Texto sobre Replicação in vitro -PCR

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Replicação in vitro 
 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) 
Profa. Beatriz Ferreira 
Prof. Alan Branco 
A técnica de PCR é um advento relativamente recente na história da 
biologia molecular, tendo sido desenvolvida nos anos 80 por Kary Mullis. 
A idéia básica da técnica de PCR é bastante simples. Trata-se de uma 
metodologia que mimetiza o processo natural de replicação do DNA, possibilitando 
a produção, in vitro, de milhares de cópias de um determinado fragmento de DNA 
através de uma reação enzimática, catalisada pela DNA polimerase. Nesta 
reação, dois pequenos fragmentos de DNA, com aproximadamente 20 pares de 
bases (“primers”), sintetizados artificialmente, funcionam como iniciadores para a 
reação de amplificação, tais iniciadores fornecem a extremidade 3’-OH livre 
necessária à DNA polimerase para que seja iniciada a síntese de uma nova fita 
de DNA. Os “primers”, também denominados oligonucleotideos, oligos ou 
iniciadores, são moléculas de fita simples de DNA desenhados de forma que suas 
seqüências sejam complementares às extremidades da região de DNA de 
interesse. Depois de desenhados, as seqüências são enviadas a empresas 
especificas para que sejam sintetizadas quimicamente. 
A PCR ocorre em vários ciclos (em média 35 ciclos), com cada ciclo sendo 
subdividido em três passos básicos: desnaturação, anelamento dos “primers” e 
extensão da fita de DNA pela DNA polimerase. Estes passos são marcados por 
variações bruscas de temperatura e incubação. A temperatura ideal para que haja 
desnaturação e extensão é em media de 95ºC e 72ºC, respectivamente. A 
temperatura para pareamento dos primers (Tm) varia de acordo com o tamanho e 
composição de nucleotídeos que cada primer possui. A temperatura ideal é 
calculada utilizando fórmulas específicas. O tempo de exposição a estas 
temperaturas é variável de acordo com o experimento. 
Estas oscilações de temperatura e períodos de incubação são controlados 
por aparelhos eletrônicos, conhecidos como termocicladores. Estas máquinas 
possuem um bloco de temperatura programável, que assegura temperaturas e 
tempos de aquecimento/incubação acurados. Os temocicladores permitem que o 
operador edite programas para determinar a variação de temperatura em cada 
passo e o número de ciclos a serem desenvolvidos durante a PCR. 
Este processo visa reproduzir um determinado trecho de DNA a ser 
estudado. Os elementos envolvidos nesta reação são basicamente os mesmos 
componentes do processo de replicação que ocorre no interior das células: 
1)DNA que contém o trecho a ser amplificado (fita molde/alvo); 2) Nucleotídeos 
(A,T,C e G); 3) Enzima DNA polímerase; 4) Dois iniciadores/”primers” (pequena 
seqüência de DNA complementar ao DNA alvo); 
O programa editado no termociclador permite a execução das três etapas da 
reação: 
1. Desnaturação: é o processo no qual ocorre a separação da dupla fita de DNA 
por meio da elevação da temperatura para ~94
o
C, 
2. Anelamento: uma vez separadas as fitas de DNA, a temperatura da reação é 
reduzida para ~60
o
C e os iniciadores encaixam-se, um em cada fita, nas 
respectivas seqüências complementares vicinais à região alvo da amplificação, 
3. Extensão: eleva-se a temperatura para ~72
o
C para que a enzima DNA 
polimerase posicione-se junto aos iniciadores que se anelaram anteriormente e 
comece a duplicação da fita, recrutando no meio os nucleotídeos que contenham 
as bases nitrogenadas complementares à fita molde. 
Após o término deste ciclo, todo o processo é repetido a partir da 
desnaturação até a extensão por várias vezes (30 vezes em média) até que se 
obtenha uma quantidade razoável do DNA a ser amplificado. 
 
Princípios da PCR. 
As pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas da molécula de DNA 
são bastante estáveis, entretanto quando aquecidas a 94ºC, estas ligações são 
rompidas, separando a molécula da DNA em duas fitas complementares e 
antiparalelas. O oposto também ocorre quando se resfria a molécula. Com uma 
redução gradativa da temperatura as pontes de hidrogênio são restauradas 
(renaturação do DNA) formando novamente uma molécula de DNA dupla fita. A 
PCR está baseada na propriedade da molécula da DNA de desfazer e refazer 
pontes de hidrogênio com a variação da temperatura. 
Como anteriormente mencionado, a PCR é uma reação de replicação de 
DNA in vitro, direcionada para uma determinada região de interesse. Assim, essa 
reação é montada em um tubo de ensaio ao qual são adicionados os compostos 
necessários a um processo de replicação. 
A uma reação são adicionados os primers, nucleotídeos livres (adenina, 
guanina, timina e citosina), o DNA e uma enzima especial resistente ao calor 
chamada Taq polimerase, que promove a síntese de DNA. A mistura é aquecida a 
95
0
C, provocando a separação das duas fitas de DNA. Em seguida, a mistura é 
esfriada até 55
0
C, temperatura na qual os primers se ligarão às regiões 
complementares das moléculas de DNA que estão separadas. Neste momento, 
dentro do tubo de reação, todo DNA está na forma de fita simples, menos as duas 
pequenas regiões nas quais os primers se ligaram nos dois lados da seqüência de 
DNA. A temperatura é, então, elevada a 72
0
C, e a Taq polimerase começa a 
sintetizar um novo DNA, começando pelas regiões em dupla fita, local onde cada 
um dos primers se ligou ao molde da amostra de DNA. A Taq irá promover a 
síntese de DNA apenas na região em dupla fita. A síntese ocorre a uma taxa de 
aproximadamente 20 nucleotídeos por segundo, e em 1 minuto uma nova cópia do 
fragmento que se quer analisar é sintetizada. A reação agora é novamente 
aquecida a 95
0
C, causando novamente a separação de todo DNA em fita simples. 
Ao final do primeiro ciclo, há duas fitas da molécula original de DNA, mais duas 
cópias da região de interesse. A temperatura é novamente reduzida a 55
0
C, e 
agora os primers irão se ligar aos quatro sítios nas novas duas cópias e também 
na molécula original de DNA. A temperatura do ciclo é novamente elevada a 72
0
C, 
e as quatro fitas individuais são multiplicadas. Esses ciclos são repetidos por 30 
vezes. Ao final de 30 ciclos de amplificação existe cerca de 1 milhão de cópias do 
segmento de DNA de interesse para cada molécula molde original da amostra 
inicial. É assim que podemos selecionar um fragmento específico dentro de todo o 
DNA. 
 Inicialmente, quando a técnica de PCR ainda estava sendo implementada, 
utilizava-se a polimerase de Escherichia coli para promover a extensão da nova 
fita de DNA, porém está era inativada pelas altas temperaturas necessárias à 
reação, assim em cada ciclo era necessário colocar nova amostra de polimerase, 
para a continuidade do processo de amplificação. Este procedimento tornava a 
reação mais demorada e dispendiosa. A forma encontrada para a resolução deste 
problema foi a utilização da polimerase de uma bactéria que se desenvolvia em 
fontes termais (temperaturas em torno de 74º C). Foi verificado que a polimerase 
deste microorganismo permanecia estável em temperatura de 94º C. Esse 
microorganismo é denominado Thermus aquaticus e devido a termo-estabilidade 
de sua enzima DNA polimerase, essa foi isolada chamada de Taq polimerase e 
hoje é amplamente utilizada na PCR. 
 
Algumas aplicações da técnica de PCR: 
-Pesquisas científicas: Através da PCR é possível a amplificação de genes de 
interesse, a produção de sondas, a obtenção de fragmentos de DNA para 
clonagem, etc. 
-Medicina Legal e Forense: Para a determinação de paternidade e identificação de 
criminosos a partir de amostras recolhidas na cena do crime (gotas de sangue, 
esperma, fios de cabelos com bulbos capilares, etc) 
-Diagnóstico e Estudo de Doenças Genéticas: Com a utilização desta técnica 
podemos fazer estudos para identificar as alterações genéticas que levam a 
determinadas doenças e identificar o defeito metabólico consequente desta 
alteração, possibilitando novasabordagens terapêuticas. 
-Diagnóstico das Doenças Infecciosas e Parasitárias: Com a técnica da PCR 
houve uma otimizacão do diagnóstico etiológico das doenças infecciosas, pois 
partindo de pequenas quantidades de DNA na amostra, é possível identificar com 
grande precisão o agente etiológico, isso porque, teoricamente, pode-se identificar 
qualquer patógeno a partir do seu DNA.