., 2011). 
1.2 Purificação de Baixa 
1.2.1 Extração em sistemas de duas fases aquosas 
Este método consiste na extração de biomoléculas com um sistema de duas 
fases imiscíveis, sendo eles água e um solvente. É um método muito antigo utilizado 
na separação de ácidos orgânicos e antibióticos e seu funcionamento consiste na 
diferente solubilidade entre as impurezas e a molécula alvo, sendo que fatores 
importantes são levados em conta, tais como carga elétrica na superfície da célula, 
hidrofobicidade e massa molecular. Como apresentam elevada quantidade de água 
em ambas as fases, não são agressivos para a célula. A entalpia de hidratação entre 
os componentes presentes na SDFA são diferentes, dessa forma pode-se haver 
duas possibilidades: se a quantidade de energia presente no sistema for maior a 
diferença líquida entre o valor da entropia e entalpia de hidratação, os dois 
componentes coexistem em uma única fase, ao contrário, se for menor, a separação 
dos constituintes é favorecida, promovendo a formação de duas fases (SCHMIDELL 
et al., 2001; BORDÓN SOSA, 2017) 
1.2.2 Precipitação 
É um dos métodos mais tradicionais de concentração e purificação de 
produtos biotecnológicos. Considerada como um método moderado de purificação, 
e pode ser dimensionada a promover a redução do volume inicial de suspensão, 
levando ao aumento da concentração. Pode-se utilizar uma técnica denominada de 
salting-out, que utiliza elevadas concentrações salinas, onde essa adição de sais 
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promove uma diminuição na água presente no meio e consequentemente na 
superfície da proteína, promovendo a precipitação da célula. Pode-se utilizar também 
solventes orgânicos que têm afinidade com a água, fazendo com que ocorra a 
diminuição da atividade de água, pela diminuição da constante dielétrica do meio, 
fazendo com que as células sejam precipitadas. Basicamente, este método se dá 
pela diminuição da constante dielétrica ou diminuição da polaridade do meio, o que 
interfere na solubilidade da célula que é conferida pelas interações ionicas e 
hidrofílicas com o solvente aquoso (SCHMIDELL et al., 2001). 
1.2.3 Ultrafiltração 
A ultrafiltração é uma operação unitária que consiste no transporte de uma 
suspensão que passará por uma membrana com poros de 0,001 a 0,1 µm que visa 
a concentração de macromoléculas como proteínas e sacarídeos. Algumas 
vantagens desse processo é a separação de bioprodutos fermentados diluídos, 
concentrar compostos a baixa temperatura e pressão, entre outras. Moléculas que 
possuem diâmetro maior que o diâmetro de corte da membrana ficam retidas, já as 
que são menores passarão pelos poros no meio. 
1.2.4 Gel Filtração 
Inicialmente as biomoléculas ficam retidas nos poros de uma matriz filtrante 
de porosidade conhecida, em consequência de seu volume efetivo na solução. Nas 
moléculas em que o seu volume supere o volume do poro, esta é expulsa da coluna 
no volume espacial, que representa o volume de eluente presente no interstício da 
matriz. Já as moléculas menores se apresentam retidas nos poros e após são 
arrastadas pelo eluente que é compatível com o mantimento da estabilidade da 
célula. Sendo assim, primeiro se recupera as células de tamanho maior e após as de 
tamanho menor (SCHMIDELL et al., 2001). 
 
 
 
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2. O rompimento celular pode ou não ser empregado para purificação dos 
produtos formados. Explique a necessidade de utilização desta etapa, bem 
como alguns processos que podem ser empregados para esta finalidade 
(relacione rompimento celular completo e parcial), como rompimento mecânico, 
físico, químico e enzimático. 
O rompimento celular é necessário para a remoção de produtos intracelulares. 
Em geral o rompimento celular ocorre após a clarificação. O processo de rompimento 
de células microbianas de leveduras, bactérias e outras formas de fungos necessitam 
de tensões de cisalhamento, por possuírem paredes rígidas. A classificação dos 
processos de rompimento celular é dada como, rompimentos mecânicos, não 
mecânicos, químicos, físicos e enzimáticos. Para definição de qual processo de 
rompimento devem ser utilizados, deve-se analisar fatores como, rendimento, 
especificidade, necessidade de controle de temperatura, custo da operação e capital 
investido (SCHMIDELL et al., 2001). 
2.1 Processos de rompimento celular: 
 
2.1.1 Rompimento mecânico 
Para a escolha desse método de rompimento, considera-se o tamanho, a forma 
das células e também a estrutura da parede celular. Dentre os equipamentos mais 
utilizados no processo de rompimento mecânico, tem-se o homogeneizador de alta 
pressão, moinho de bolas e o ultrassom. Em todos os equipamentos ocorre o 
rompimento por cisalhamento, mesmo que cada um desses equipamentos tenha as 
suas particularidades de trabalho (SCHMIDELL et al., 2001). 
2.1.1.1 Funcionalidade do homogeneizador: 
Constituídosde pistões que aplicam altas pressões a suspensão celular, que 
força a passagem por orifícios estreitos após a passagem pelo orifício ocorre uma 
colisão contra uma superfície em uma câmara de baixa pressão (SCHMIDELL et al., 
2001). 
Células maiores rompem-se com mais facilidade, devido ao impacto causado 
juntamente com a queda de pressão, entretanto rompimentos em múltiplas etapas 
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aumentará o rendimento do processo. O processo gera um rompimento parcial 
(SCHMIDELL et al., 2001). 
2.1.2 Rompimento físico 
O rompimento celular por métodos físicos podem ser realizados por 
congelamento e descongelamento (CONTESSA, 2016). Bactérias, dividem-se em 
dois grupos, gram-positivas e gram-negativas, onde a sua única diferença é a 
composição da parede celular (SCHMIDELL et al., 2001). 
O método de congelamento e descongelamento se dá através da perda de 
capacidade biológica devido ao cristais gerados pela quantidade de água presente na 
célula, com um congelamento lento forma cristais maiores e gera maior eficiência. O 
processo possui um custo alto e o seu processo costuma ser demorado (MIRANDA, 
2011). Porém o resultado é um rompimento completo ou quase completo, o que pode 
variar pela idade da célula, temperatura e velocidade dos ciclos de congelamento e 
descongelamento (MARINELLO, 2009). 
2.1.3 Rompimento químico 
Para o rompimento celular ocorrer no método químico, geralmente utiliza-se 
substâncias capazes de realizar a dissolução da estrutura da membrana, 
normalmente utiliza-se, álcalis, solventes, detergentes e ácidos. A utilização desse 
método geralmente gera um rompimento total da membrana (QUINEDES et al., 2015). 
Um exemplo desse método de extração é a extração de poli-hidroxialcanoatos 
(PHAs), a partir de bactérias, onde é utilizado solventes orgânicos e digestores 
químicos (QUINEDES et al., 2015). 
O solvente utilizado deve realizar a dissolução total do soluto, a dissolução 
ocorre devido a solubilização do polímero no solvente, porém a mesma, só ocorre se 
as interações moleculares do solvente e das cadeias poliméricas foram maiores que 
as interações entre as cadeias poliméricas (QUINEDES et al., 2015). 
Nesse caso a solubilização é favorecida quando há o aumento de temperatura 
no meio, pois com isso ocorre uma modificação da permeabilidade da membrana 
celular, gerando uma suspensão de debris celulares (QUINEDES et al., 2015). 
 
 
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2.1.4 Rompimento Enzimático 
Utilizados na recuperação de biomoléculas sensíveis a tensão de cisalhamento 
ou pressão de trabalho. Proporciona facilidade de controle, tanto no pH como na 
temperatura. Mesmo com o alto custo, necessita de baixo investimento capital, 
possuindo alta especificidade para a degradação de parede celular (SCHMIDELL et 
al., 2001). 
Bactérias: durante o processo de rompimento, a parede celular é hidrolisada e 
a pressão osmótica interna rompe a membrana citoplasmática (SCHMIDELL et al., 
2001). 
Bactérias gram-positivas: a parede celular possui maior quantidade de 
peptidioglicanos (SCHMIDELL et al., 2001). 
Bactérias gram-negativas: possuem parede celular com camada dupla 
(SCHMIDELL et al., 2001). 
Leveduras: as paredes celulares possuem duas camadas, sendo uma externa 
(complexo proteína-manana) e uma interna (glucana). Para o rompimento é 
necessário mais de um tipo de enzima, as mais utilizadas são glucanases, proteases 
e mananases. Para o rompimento completo, a enzima protease hidrolisa a camada 
externa e a glucanase hidrolisa a camada interna (SCHMIDELL et al., 2001). 
3. Como se dá a separação de biomoléculas a partir da utilização da técnica 
de cromatografia? Explique os diferentes tipos desta técnica e relacione com as 
características dos produtos que poderiam ser separados. 
Atualmente, existem várias maneiras para realizar a separação de 
biomoléculas, e uma dessas maneiras é através da técnica de cromatografia. A 
cromatografia por sua vez, é a separação entre uma fase estacionária e uma fase 
móvel. Fase estacionária são partes esféricas de um material empacotado em uma 
coluna. Já a fase móvel, é a introdução da mistura de enzimas pela coluna que é 
forçada a migrar através dela. Ou seja, as enzimas que têm maior atração pela fase 
estacionária, irão migrar de uma maneira diferente das que tem mais afinidade pela 
fase estacionária (SCHMIDELL et al., 2001). As técnicas mais utilizadas estão citadas 
abaixo. 
 
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3.1 Técnicas de separação por cromatografia 
3.1.1 Cromatografia por Gel-filtração 
As biomoléculas retidas nos poros de uma matriz de porosidade são definidas 
em função de seu volume efetivo na solução. As moléculas maiores são retiradas da 
coluna, o qual demonstra o volume de eluentes presente nos interstícios da matriz. 
Entretanto, as moléculas pequenas, penetram nos poros e em seguida são 
arrastadas pelo eluente. Já as diferentes moléculas são removidas do leito em 
decorrer do seu tamanho. E as matrizes para esse método, são formadas de 
polímeros vinílicos hidrofílicos com alta proporção de ligações cruzadas com 
partículas de 5 a 50 μm. Essa técnica pode ser utilizada na separação de enzimas 
produzidas através de organismos biotecnológicos tais como a β-glicosidase 
(SCHMIDELL et al., 2001; BONFÁ, et al., 2015). 
3.1.2 Cromatografia por Troca iônica 
Esse método, é um dos mais utilizados, pois as resinas empregadas 
apresentam elevada capacidade de adsorção de proteínas. Seu processo é baseado 
na afinidade que componentes de uma certa amostra tem com os sítios iônicos em 
uma matriz sólida. A fase estacionária, tem capacidade de não deixar escapar solutos 
que estão na fase móvel e que têm cargas opostas. Neste método consegue-se ter 
uma ampla utilização, pois praticamente, todas as proteínas são carregadas 
eletricamente quando submetidas a mesmo pH. Sua matriz é constituída de materiais 
poroso, sintético os naturais. Esse método é muito utilizado para separar moléculas 
biológicas entre elas podemos citar os peptídeos, aminoácidos e proteínas, 
(SCHMIDELL et al., 2001). 
3.1.3 Cromatografia por Afinidade 
Uma maneira simples de realizar a separação biosseletiva é através da 
cromatografia por afinidade. Essa técnica é a segunda mais utilizada para 
purificação, no qual os compostos são imobilizados em matriz cromatográfica 
mediante ligação reversível do ligante com a molécula de interesse. Excelente para 
purificação ou captura dsa biomoléculas e se necessário, pode ser usado se tiver 
ligante para a proteína de interesse. Os sistemas de bioafinidades, são os melhores 
métodos de separação, por possuírem alto grau de resolução e seletividade. Muito 
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usado também para purificação comercial de produtos farmacêuticos e de remoção 
de contaminantes (ZUNIGA et al., 2003). 
3.1.4 Cromatografia em fase reversa 
Através desse método, podem-se conseguir separações mais rápidas, mais 
ou menos 20 segundos em determinadas situações. Essa velocidade de separação 
ajuda no controle de bioprocessos que requerem análises periódicas dos compostos. 
Essa técnica é de alta resolução para análises de proteínas, porém seu uso em 
grande escala é limitado pois não preserva a estrutura do mesmo. É comumente 
utilizado em laboratório de pesquisas, alimentos e no setor de controle de qualidade 
(ZUNIGA et al., 2003). 
3.1.5 Cromatografia por Interação Hidrofóbica 
 
Essa técnica foi desenvolvida para separação de proteínas, usando colunas 
empacotadas. É ideal para ser usada na busca de biomoléculas. O fosfato de amônia 
ou sais de sulfato são excelentes para interações hidrofóbicas. Ao usar essa técnica 
junto com sistema bifásicos, resultam em ótimas extrações de proteínas através de 
células não-clarificadas. Este método de cromatografia pode ser utilizado para separar 
proteínas, como as presente no soro do queijo tipo coalho (ZUNIGA et al., 2003; 
CAVALCANTI, 2010).
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4. Apresente dois fluxogramas de processos de diferentes áreas e indiqueas etapas de purificação destes processos. 
 
Os fluxogramas dos processos biotecnológicos estão demonstrados na Figura 1 e 2. 
 
Figura 1 - Obtenção de antibióticos por processos fermentativos aeróbios. 
 
 
Fonte: PEREIRA e OLIVEIRA, (2016). 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 2 - Obtenção de bioinseticidas por processos biotecnológicos. 
 
Fonte: FIGUEIREDO, (2017).
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REFERÊNCIAS 
 
 
BONFÁ, Emily C.; GOMES, Eleni; BONILLA-RODRIGUEZ, Gustavo O. CARACTERIZAÇÃO 
ENZIMÁTICA DE β-GLICOSIDASE PARCIALMENTE PURIFICADA DO FUNGO TERMOFÍLICO 
MYCELIOPHTHORA THERMOPHILA M. 7.7. USANDO SUBSTRATOS SINTÉTICO E NATURAL. 
2015 
BORDÓN SOSA, Filipe Hobi. Equilíbrio líquido-líquido de sistemas de duas fases aquosas (SDFA) 
formados por polímero (PEG ou PVP) e sal inorgânico (CuSO4 ou MnSO4): determinação experimental 
e modelagem termodinâmica. 
CAVALCANTI, Jorge dos Santos. Recuperação e purificação de proteínas do soro de queijo tipo coalho 
usando cromatografia de troca iônica e interação hidrofóbica em leito na forma expandida. 2010. 
CONTESSA, Camila Ramão et al. OBTENÇÃO DE ANTIMICROBIANO E PURIFICAÇÃO POR 
CONGELAMENTO E DEGELO A PARTIR DO COGUMELO MORCHELLA ESCULENTA. Anais do 
Salão Internacional de Ensino, Pesquisa e Extensão, v. 7, n. 2, 2016. 
DA SILVA, Tiago Osório; ROCHA, André William Soares; TERAN, Francisco Javier Cuba. Microfiltração 
como processo de tratamento avançado para efluente industrial de abatedouro de bovinos. Engenharia 
Ambiental: Pesquisa e Tecnologia, v. 8, n. 4, 2011. 
FIGUEIRÊDO, Antonio Fábio Reis et al. Seleção de leveduras e produção de cerveja artesanal 
suplementada com selênio. 2017. 
MARINELLO, M; Rompimento celular; Universidade Estadual do Rio Grande do Sul – UERGS, Unidade 
Bento Gonçalves; Bento Gonçalves; Rio Grande do Sul. Brasil, 2009. 
Miranda, R. R., Monteiro, F., C., Boreiko, S., Bittencourt, J., V., M., Avaliação de detergentes e ultrasom 
para isolamento de DNA genômico de bactérias de interesse em alimentos. Universidade Tecnológica 
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suplemento: p. 398-407, 2011 D.O.I: 10.3895/S1981-36862011000100003S1 
PEREIRA, Erlon Lopes; OLIVEIRA, Ana Flávia Alves. A produção de antibióticos por processos 
fermentativos aeróbios. Revista da Universidade Vale do Rio Verde, v. 14, n. 2, p. 1058-1078, 2016. 
QUINES, Luci KM et al. Métodos de extração de poli-hidroxialcanoatos a partir de biomassa bacteriana. 
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SCHMIDELL, W. et al. Biotecnologia Industrial, v. 2. Edgard Blücher, Sao Paulo. 2001. 
ZUNIGA, A; PEREIRA, J; COIBRA, J; MINIM, L; ROJAS, E. Revisão: Técnicas usadas no processo de 
purificação de biomoléculas. B.CEPPA, Curitiba v. 21, n. 1, 2003.