Resumão das técnicas Southern Blot, Northern Blot, Western Blot, FISH, RFLP, Microarranjo - Tecnologia Genética - Biologia Molecular

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Carolina Martins Temporal
Atividade 2 - Resumo sobre Seminários
TECNOLOGIA GENÉTICA
Southern Bolt
A técnica de Southern Blot, também conhecida como Southern Blotting foi desenvolvida para identificar sequências específicas de DNA. O termo “blotting” faz referência à transferência de amostras biológicas de um gel para uma membrana e sua subsequente detecção.
 
A metodologia consiste na fragmentação do DNA em pedaços menores através de eletroforese, seguido da transferência para uma membrana e a detecção do fragmento de DNA de interesse por hibridação com uma sonda específica.
Etapas:
1. Fragmentação do DNA: A primeira etapa consiste na fragmentação ou digestão do DNA, onde as longas sequências de nucleotídeos devem ser divididas em fragmentos menores através de enzimas de restrição. 
2. Eletroforese em gel de agarose: O DNA fragmentado é submetido a eletroforese em gel de agarose para separar os fragmentos de acordo com peso molecular à medida que passam por uma corrente elétrica.
3. Desnaturação: O gel onde foi feita a eletroforese de DNA é tratado com uma solução alcalina (tipicamente contendo hidróxido de sódio) para promover a desnaturação da dupla fita do DNA, separando-a em simples fitas. A desnaturação é necessária porque o DNA nas etapas seguintes irá aderir à membrana e irá parear com a sonda.
4. Transferência do DNA para uma membrana: Uma membrana de nitrocelulose (ou de nylon) é posta sobre o gel. Uma pressão é aplicada uniformemente sobre o gel, fazendo com que o DNA passe do gel para a membrana, onde ele se adere. A membrana é então aquecida (no caso da nitrocelulose) ou exposta a radiação ultravioleta (no caso do nylon) para permanentemente ligar o DNA à membrana.
5. Tratamento com a sonda: A membrana é agora tratada com uma sonda hibridizadora (molécula de DNA isolada cuja sequência é conhecida e complementar à sequência a qual se quer determinar a presença ou não na amostra). A sonda irá parear com qualquer sequência de DNA complementar. O excesso de sonda é lavado da membrana, e toda a sonda não hibridizada (não pareada) será removida. Depois disso, a presença ou não da sonda na membrana (e as posições onde ela está presente) é revelada por uma autoradiografia em um filme de raio-x, ou pelo aparecimento de uma cor caso a marcação cromogênica tenha sido usada.
6. Revelação: As manchas no Southern Blot mostram onde a sonda se hibridizou com a amostra. Conhecendo os pontos onde a amostra de DNA foi clivada, é possível dizer em quais trechos a sequência procurada está ou não presente.
Aplicabilidade:
A técnica de Southern Blot pode ser utilizada para detectar a identidade, o tamanho e a abrangência do DNA em uma amostra. Testes de paternidade, identificação criminal, identificação de vítimas. Isolar e identificar um gene de interesse, identificar mutação ou rearranjo gênico na sequência do DNA, diagnóstico de doenças causadas por defeitos genéticos, identificação de agentes infecciosos, e etc.
Vantagens:
· Permite o reconhecimento de genes em longas moléculas de DNA.
· É uma técnica mais barata que o sequenciamento do DNA.
· Utilização para detecção de mutações genômicas.
· Pode ser usado para quantificar o DNA.
RFLP 
O RFLP (Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição) é uma técnica da biologia molecular que analisa pedaços de DNA que foram cortados por enzimas de restrição (esses pedaços são os chamados de fragmentos de restrição). Foi o primeiro marcador genético baseado em DNA desenvolvido. O polimorfismo deste marcador é baseado nos diferentes tamanhos de fragmentos gerados por enzimas de restrição. 
As endonucleases (enzimas de restrição) são enzima originada de procariotos, que possuem a capacidade de clivar a molécula de DNA em pontos específicos, reconhecendo determinadas sequências de nucleotídeos. Na técnica de RFLP utilizamos a endonuclease tipo II. Ela localiza sequência palindrômica e realiza um recorte coesivo.
Etapas:
1. Extração do DNA: O DNA é extraído do sangue, saliva ou de outras amostras biológicas.
2. Adição das enzimas de restrição: O DNA contendo o gene de interesse é clivado em fragmentos por enzima de restrição. A endonuclease (enzima de restrição) irá reconhecer sítios específicos do DNA e cortá-los em fragmentos. 
3. Eletroforese: Esses fragmentos de DNA são analisados usando a eletroforese em gel de agarose.
4. Desnaturação: O DNA é desnaturado através a uma solução alcalina.
5. Transferência dos fragmentos para uma membrana de nitrocelulose: Os fragmentos de DNA são transferidos do gel para uma membrana de nitrocelulose por capilaridade. 
6. Hibidização: O filtro é então retirado e o DNA é hibridizado com uma sonda radioativa.
7. Revelação: A exposição da membrana a filme de raio-x após a hibridização com sondas marcadas leva à sensibilização do filme no ponto em que a sonda hibridiza com fragmento homólogo, formando uma banda na autoradiografia. Possibilitando a visualização dos polimorfismos em um filme de raio-x.
Aplicabilidade: Mapeamento do genoma, determinação de doenças genéticas, testes de paternidade, ciência forense.
Vantagens: 
· Pode ser aplicado para identificação em diversas áreas de atuação.
· Resultados estáveis e reprodutíveis. 
· Ampla cobertura do genoma.
· Possibilidade de utilização de sondas heterólogas. 
Desvantagens:
· Técnica de alto custo, demorada e obsoleta quando comparada com outras técnicas atuais. 
· Uso de sondas radioativas (tóxicas). 
· Não permite automatização em suas etapas.
· Necessita de grandes quantidades de DNA (5-20 microgramas).
 
Northern Blot 
Northern blot é uma técnica de biologia molecular em que é possível detectar e quantificar o RNAm e assim entender melhor sobre a expressão gênica.
Fazendo um trocadilho com o nome de Edwin Southern, a técnica foi batizada de Northern blot devido à similaridade de seu procedimento com o Southern blot. Com a diferença de que, em vez de DNA, a substância analisada por eletroforese com uma sonda hibridizadora no Northern blot é o RNA. 
Etapas:
· Corrida de RNA totais ou RNA mensageiros em gel de agarose: O RNA extraído, seja o total ou o RNAm + poli-A selecionado, são separados de acordo com o seu tamanho molecular por eletroforese em gel de agarose. Em razão dos grupamentos fosfatos, o DNA quando em meio neutro ou básico possui carga negativa. Para o DNA adquirir essa carga, adiciona-se uma solução alcalina junto do gel de agarose, e em seguida, ocorre a indução de um campo elétrico com dois pólos: um negativo e um positivo. A macromolécula migrará para o polo positivo (ânodo). A velocidade de migração e o poder de resolução do gel dependem do tamanho e forma da molécula. As maiores migram lentamente, enquanto as menores migram rapidamente.
· RNA são desnaturados pelo formaldeído: Utilização de agentes desnaturantes no gel, como o formaldeído, que reage covalentemente com os grupos amina de adenina, guanina e citosina, fazendo com que não ocorra o pareamento entre as bases. 
· Transferência para membrana por ação capilar: As membranas de nylon são são carregadas positivamente, aumentando a capacidade de ligação aos ácidos nucleicos e da sua maior robustez no manuseamento. A transferência ocorre por ação capilar (sem o uso de nenhum equipamento especial). Pelo arrasto que as macromoléculas fazem ao serem atraídas para o polo positivo, cria-se o borrão do blotting e assim, fornece uma reflexão precisa na membrana com os RNAs separados no gel de agarose. Entretanto, como o gel é muito frágil para ser sondado diretamente e as sondas de hibridização não penetram diretamente nos géis, é necessário imobilizar o RNA. Ele é então imobilizado na membrana, seja assando no forno a temperaturas elevadas (95°C por minuto) ou por exposição UV leve. Essa imobilização irá resultar na ligação covalente do RNA para a membrana, a qual impedirá que o ácido nucléico seja lavado durante o processamento.
· Sondas de DNA ou RNA para hibridar: A sonda de hibridização deve ser preparada. A hibridização deum ácido nucleico requer que a sonda tenha a complementaridade de sua sequência de RNAm alvo, ocorrendo o pareamento das bases com a sonda marcada por radioisótopo ou corante fluorescente. 
Há duas formas principais de hibridização: Por DNA complementar (cDNA) ou por oligonucleotídeos anti-sentido. A hibridização por DNA complementar tem suas vantagens por ser simples e ter seu tempo reduzido, entretanto, também está mais propenso a ter discriminação por RNAses.
· Revelação: Na detecção da hibridização, observa-se se houve ou não a identificação do gene-alvo. Os sinais são então detectados, em maioria por filmes de raios X (por radioatividade ou quimiluminescência) e quantificados por densitometria, que é a medição da densidade óptica em chapas fotográficas. Essa quantificação é baseada em unidades arbitrárias e mudanças relativas entre grupos experimentais e de controle.
Vantagens:
· Simples.
· Alta especificidade.
· Sequências de homologia parcial podem ser usadas como sondas hibridizadoras.
· Consegue detectar o tamanho do RNAm.
· Apresentam baixo custo.
· Quantidade e qualidade do RNA pode ser verificado facilmente depois da eletroforese e antes de todo processamento. 
· Blots podem ser guardados por muitos anos.
Desvantagens:
· Risco de degradação do RNAm durante a eletroforese (qualidade e quantificação da expressão gênica são afetados). 
· Exposição à altas doses de radioatividade e formaldeído são potencialmente nocivos à saúde de quem estiver trabalhando na técnica.
· A sensibilidade do northern blot é relativamente baixa se for comparado com outras técnicas.
· Detecção com muitas sondas é difícil.
Técnica de FISH:
A hibridização fluorescente in situ (FISH) é uma técnica baseada na detecção de pequenos segmentos de DNA e RNA a partir de sondas específicas. Essas sondas são sequências de oligonucleotídeos complementares e específicos marcados com substâncias fluorescentes, desenvolvidas a partir de segmentos conhecidos do DNA ou RNA que se deseja identificar. O princípio básico é o anelamento da sonda com a sequência alvo, para a visualização em microscópio epifluorescente. 
A marcação das sondas pode ser feita das seguintes maneiras: 
· Direta: Os nucleotídeos marcados utilizados no processo estão associados a fluorocromos, os quais podem ser visualizados diretamente em microscópio de fluorescência utilizando um filtro adequado, após a hibridização in situ. É o processo mais utilizado, por ser mais rápido e de fácil execução.
· Indireta: A marcação indireta pode aumentar a sensibilidade ligando uma molécula de digoxigenina à sonda. Em etapa subsequente, ocorre ligação de anticorpo conjugado com fluorocromo a esta digoxigenina.
A técnica possui 4 procedimentos básicos:
1. Fixação e permeabilização da amostra:
2. Hibridização: 
3. Lavagem para remoção das sondas em excesso: 
4. Detecção pela microscopia fluorescente:
Aplicabilidade: 
A FISH tem uma grande variedade de aplicações, como: Análise de danos cromossomais, mapeamento de genes e sequências gênicas, reconhecimento de doenças virais, diagnóstico de neoplasias, monitoramento de pacientes leucêmicos transplantados de medula óssea proveniente de doador do sexo oposto, identificação de rearranjos cromossômicos, identificação de alterações cromossômicas em esperma, monitoramento de indivíduos e populações expostas a mutagênicos, diagnóstico pré-natal e pré-implantação, toxicologia molecular, genômica comparativa, biologia evolutiva, ecologia microbiana, etc.
Vantagens: 
· Técnica rápida. 
· Alta sensibilidade e especificidade.
· Alta eficácia de hibridização e detecção.
· Permite analisar diferentes fases de crescimento e divisão celular.
· Possibilita analisar um número grande de células rapidamente e identificar alterações estruturais muitas vezes não vistas na citogenética convencional.
· Permite correlação direta dos aspectos citogenéticos e morfológicos, possibilitando a diferenciação entre condições malignas e benignas.
Desvantagens:
· Alto custo.
· Necessita de equipamentos modernos e dispendiosos, como microscópio com filtros epifluorescentes. 
· Como as preparações não são permanentes, ferramentas de registro de imagem são necessárias.
· A técnica pode apresentar falhas como falsos negativos por penetração insuficiente das sondas e falsos positivos, quando substâncias da amostra já forem auto fluorescentes, como é o caso de alguns microorganismos.
Microarranjo:
A técnica de Microarranjo (microarray) analisa a expressão gênica através da reação de hibridização, com ela é possível analisar ao mesmo tempo diferentes genes de uma mesma célula. 
Oriunda da técnica de Southern Blot, o princípio da técnica de microarranjo consiste na hibridização entre uma sonda (cDNA ou oligonucleotídeo) e uma molécula-alvo marcada com fluoróforo (CY3 e CY5), usualmente um cDNA. 
As sondas contêm sequências complementares às moléculas-alvo correspondendo a uma parte específica de um gene e são fixadas em uma superfície sólida através de agulhas robotizadas, fotolitografia ou por impressão a jato.
Etapas:
· Preparo das amostras: Coleta do material (sangue, tecido, saliva). E isolamento do RNA virá a ser estudado. Posteriormente, se isola também o RNAm dos demais tipos de RNA. Adiciona se ao material uma solução contendo enzimas transcriptase reversa, primers e nucleotídeos+fluoróforos. Assim, a fita é convertida em cDNA e colorida.
· Hibridização: As moléculas de cDNA são distribuídas na placa para se ligarem às ssDNA correspondentes por hibridização. E o chip passa pela lavagem para eliminar os excedentes que não se ligaram.
· Detecção, visualização e interpretação do dados: Um laser de alta resolução escaneia o chip, fazendo a análise de acordo com a emissão de fluorescência.
Aplicabilidade: Mapeamento de DNA, genotipagem, ligação de proteína, perfis transcricionais, análise de variante de splicing, polimorfismo de nucleotídeo único SNP, CHIP on CHIP.
Vantagens:
· Possibilita a avaliação simultânea da expressão de milhares de genes em diferentes tecidos de um determinado organismo, e em diferentes estágios de desenvolvimento.
· Podem ser usados para analisar qualquer tipo de variação na expressão gênica entre amostras podemos mover o foco dos estudos à análise e investigação de sistemas biológicos como um todo.
· Perfis de expressão gênica podem ser utilizados para discriminar entre dois tipos celulares ou duas condições biológicas distintas.
· Os genes estudados também podem ser agrupados em uma classe existente de genes, ou em uma nova classe gênica.
Desvantagens:
· Os experimentos com microarrays ainda são consideravelmente caros e trabalhosos e, como consequência, são geralmente conduzidos com tamanhos amostrais relativamente pequenos.
· Envolve uma série de procedimentos laboratoriais de alta complexidade, exigindo profissionais bem qualificados.
· É necessário um grande número de sondas específicas por experimento.
Western Blot: 
O Western Blot, também conhecido como protein blotting ou immunoblotting, é um método da biologia molecular utilizado para imunodetecção de proteínas após a separação destas por eletroforese em gel e transferência para membrana adsorvente. A técnica permite detectar, caracterizar e semi quantificar múltiplas proteínas. 
O Western Blot evoluiu da técnica de DNA (Southern) blotting e RNA (Northern)
blotting. A denominação do procedimento foi dada a fim de manter a “denominação geográfica” tradicional dos métodos, iniciado pelo Southern blotting.
Etapas:
1. Extração e quantificação das proteínas: A primeira etapa consiste na extração e quantificação das proteínas. 
2. Eletroforese em gel de poliacrilamida: Para separar as proteínas de uma amostra homogênea, a técnica mais utilizada é a eletroforese em gel de poliacrilamida. A eletroforese em gel é uma técnica na qual moléculas carregadas, como as proteínas, são separadas de acordo com suas propriedades físicas e peso molecular à medida que passam por uma corrente elétrica.3. Transferência das proteínas para uma membrana: Após a eletroforese, a proteína deve ser transferida do gel para uma membrana. Há uma variedade de métodos usados neste processo, porém, a mais comumente usada é a de electroblotting, devido à sua velocidade e eficiência de transferência. Quando um campo elétrico é aplicado, as proteínas se movem para fora do gel de poliacrilamida e para a superfície da membrana, onde as proteínas se ligam firmemente. Depois disso, utiliza-se o corante Ponceau S para confirmar a transferência das proteínas para a membrana.
4. Bloqueio: A membrana possui uma alta afinidade por proteínas, dessa forma, é necessário bloqueá-la para evitar que os anticorpos se liguem a toda a superfície da membrana ao invés de somente ao antígeno. Para bloquear a membrana, é utilizado leite em pó desnatado ou a albumina bovina..
5. Incubação da membrana com um anticorpo para detectar a proteína específica a ser analisada: Adição de anticorpos específicos.
- Primeiro anticorpo: Depois de lavada, é adicionado a membrana o primeiro anticorpo, aquele que se ligará ao antígeno presente na membrana. Após a aplicação na membrana, a mesma deve ser incubada em temperatura ambiente por 1 hora em constante agitação.
- Segundo anticorpo: O segundo anticorpo (conjugado) pode ser definido como moléculas de antígenos ou anticorpos ligados covalentemente à enzima. Anti-IgG, esse anticorpo é um anticorpo que reconhece um anticorpo. Esse anticorpo secundário possui alguma modificação que permitirá a visualização da proteína de interesse.
6. Revelação dessa membrana para análise dos dados: Ocorre com a conjugação do anticorpo com uma enzima (peroxidade ou fosfatase alcalina). Se houver ligação do anticorpo primário com a proteína, o anticorpo secundário identifica o primário e sinaliza através da enzima. Também pode ser feita pela associação do anticorpo com um fluoróforo, que será posteriormente excitado com um laser de comprimento de onda específico para esse fluoróforo, evidenciando as regiões onde o anticorpo se ligou.
Aplicabilidade:
Teste padrão ouro para detecção de HIV e outros patógenos. Detecção de anticorpos contra vírus ou bactérias no soro, detecção de anticorpos anti-HIV no soro do paciente, detecção proteínas defeituosas (ex: doença de príons), teste para doença de Creutzfeldt-Jacob, doença de Lyme, hepatite B e herpes.
Vantagens:
· Alta especificidade e sensibilidade.
· Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.
· Relativamente rápida, simples e de baixo custo a médio em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.
· Menor risco de falsos negativos.
· Reconhecimento de antígenos individuais em um extrato.
· Realização de perfil de reconhecimento de antígenos.
· Determinação de proteínas imunodominantes.
Desvantagens:
· Por ser uma técnica sensível e específica, é muito suscetível a erros de pipetagem, no tempo de incubação, lavagens, e alterações no reagentes.
· Alguns reagente podem degradar-se com facilidade, com exposição à elevadas temperaturas, ou a luz do sol. 
· Necessita de mão de obra especializada.
Referência Bibliográfica: 
https://kasvi.com.br/conceito-de-southern-blotting-uma-breve-introducao/
https://kasvi.com.br/western-blotting-analise-proteinas/
https://www.sbhistotecnologia.bio.br/v2/painel/arquivos2/palestra_00000026_012.pdf 
https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-35982007001000018&lng=pt&tlng=pt
https://knoow.net/ciencterravida/biologia/northern-blot/