03 Transferencia de embriões

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FISIOPATOLOGIA DA REPRODUÇÃO II
TRANSFERENCIA DE EMBRIÕES
É uma biotecnica da reprodução importante, pois onde não tem FIV (fertilização in vitro) fazem transferência de embriões (TE). A FIV é uma etapa da PIV (produção in vitro). Nos EUA utilizam muito mais a TE in vivo do que em vitro, pois usam animais taurinos que não respondem muito bem à FIV (vitro). 
É uma técnica antiga, que veio quase junto da inseminação artificial. Com o tempo, os clones e trangenicos foram criados também. Usavam um embrião, com um bisturi de vidro corta-se o embrião ao meio, ele pode se rearranjar formando um clone, mas o embrião na maioria das vezes morre. 
A transferência de embriões se conceitua por inovulação (ato de colocar um embrião em uma receptora). É a prática de deposição dos embriões em estágio inicial de desenvolvimento em receptoras. É usada para várias espécies, inclusive animais selvagens.
Na vaca em questão foram feitas 5 inseminações artificiais em 5 anos gerando 5 bezerros, considerando que metade são fêmeas. Fazendo coleta de embrião de forma conservadora (3x ao ano - a partir da 4° ou 5° coleta a resposta começa a ficar ruim, por isso preconiza-se 3 coletas). Nesta mesma vaca, em 5 anos de trabalho, consegue pelo menos 30 bezerros (sendo metade fêmeas, principalmente se for com sêmen sexado). 
O princípio da transferência de embriões é realizar uma superovulação hormonal com manipulação hormonal do ciclo estral para que não somente 1 folículo cresça e sim vários ao mesmo tempo. Depois de ter vários folículos, realiza-se a inseminação artificial e ao invés de fertilizar um oócito, vários oocitos são fertilizados. Após isso, ocorre a coleta de embriões in vivo (lava o útero e coleta) e depois coloca em receptoras. 
As melhores receptoras são F1 de cruzamento industrial. 
As fêmeas bovinas possuem em torno de 400 mil folículos, mas gera em toda vida em torno de 12 a 14 descendentes, se viver até lá. Normalmente na 5 ou 6° cria, já vai pro abate, pois a produção já começa a cair (reprodução piora e a produção de leite cai). Com os estudos avançando, a criopreservação do sêmen foi descoberta (consegue difundir a técnica de transferência de embriões, pois consegue distribuir material genético bom para o mundo inteiro). Na década de 70 começaram a TE comercial, mas o primeiro bezerro oriundo de TE nasceu em 1951. 
O embrião in vivo aceita muito bem a técnica de congelamento e não diminui os índices de prenhez. Portanto, um embrião in vivo congelado tem as mesmas taxas de prenhez que um embrião in vivo fresco. 
Hormônios e combinações hormonais: usar eCG em varias coletas seguidas terá diminuição da produção de embriões, mas se usar o FSH consegue manter a produção mais constante. 
Protocolos de sincronização e superovulação das doadoras: existem vacas que não respondem aos protocolos de superovulação. 
Inseminação artificial: deve ser bem feita, principalmente sobre a qualidade e viabilidade do sêmen. Caso seja feita de forma errada, pode invalidar todo o processo de TE. 
Individuo: a resposta é individual. Raças, idade, saúde, nível de produção e genética interferem. As raças indianas têm muitos folículos por onda – Brasil é o maior produtor de embriões do mundo, pois usa Nelore, enquanto que as vacas holandesas não dão muitos folículos por onda. Animais mais velhos e doentes não vão responder ao protocolo. 
Ambiente: deve ser favorável à condição do animal (lugar quente para vaca holandesa piora a resposta). Deve oferecer conforto, nutrição adequada e realizar manejo correto.
Técnica de colheita: o procedimento deve ser feito de forma correta. A media nacional é de 5 embriões coletados in vivo viáveis por coleta. 
SELEÇÃO DE DOADORAS: realiza exame visual para avaliar se há problemas clínicos diversos. Realiza também o exame sanitário e vacinações para brucelose, tuberculose, leptospirose e BVD. Avaliar o histórico reprodutivo (de novilhas e vacas). Realizar exame completo ginecológico. Orientar sobre manejo nutricional (mantendo escore de 3 a 4) e manutenção do programa de reprodução com vacas boas (com saúde, boa reprodutora, lactante boa etc. Não se deve escolher uma vaca que é boa em somente um critério, como por exemplo: vaca boa lactante, mas que tem mamite com frequência não deve ser escolhida para reprodução só porque produz muito leite. Uma vaca com produção de leite média, mas com saúde impecável deve ser escolhida). 
SELEÇÃO DE RECEPTORAS: as vacas taurinas emprenham com mais facilidade, enquanto que as zebuínas não. Quando cruza um taurino e zebuíno, busca-se heterose, portanto busca pegar a facilidade de emprenhar das taurinas e a boa adaptação dos zebuínos ao clima brasileiro conseguindo assim os melhores índices de prenhez. A melhor receptora é a F1 oriunda de um cruzamento industrial. realiza exame visual para avaliar se há problemas clínicos diversos. Realiza também o exame sanitário e vacinações para brucelose, tuberculose, leptospirose e BVD. Avaliar o histórico reprodutivo (de novilhas e vacas). Realizar exame completo ginecológico. Orientar sobre manejo nutricional e descartar as receptoras ruins (depende, pois se tem 30 embriões e 40 receptoras deve-se escolher as melhores. Mas se tem 30 embriões, mas se tem apenas 25 receptoras deve colocar embrião em todas para aproveitar, então seleciona os melhores embriões). 
Realizar vacinação contra doenças reprodutivas aumenta em até 10x os índices de prenhez. 
Os estudos foram avançando e descobriram que a cada recrutamento tem aumento da concentração de FSH. Portanto, o hormônio que pode ser usado para superovulação é o FSH ou eCG (se liga nos receptores de FSH). O FSH sobe e desce, pois, os folículos entram em atrésia após o mecanismo de dominância folicular (começa a produzir E2 fazendo feedback negativo para FSH). Os folículos só morrem porque o FSH cai, então fornecendo a suplementação de FSH os folículos podem continuar crescendo. 
Quando o folículo atingir 4 a 5 mm se torna dominante. Neste momento, os níveis de FSH começam a cair, pois o folículo dominante começa a produzir E2 que faz feedback negativo para FSH. No momento do recrutamento, o FSH está alto e os folículos já produzem pouco E2 (não o suficiente para diminuir FSH), a grande produção começa pelo folículo dominante. Portanto, do recrutamento até o desvio, todos os folículos contribuem para a queda do FSH, mas depois do desvio somente o dominante continua contribuindo. 
Ao mesmo tempo em que o E2 começa a ser produzido, o LH começa a subir também, enquanto o FSH continua caindo e é mantido em níveis basais. 
SUPEROVULAÇÃO (SOV): é o método de estimular diversos folículos terciários (antrais, pois são responsivos aos hormônios) a se desenvolverem até o estágio pré-ovulatório, com consequente ovulação. É uma forma de aproveitamento de folículos que seriam perdidos. No momento certo, usa o FSH ou eCG para que os folículos continuem crescendo. 
O melhor momento para a SOV é na emergência da onda folicular, seja espontânea ou induzida. Antigamente não se controlava a onda folicular, então só fazia superovulação quando a vaca dava cio (espontânea). Depois que surgiram os protocolos de IATF consegue fazer a superovulação quando quiser (induzido). 
Quando era espontâneo, dava cio e ovulava. 2 a 3 dias depois começava uma nova onda folicular, mas não poderia fazer a superovulação na primeira onda, pois o corpo lúteo está presente mantendo a progesterona alta impedindo a ovulação. Então começava a SOV no dia 8, 9 ou 10 do ciclo estral. Deve fazer na ultima onda, pois o corpo lúteo morre e a ovulação ocorrerá. 
Então antigamente, o animal dava cio, esperava-se cerca de 9 a 10 dias pra começar a segunda onda, o corpo lúteo lisava, a vaca vinha a cio novamente e então era inseminada. O problema era quando a vaca possuía mais de 2 ondas, então esperar de 9 a 10 dias não seria o melhor momento pra aplicar. Então faziam o protocolo no dia 9 ou 10 e observavam pra ver se tinha funcionado, caso não tenha funcionado significava que a vaca tem mais de 2 ondas, portanto esperavam mais3 a 4 dias (dia 13 ou 14) e aplicavam FSH pegando a 3ª onda. 
O importante é fazer na ultima onda de crescimento folicular, pois é quando a progesterona diminui. 
Hormônios utilizados na SOV: eCG e FSH. O eCG é a gonadotrofina coriônica equina que tem função LH e FSH, possui meia-vida muito longa o que permite dar apenas 1 dose no inicio do recrutamento (concentração sobe e abaixa naturalmente – fazendo perfil natural do FSH). No entanto, justamente por ter meia-vida muito longa a dose deve ser ajustada para que os folículos não sejam demasiadamente estimulados – se der dose alta, alguns folículos podem formar cistos e não ovulam (animais maiores e com metabolismo mais rápido devem tomar doses maiores e animais com metabolismo mais lento precisam de doses menores para evitar a formação de cistos). 
Ao passar o ultrassom, o médico veterinário deve fazer a contagem de folículos para determinar quantas estruturas devem ser coletadas depois. Deve-se passar o ultrassom também para avaliar se o protocolo funcionou, quantos corpos luteos existem etc. Sempre deve fazer prostaglandina após a coleta de embriões, pois se ficar algum pra trás a vaca pode levar adiante e ficar gestante (se for mais de 1 embrião é muito perigoso). 
O uso de eCG tem suas limitações, pois como é de outra espécie gera reação imunológica na vaca e após sua 4ª ou 5ª utilização já não tem os mesmos resultados. Mas a vantagem do uso de eCG é que só é preciso uma dose, enquanto que o FSH precisa ser feito a cada 12 horas. 
O FSH é um extrato de pituitária (hipófise) de suíno muito conservado entre as espécies e por isso pode ser usado com tranquilidade, inclusive em humanos. Mas em equinos não respondem à tratamentos com FSH, por isso não é feito superovulação em éguas. 
São os nomes comerciais de FSH. Ambos com a mesma concentração, o que facilita os cálculos das dosagens. 
Além disso, o FSH é o mais utilizado nos protocolos de SOV, pois é o que responde melhor (consegue coletar mais vezes) quando comparado ao eCG. As vantagens são: produção de pouca reação orgânica para produção de anti-corpos e apresenta os melhores resultados nos protocolos de superovulação. 
As desvantagens do uso do FSH são: necessidade de aplicação a cada 12 horas, custo elevado (difícil de ser encontrado) e há variações da relação de FSH:LH (como é um extrato de hipófise também há concentrações de LH, por mais que o fabricante tente separar ao máximo – quanto maior LH, menor será a produção e qualidade dos embriões). 
Estudo demonstrou que até a 3ª coleta, o FSH e o eCG são muito semelhantes, mas a partir disso, o eCG cai muito devido à reação orgânica. Logo, a partir da 4ª coleta o eCG diminui bastante quando comparado ao FSH. 
Animal dá o cio e no D9 ou D10 começa a suplementação de FSH. Se funcionar, mantem o protocolo tradicional. Mas se não funcionar bem, estende a dose do FSH começando no D12 ou D13. O FSH deve ser administrado em 8 doses de forma decrescente de 12 em 12 horas por 4 dias. Neste protocolo, não se aplica indutor de ovulação, esperava o animal vir a cio normalmente e inseminava. 
Doadoras superovuladas com FSH apresentam cio de 48 a 72h após a aplicação da prostaglandina. Antigamente não se usava, só esperava vir a cio naturalmente. Se aplicar prostaglandina deve ser feito acompanhamento para observação de cio, já que normalmente os sêmens utilizados não são baratos e por isso não podem perder inseminação. 
A dose é única. O calculo deve ser feito baseado na dose total e depois desmembra o resultado em 4 dias (2 aplicações por dia). 
Ex: uma vaca de leite grande, holandesa, para ser superovulada pode começar usando dose máxima de 400mg. Então será 400mg desmembrado em 4 dias e 2x por dia. 
Cálculo de dose: exemplo - o produto tem 20mg/mL e 20mL. Uma vaca holandesa (300mg). Deve ser feito em dose decrescente por 4 dias. No primeiro dia dará 40% da dose total (40% de 300), no segundo dia aplica 30% da dose total (30% de 300), no terceiro dia aplica 20% da dose total (20% de 300) e no ultimo dia aplica 10% da dose total (10% de 300). 
40% de 300 = 120mg (1° dia – desmembrar em 2x, logo de manhã será feito 60mg e de tarde será feito 60mg). 
30% de 300 = 90mg (2° dia – desmembrar em 2x, logo de manhã será 45mg e de tarde será feito 45mg).
20% de 300 = 60mg (3° dia – desmembrar em 2x, logo de manhã será 30mg e de tarde será 30mg).
10% de 300 = 30mg (4° dia – desmembrar em 2x, logo de manhã será 15mg e de tarde será 15mg). 
Se a concentração é 20mg/mL e está usando 300mg, faz regra de três. 
20 mg ------ 1 mL
300 mg ----- x mL
X = 15 mL (completa com 5mL de solução fisiológica pra ficar 20mL com 300mg).
40% de 20mL = 8mL (1° dia – desmembrar em 2x, logo será 4mL de manhã e 4mL de tarde)
30% de 20mL = 6mL (2° dia – desmembrar em 2x, logo será 3mL de manhã e 3mL de tarde)
20% de 20mL = 4mL (3° dia – desmembrar em 2x, logo será 2mL de manhã e 2mL de tarde)
10% de 20mL = 2mL (4° dia – desmembrar em 2x, logo será 1mL de manhã e 1mL de tarde).
A concentração do fármaco pode mudar, nem sempre será 20mg. Assim como a dose total pode mudar. O Folltropin® vem na dose 400mg (na concentração de 20mg/mL). O uso da dose deve depender da vaca (zebuína, europeia ou de leite). 
É um protocolo mais moderno do que o anterior. Faz observação de cio. Faz a coleta de acordo com a disponibilidade do veterinário, pois há um controle do crescimento folicular. O protocolo de superovulação é um protocolo de IATF com suplementação de FSH. 
No D0 aplica-se benzoato de estradiol e introduz o implante de P4 para resetar a onda e começar uma nova depois de 2 a 3 dias. No D5 começa a suplementar, pois pega os folículos crescendo, fazendo suplementação do D5 até D8. Se fosse fazer a suplementação com eCG seria no D5 em dose única. No D7 aplica prostaglandina e retira o implante de P4. Se quiser esperar dar cio pode, mas pode induzir à ovulação (caso faça a indução, a aplicação de PFG2alfa e a retirada do implante devem ser feitas uns dias pra frente). A indução pode ser feita com GnRH (insemina com 24h), benzoato de estradiol e cipionato de estradiol (não é recomendado, pois não sincroniza a ovulação dos folículos então ovula em tempos diferentes. Como há vários folículos dominantes produzindo E2, já está muito alto então não justifica seu uso), LH (é o mais indicado, pois sincroniza melhor – quase todos ao mesmo tempo. É um hormônio muito caro e difícil de ser encontrado, por mais que exista marcas comerciais. O mais utilizado é o GnRH). 
É o mesmo protocolo que o anterior, mas com uso de indutor de ovulação (LH). A inseminação é feita 12h e 24h após a aplicação do LH, pois os folículos vão ovulando e o ideal é que sempre tenha sêmen disponível para fecundar. Pode fazer até 4 inseminações após o uso de LH. 
HORMÔNIOS: nomes comerciais. 
Da mesma forma que faz na IATF, coloca um implante de P4. 
 Resultado da superovulação – ovários da vaca com vários corpos lúteos. 
Há risco de deixar um ou dois embriões no útero no momento da coleta. Por isso deve-se aplicar prostaglandina após a coleta, pode fazer até 2 doses (intervalando entre alguns dias – 2 a 3 dias). 
Sincronização das receptoras: ao coletar os embriões pode congelar (o congelamento de embrião in vivo é muito bom, pois o embrião não perde qualidade) ou pode aplicar na receptora. 
TETF = transferência de embriões em tempo fixo.
Faz o mesmo protocolo, mas quando induz a ovulação não insemina, deixa formar um corpo lúteo. Com 7 dias, coloca o embrião. No dia em que insemina a vaca doadora, a vaca receptora não deve ser inseminada, mas estarão no mesmo dia (sincronizadas). Não podem ter assincronia acima de 24h (uma vaca doadora que tem um corpo lúteo de 7 dias de formação e uma vaca receptora de 5 dias de corpo lúteo estão muito dessincronizadas). Coleta os embriões da doadora e coloca na receptora.
As vantagens são: aproveitamento do maior numero de receptoras e dispensa a observação de cio (pois é controlado, então não precisa olhar se a receptora está no cio ou não. No D7 passa o ultrassom na receptora, setiver corpo lúteo, coloca o embrião. Se não tiver corpo lúteo significa que não respondeu bem ao protocolo e é descartada. Ao colocar o embrião, deve ser colocado no lado em que tiver corpo lúteo). 
As desvantagens são: custo elevado e manejo mais intenso dos animais. 
Preparam-se várias receptoras e não apenas uma. A media nacional são 5 embriões viáveis por coleta, logo a cada doadora deve-se preparar pelo menos 5 receptoras. Pode dar mais que 5 embriões, sendo muito bom já que pode congelar ou pode selecionar os melhores pra colocar na receptora. A media é que uma receptora pode não responder bem ao protocolo, então coloca uma ou duas receptoras a mais do que a média nacional, que seria 5 receptoras pra 1 doadora. 
Existem alguns protocolos que colocam uma dose pequena de eCG no dia 5 pra que um outro folículo cresça e forme mais um corpo lúteo (afirmam que quanto mais progesterona melhores serão os índices de prenhez. No entanto, há controvérsias já que o eCG pode induzir à formação de um cisto folicular ao invés de ovular. 
Suplementação de P4: há estudos sendo desenvolvidos na TETF. Como o implante não pode ficar muito tempo, começaram a aplicar P4 injetável longa ação. Tem que ter pelo menos de 5 a 6 dias após a formação do corpo lúteo pra melhorar um pouco os índices de prenhez. A P4 faz feedback negativo pra LH, logo no momento de ovulação o LH é liberado de forma pulsátil (no inicio do ciclo estral, o LH luteiniza os folículos). Então se fizer P4 antes dos 5 a 6 dias, a P4 fará feedback e os folículos não serão luteinizados, diminuindo ainda os índices de prenhez. Portanto, a P4 deve ser administrada depois que o corpo lúteo estiver formado. 
Sempre quando se fala em coleta de embriões, sempre o foco é a fêmea, no entanto o macho tem grande importância nisso, visto que geralmente nesses protocolos os sêmens utilizados são muito caros. 
Inseminação artificial nas doadoras: deve-se detectar o cio (caso esteja fazendo no caso da onda espontânea, avaliar quando a fêmea aceita a primeira monta – já pode fazer a inseminação, pois os folículos podem ovular e naturalmente há uma assincronia de ovulação); avaliação do sêmen (avaliando motilidade e vigor, quando possível. Geralmente, descongela o sêmen e despeja uma gota na lâmina para avaliação. Depois com a palheta insemina a vaca); manuseio do sêmen (cuidado com o tambor de nitrogênio líquido); deposição de sêmen no útero (usar camisa sanitária, pois insemina o mesmo animal varias vezes. Mas é sempre recomendado seu uso, independente se for apenas uma inseminação. É um plástico que vai na pipeta de inseminação. Quando entra na cérvix, puxa a camisa evitando assim que a pipeta leve contaminação até o útero); momento da inseminação (12 horas após o cio com intervalo de 12 horas até o fim do cio, geralmente fazendo de 3 a 4 inseminações por vaca. O ideal é que a dose do sêmen tenha 30 milhões de espermatozoides por inseminação). 
Sêmen sexado: não é muito recomendado para transferência de embriões, pois a qualidade é muito ruim. Se for usar, o ideal é que use 2 doses por inseminação. 
Ex: vaca deu cio de manhã ou foi induzida, aplica GnRH e insemina 24 horas depois. Depois de 12 horas é feito uma nova inseminação. 
COLETA DE EMBRIÕES: é o procedimento pelo qual se realiza um lavado uterino entre o 6° e o 9° dia após a IA. Na prática, coleta-se entre o 6° e o 7° dia, pois no 9° dia o embrião já está muito avançado e os índices de prenhez caem muito. Mas pode coletar no 9° dia, mesmo não sendo o ideal. 
Preparação do material: os meios são PBS/SFB aquecidos (caso contrário mata os embriões de bovinos, mas equinos não precisa aquecer. Geralmente usa de 1,5L até 2,0L dependendo da vaca); equipo e coletor (montar o circuito corretamente); bancada de equipamentos (lupa – pra buscar os embriões na placa, coletor, placas, meios – retirar os embriões dos meios sujos de sangue, muco etc fazendo lavados seriados mantendo o embrião vivo “holding”); selecionar cateter de foley (dependendo do tamanho da vaca. Se for muito grande pode usar de 22-24 e novilhas usa de 16-18). 
Com a sonda de foley, introduz no útero, infla o cuff com a seringa para vedar o corno uterino. Depois coloca o meio, enche o corno uterino, faz massagem com a mão. O cateter em Y se conecta na sonda de foley. O PBS fica no alto e o copo coletor com filtro fica no chão. Ao abrir uma torneira, joga meio aquecido pra dentro do corno uterino, faz a massagem pra que os embriões se descolem. Fecha a torneira que jogou meio pra dentro do útero e abre a torneira que vai retirar o meio do útero. O liquido chega ao filtro e os embriões ficam retidos no copo coletor. 
Pode fazer dois lavados: um em cada corno. Ou pode fazer um lavado só no corpo do útero. Ao inflar o cuff, o que vai depender de quanto deve inflar é o tamanho do útero. Isso depende muito de vaca pra vaca, mas não pode inflar demais pois pode romper o corno uterino, mas também não pode inflar de menos, pois os embriões podem escapar e serem perdidos. O médico veterinário deve saber o quanto inflar ao palpar o útero da vaca. 
Após coletar os embriões, são lavados com uso de uma seringa que faz pressão jogando-os em uma placa para serem buscados por lupa. É um processo demorado e demanda experiencia do responsável, assim como a coleta. 
Preparação da doadora: deve-se limpar o reto e fazer epidural (3 a 5mL de lidocaína a 2%. É usado, pois diminui as contrações uterinas. Raças indianas são muito sensíveis e deve fazer dose menor. E raças taurinas parecem ser mais resistentes e necessitam uma dose maior). Deve-se lavar a região do períneo, lábios vulvares e vulva com água e secar com papel toalha. Fixar a cauda do animal, apesar de estar com a epidural que tira o movimento da cauda. E deve-se suspender a bolsa com PBS para o liquido descer. 
Procedimento de coleta: fixar o cateter no útero (é difícil, pois a cérvix está fechada. Necessita prática); fazer lavagem uterina (encher e esvaziar repetidamente os cornos uterinos); massagem dos cornos com a palpação; após a lavagem, desinflar o balão e retirar. 
Os embriões devem passar dentro da sonda de foley. Se passarem lateralmente são perdidos via vagina. Nas vacas holandesas que tem útero pesado e grande geralmente lava-se um corno uterino de cada vez. Nas vacas nelore que tem um útero pequeno pode lavar os dois cornos uterinos ao mesmo tempo. 
 
Cuff inflado obstruindo o corno uterino para não ter escape de embrião. Se inflar demais pode causar lesão no endometrio. 
Os indices de transferência de embrião são melhores do que os indices de inseminação, pois na coleta de embrioes já passou toda a fase critica de ovulação, fecundação etc. 
 
MANIPULAÇÃO E AVALIAÇÃO DOS EMBRIÕES: deve-se lavar bem o filtro e colocar o conteudo do coletor na placa de petri quadriculada. Usa uma seringa grande (por exemplo de 20mL e uma agulha muito fina – gerando um jato forte) para fazer o lavado (causar descolamento do embrião do filtro pra que vá para a placa). Deve-se ajustar o foco da lupa e realizar cuidadosamente a busca. Tem que ter muita atenção nos bordos da placa e ao redor de mucos (embrião pode estar grudado. Com o procedimento de pressao feito com seringa, gera muita espuma, ainda mais se estiver fazendo com PBS e os embriões podem ficar presos na espuma). Após a localização dos embriões, deve-se transferir a estrutura para uma outra placa de meio de cultivo embrionario (“holding”).
 
Na primeira foto há a lupa pra busca com placa e com seringas etc. Na segunda foto, há a demonstração do lavado (que com PBS geralmente forma espuma). 
 
AVALIAÇÃO DOS EMBRIÕES: selecionando os melhores embriões. Na foto há blastocisto, blastocisto expandido e blastocisto eclodido. Normalmente se coleta mórula, mórula compacta e blastocisto expandido (serem as melhores fases pra coletar embrião para inovular na fêmea receptora). 
No verão, é melhor colocar blastocisto. As outras fases geram queda do índice de prenhez. No inverno não há diferença entre a taxa de prenhez com relação à qual estrutura foi inovuladana receptora.
AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DOS EMBRIÕES: 
Mórula: aglomerado de mais 16 células. Consegue ver as células e identificar cada uma. 
Mórula compacta: não consegue identificar cada célula, se tornando uma massa. 
 
Na primeira foto é mórula e na segunda é mórula compacta.
Blastocisto inicial: começa a formação da blastocele. 
Blastocisto: é o melhor estágio. Há diferenciação de camada externa pra formação do trofoblasto (placenta). Além da formação de camada interna que seria o botão embrionário (embrioblasto – embrião). A blastocele está aumentada, ocupando mais da metade do diâmetro do embrião. 
 
Na primeira foto é blastocisto inicial. Na segunda foto é blastocisto. 
Vão existir vários embriões em estágios diferentes, pois a ovulação não foi tão sincronizada, principalmente se for usar GnRH. Se usar o LH vão ovular de forma mais sincronizada. 
Blastocisto expandido: o diâmetro do embrião está expandido e a zona pelúcida está muito fina.
Blastocisto eclodido: o embrião está muito grande e a zona pelúcida se rompeu. O trofoblasto começa a alongar.
 
Na primeira foto é o blastocisto expandido. Na segunda foto é o blastocisto eclodido. 
QUALIDADE EMBRIONÁRIA: existe uma classificação feita pela IETS em 6 estágios: excelente (1), boa (2), regular (3), pobre (4), totalmente degenerado (5) e não-fertilizado (ou não clivado, 6). Geralmente são colocados nas receptoras os embriões classificados como 1 ou 2 (excelente e boa). Mas se tiver receptoras sobrando pode colocar o 3 também. Se tem poucas receptoras e muitos embriões, seleciona-se os melhores. O 1 e 2 são os únicos que devem ser congelados, os outros não sobrevivem ao congelamento. Para FIV, sempre deve ser usado grau 1 e 2. Não existem diferenças entre os índices com os graus 1 e 2, mas há diferenças se usar embriões grau 3 pra cima. 
ENVAZAMENTO DO EMBRIÃO: coloca o embrião no meio de cultivo ou no congelamento (se for essa a proposta). Isola o embrião com uma coluna de ar. O congelamento também é feito dessa forma. Usa para transporte. 
 Com a seringa coloca o meio de cultivo, depois puxa um pouco de ar fazendo a coluna de ar, depois coloca mais o meio de cultivo com o embrião e depois puxa mais ar fazendo uma nova coluna de ar isolando assim o embrião e depois novamente coloca mais um meio. Depois a palheta é vedada com álcool polivinilíco. 
INOVULAÇÃO DOS EMBRIÕES: deve fazer a seleção de receptoras (corpo lúteo palpável com 24h de assincronia em relação ao dia da coleta, sendo que em equinos a assincronia pode ser de até 4 dias, logo se o embrião estiver no D8 pode colocar na receptora que está no D4. Mas em vacas, se a doadora estiver no D7, por exemplo, a receptora deve estar no máximo no D6. Com ultrassom é melhor, pois se o corpo lúteo estiver interno consegue ver, mas com a palpação não consegue. E avaliar o tônus uterino também – e deve descartar útero contraído que é característico de estro e útero flácido que é característico de anestro). 
Não havendo receptoras suficientes, deve-se selecionar os embriões a serem criopreservados. Para congelar sempre deve ser o melhor embrião, portanto congela-se o embrião grau 1. Se for escolher quais embriões congela e quais vão ser inovulados, deve-se congelar o grau 1 e inovular o grau 2, garantindo assim que a qualidade do embrião congelado se mantenha e não diminua os índices de prenhez futuramente quando forem utilizados. 
Ajustar os estágios de desenvolvimento dos embriões com o dia do ciclo da receptora e inovular o embrião. Atualmente consegue sincronizar com mais facilidade, já que consegue ter o controle do desenvolvimento da onda folicular, mas antigamente era mais difícil. 
Deve preparar as receptoras, limpando o reto delas e amarrando as caudas, além de fazer a anestesia epidural (pois, coloca no corno do útero – no lado que tenha o corpo lúteo). Deve-se passar a cérvix e deslocar o inovulador até o terço médio do corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo. Deposita o embrião no útero e os resultados esperados são de 40 a 60% de prenhez. 
 
Nas fotos estão os inovuladores. São muito parecidos com os aplicadores de sêmen, no entanto são mais compridos e finos. Coloca uma bainha de embrião ou inseminação, além da camisa sanitária (é obrigatória). Ao passar o primeiro anel da cérvix, puxa a camisa para inovular o embrião. 
INOVULAÇÃO: 
 
A inovulação deve ser feita na área indicada em vermelho. Deve introduzir a pipeta com cuidado, o ideal é que o corno uterino “vista” a pipeta para evitar lesão na parede uterina (teria sangramento e o útero mataria o embrião). 
Ao retirar o inovulador da vaca e perceber sangue na ponta é um péssimo sinal, pois indica hemorragia no útero e provavelmente não terá prenhez. 
CRIOPRESERVAÇÃO DOS EMBRIÕES: é uma boa opção para embriões in vivo, mas os embriões in vitro não respondem bem ao congelamento. Os meios de congelamento são: glicerol e etilenoglicol (desidratam os embriões, pois a água pode cristalizar e romper as células matando os embriões). O glicerol não é tão utilizado atualmente, pois exige uma maior complexidade no momento do descongelamento. O etilenoglicol é o mais utilizado, pois possui um descongelamento mais simples. 
O descongelamento é bem parecido com o do sêmen. Deve aquecer a água à 35°C, coloca o embrião dentro, irá descongelar e estará pronto para inovulação. O descongelamento por glicerol exige temperaturas muito especificas e outros métodos, por isso não é mais utilizado. 
Para o congelamento pode usar o cilindro ou maquina de congelamento, sendo que a maquina controla melhor. Sendo que os melhores resultados são obtidos com mórulas compactas, blastocistos iniciais e blastocistos com qualidade 1 e 2. 
O embrião equino aceita melhor o resfriamento, enquanto que o bovino não aceita. 
Não pode colocar o embrião direto dentro do nitrogênio líquido, pois matará todos. Deve-se fazer a curva de congelamento, onde a temperatura vai diminuindo gradualmente. Começa deixando 10 a 15 minutos na temperatura de -6°C a -7°C, depois diminui 0,3°C a 0,5°C por minuto até chegar em -33°C, depois disso pode mergulhar os embriões no cilindro com nitrogênio líquido à -196°C. Pode fazer isso manualmente ou pode deixar que a máquina do cilindro faz automaticamente. 
DESCONGELAMENTO: com glicerol ou etilenoglicol. Com glicerol, deve-se retirar a palheta do botijão e segurá-la por 10 segundos ao ar, e depois mergulha-la em banho maria a 30-32°C por 20 segundos. Depois coloca o embrião na placa contendo sacarose molar 1 por 10 minutos, lavar 2 vezes em meio de cultivo. Depois disso pode envasar e inovular. 
Devido à essa complexidade, o etilenoglicol é mais utilizado. Deve-se retirar a palheta do botijão e segurá-la por 10 segundos ao ar, e depois mergulha-la em banho maria a 30-32°C por 20 segundos. Depois disso, pode montar o inovulador e inovular. 
SITUAÇÃO ATUAL: 
 As vacas que compõem os 85% de resposta são variáveis, pois tem vacas que respondem muito bem e tem vacas que não respondem tão bem assim. 
 A média nacional são 5 a 6 embriões viáveis, mas 50% das vacas (daqueles 85% que respondem) vão dar menos que 6 embriões viáveis. 
35% das vacas darão acima da média. 
Isso demonstra que as respostas são muito variáveis, por genética, individualidade etc. Pode ter incompatibilidade genética com sêmen, que geraria problemas em ter os embriões, já que os índices de prenhez caem. 
A média é coletar 5 a 6 embriões, mas a realidade da maioria não é essa. No entanto, tem vacas que dão 30 embriões (principalmente em vacas nelore que possuem muitos folículos). 
O custo varia muito, principalmente dependendo do valor do dólar já que muitos hormônios são importados.