CONTROL OF FUNGI IN TISSUE CULTURE WITH CHEMICAL AND THERMAL STERILIZATION

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III Simpósio Micológico do Semiárido (SIMS) 
Juazeiro-BA/Petrolina-PE, Brasil. 
12 a 15 de setembro de 2017 
 
CONTROLE DE FUNGOS EM CULTURA DE TECIDOS COM 
ESTERILIZAÇÃO QUÍMICA E TÉRMICA 
Cinthia Carolinne de Souza Ferreira1, Joselita Cardoso de Souza², 
Cristiane Domingos da Paz3, Pedro Alves Ferreira Filho4, Brenda Lima Ribeiro5 
Kalline Mendes Ferreira6 
1Mestranda em Agronomia, PPGHI/UNEB, Juazeiro- BA, 
cinthiaagro@gmail.com, 2PhD., professora, UNEB/DTCS, Campus III-Juazeiro-
BA, jocsouza@uneb.br; 3PhD., professora, UNEB/DTCS, Campus III-Juazeiro-
BA , dapazcd@yahoo.com, com , 4Mestrando em Ciência Animal , UNIVASF, 
Petrolina-PE, pedro.alves.19@hotmail.com;5Discente do Curso de Agronomia, 
DTCS/UNEB, Juazeiro-BA, brenda.lima938@gmail.com; 6 Mestranda em 
Agronomia, PPGHI/UNEB, Juazeiro- BA, kmf.agronomia@gmail. 
 
RESUMO 
 
O presente trabalho baseou-se nos protocolos de controle térmico e 
esterilização química com uso de hipoclorito de sódio, em que foram realizadas 
adaptações a fim de controlar a contaminação microbiana em cultivo in vitro. 
Os tratamentos corresponderam à esterilização na água, vidrarias e meio, 
alternando os procedimentos, com objetivo de identificar e controlar os 
contaminantes do cultivo in vitro. O meio esterilizado quimicamente com NaClO 
e termicamente apresentaram respostas positivas na inibição da ação de 
fúngica. O mesmo ocorreu com as vidrarias e água esterilizadas com NaClO, 
sem necessidade de adição do cloro ativo no meio. Quando não se esterilizou 
o meio no autoclave ocorreu 100% de contaminação causada por fungos. 
 
PALAVRAS CHAVES: Assepsia; Métodos alternativos; Contaminantes. 
 
CONTROL OF FUNGI IN TISSUE CULTURE WITH CHEMICAL 
AND THERMAL STERILIZATION 
 
ABSTRACT: The present work was based on the protocols of thermal control 
and chemical sterilization using sodium hypochlorite, in which adaptations were 
made in order to control the microbial contamination in vitro culture. The 
treatments corresponded to the sterilization in the water, glassware and 
medium, alternating the procedures, in order to identify contaminating sources 
of in vitro culture. The medium chemically sterilized with NaClO and thermally 
showed positive responses in the inhibition of fungal action. The same occurred 
with the glassware and water sterilized with NaClO, without the need of adding 
the active chlorine in the medium. When the medium was not sterilized in the 
autoclave 100% of fungus contamination occurred. 
KEY-WORDS: Alternative methods; Biocide, Contaminants. 
mailto:dapazcd@yahoo.com
mailto:kmf.agronomia@gmail
 
 
. 
 
INTRODUÇÃO 
 
A cultura de tecidos é a área da biotecnologia que compreende vários métodos 
de propagação vegetal em laboratório, amplamente utilizada como ferramenta 
de estudo do metabolismo, fisiologia, desenvolvimento e reprodução de plantas 
com propriedades desejáveis, tais como resistência a pragas e acúmulo de 
substâncias ativas de interesse comercial (LAKSHMANAN et al., 2005). 
O estudo das contaminações microbianas na cultura de tecidos atende uma 
forte demanda relacionada aos processos de boas práticas de laboratório e 
contribui para preencher algumas lacunas encontradas na área de 
biotecnologia vegetal referente aos problemas de contaminação in vitro 
(SCHERWINSKI & PEREIRA, 2010), uma vez que esta é o fator determinante 
para o êxito ou não desta prática, sendo responsável por perdas significativas 
em biofábricas e laboratórios de pesquisa (DANTAS et al., 2002, DONATO et 
al., 2005). 
A contaminação deve-se principalmente, à presença de microrganismos 
oportunistas ou patogênicos, que penetram nos tecidos ou podem estar 
presentes no explante, se desenvolvendo no meio de cultura devido a 
desinfestação ineficiente, ou ainda, pela entrada de microrganismos após o 
estabelecimento do explante devido ao manuseio incorreto durante as 
subculturas (LONDE et al., 2007, PANICKER et al 2007). Em que a 
contaminação por fungos é mais fácil de ser controlada por se desenvolver nas 
primeiras etapas do estabelecimento in vitro e ser de fácil visualização. O 
trabalho teve como objetivo identificar a contaminação causada por fungos no 
meio nutritivo e a eficiência da esterilização térmica e química com hipoclorito 
de sódio na água, vidraria e no meio de cultura no controle destes patógenos. 
 
MATERIAL E MÉTODOS 
 
 O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biotecnologia da Universidade 
do Estado da Bahia UNEB, Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais, 
Campus III. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente 
casualizado com seis tratamentos e quatro repetições ,os tratamentos foram: 
T1-Controle térmico (Água, vidrarias e meio autoclavados), T2- Controle 
químico (Água, vidrarias e meio esterilizados com NaClO), T3- Controle térmico 
(Água, vidrarias autoclavados e meio sem autoclavar), T4- Controle químico ( 
Água, vidrarias esterilizados com NaClO e meio sem esterilização), T5- 
Controle térmico (Água, vidrarias sem autoclavar e meio autoclavado), T6- 
Controle químico (Água, vidrarias sem esterilizar e meio esterilizado com 
NaClO). 
A água, vidrarias e meio foram esterilizados conforme o tratamento, no controle 
térmico a água e as vidrarias foram autoclavadas por 40 minutos a temperatura 
de 120 °C com 1Kgf cm², enquanto o meio foi esterilizados nas mesmas 
condições de temperatura por 20 minutos. No tratamento químico a 
esterilização química com hipoclorito de sódio, da água, vidrarias e meio de 
cultura seguiu o protocolo de Teixeira (2008). 
O meio nutritivo, da fase de enraizamento, foi constituído dos sais inorgânicos 
de MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), vitaminas de White (WHITE, 1943), 
 
 
100 mg L-1 de i-inositol, 30 g L-1 de sacarose, e 10 g L -1 de ágar como agente 
de solidificação do meio. O pH do controle, autoclavado foi ajustado para 5,7 ± 
1, nos tratamento esterilizados quimicamente aferiu-se o pH em 6,0 ± 1, após 
15 minutos da adição de 0,003 % NaClO no meio. 
O meio foi distribuído em frascos de cultura na câmara de fluxo laminar, e 
foram observados diariamente, durante 30 dias, afim da constatação de 
indícios de contaminação fúgica. 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
Os resultados referentes à presença de contaminação podem ser observados 
na tabela 1. O tratamento térmico em que somente as vidrarias e a água foram 
esterilizadas apresentou 100% de contaminação, 48 horas após a distribuição 
do meio. 
Tabela 1- Percentagem de contaminação em diferentes procedimentos de 
esterilização 
 
Este resultado demonstra a necessidade de autoclavagem do meio de cultura, 
porque apenas a autoclavagem da água e vidrarias não é suficiente no controle 
da contaminação fúngica. Por outro lado, a esterilização química da agua e 
vidrarias foi eficiente na eliminação desses patógenos sem a necessidade de 
adição do NaClO ao meio de cultura. 
A esterilização do meio de culturas e a não esterilização da água e vidrarias 
proporcionou a eliminação dos microrganismos tanto na esterilização química 
quanto na térmica. 
Em princípio, são determinadas quatro fontes de contaminação: a fonte de 
explante, meio nutritivo, o ambiente e a habilidade do operador (SOUZ 
al.,2008). Uma das causas de contaminação por fungos está relacionada a 
cuidados no ambiente. Mesmo com cuidados com assepsia, em biofábricas 
brasileiras já foram registradas porcentagens de contaminação superiores a 
30% causadas tanto por fungos como por bactérias (OLIVEIRA et al., 2000). 
Souza (2008) verificou em seu experimento de propagação in vitro de Cattleya 
walkeriana e Schomburgkia crispa (orquídeas), que com algumas medidas de 
limpeza na prática e na manipulação houve considerável redução na 
contaminação microbiana. 
A contaminação estabelece-se no meio de cultura ou no explante competindo 
pelos nutrientes, além de produzir substâncias tóxicas e inibir o 
desenvolvimento do material inoculado, podendo resultar na sua perda. 
 
CONCLUSÕES 
 
 Tratamentos ContaminaçãoT1 - Controle térmico (Vidrarias, água e meio esterilizados) 0% 
T2- Controle químico (Vidrarias, água e meio esterilizados) 0% 
T3- Controle térmico (Somente água e vidrarias esterilizadas) 100% 
T4- Controle químico (Somente água e vidrarias esterilizadas) 0% 
T5- Controle térmico (Somente o meio esterilizado) 0% 
T6-Controle químico (Somente o meio esterilizado) 0% 
 
 
Apenas a esterilização da vidraria e água com NaClO foi suficiente para 
controlar a contaminação fúngica, sem necessidade de esterilizar o meio 
nutritivo . Em contra partida somente a esterilização do meio foi eficiente no 
controle de contaminantes tanto na esterilização química quanto na térmica. 
Demostrando a vantagem de redução de custos, tempo na execução da 
técnica e potencial significativo no controle de fungos no cultivo in vitro. 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
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PANICKER, B.; THOMAS, P.; JANAKIRAM, T.; VENUGOPALAN, R.; 
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SCHERWINSKI-PEREIRA, JONNY EVERSON SCHERWINSKI PEREIRA. 
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