Biópsia líquida: uma alternativa menos invasiva para detectar câncer

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ZORZETTO, Ricardo.No sangue, mais pistas sobre o câncer. 
	“O que é o câncer?”
 Em 1847, o médico inglês Henry Bence Jones encontrou na urina de pessoas com mieloma múltiplo uma proteína característica desse câncer que atinge a medula dos ossos. De lá para cá, cerca de duas dezenas de proteínas mensuráveis no sangue vêm sendo usadas como indicadores de surgimento, crescimento ou regressão de tumores. Algumas delas se tornaram bastante conhecidas, como o antígeno prostático específico (PSA), sinalizador de tumores na próstata. São ferramentas úteis, embora não tenham a precisão desejada: em alguns casos, seus níveis podem estar elevados e não haver tumor; em outros, a doença pode existir e a proteína não estar detectável. Nos últimos anos, médicos e pesquisadores em centros de oncologia dos Estados Unidos, da Europa e do Brasil começa ram a investigar formas de prever a evolução de certos tipos de câncer e o modo como respondem a alguns tratamentos por meio da detecção de fragmentos de DNA, de células e até de vesículas que o tumor libera no sangue. 
	“Como funciona o diagnóstico oncológico?”
 Em 1847, o médico inglês Henry Bence Jones encontrou na urina de pessoas com mieloma múltiplo uma proteína característica desse câncer que atinge a medula dos ossos. De lá para cá, cerca de duas dezenas de proteínas mensuráveis no sangue vêm sendo usadas como indicadores de surgimento, crescimento ou regressão de tumores. Algumas delas se tornaram bastante conhecidas, como o antígeno prostático específico (PSA), sinalizador de tumores na próstata. São ferramentas úteis, embora não tenham a precisão desejada: em alguns casos, seus níveis podem estar elevados e não haver tumor; em outros, a doença pode existir e a proteína não estar detectável. Nos últimos anos, médicos e pesquisadores em centros de oncologia dos Estados Unidos, da Europa e do Brasil começa ram a investigar formas de prever a evolução de certos tipos de câncer e o modo como respondem a alguns tratamentos por meio da detecção de fragmentos de DNA, de células e até de vesículas que o tumor libera no sangue. 
No final dos anos 1990, pesquisadores na França e nos Estados Unidos observaram que o sangue de pessoas com câncer continha mais DNA. Pouco depois, a bióloga brasileira Diana Nunes comprovou que a origem desse material era, de fato, o tumor. Ela fazia mestrado sob a orientação do bioquímico inglês Andrew Simpson no Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer, em São Paulo, e, em parceria com o oncologista Luiz Paulo Kowalski, do A.C.Camargo Cancer Center, analisou o material genético extraído da saliva e do sangue de pessoas com câncer de boca. Em um artigo de 2001 no International Journal of Cancer, o trio provou que parte do DNA encontrado nesses fluidos apresentava o mesmo defeito que o das células do tumor, portanto, só poderia ter vindo dele. “Foi o primórdio da biópsia líquida”, lembra o biólogo Emmanuel Dias-Neto, coordenador do Laboratório de Genômica Médica do A.C.Camargo, onde Diana trabalha. O avanço das técnicas de sequenciamento genético na última década tornou mais fácil identificar as alterações que caracterizam os diferentes tumores e rastreá-las no sangue.
	“O que é biópsia líquida e qual a sua importância?”
Exames de imagem ajudam a identificar um provável câncer, mas é a análise que o médico patologista faz do material da biópsia que permite definir se um tumor é maligno e quais as suas características, informações fundamentais para se definir o tratamento. Apesar de mais informativa, a biópsia de um tecido é um procedimento invasivo que pode exigir internação e uso de anestesia. Em certos casos, opta-se por não fazê-la porque o tumor está perigosamente próximo de uma artéria importante ou um órgão vital. Outro complicador é que os tumores são formados por diferentes populações de células, que mudam com o tempo. Por causa dessa heterogeneidade e da variabilidade, a informação de que a biópsia tradicional oferece sobre o tumor pode não ser a mais completa nem a mais atualizada. Essas dificuldades têm impulsionado a busca de alternativas que sejam mais confiáveis do que a biópsia de tecido e mais simples de realizar, como a biópsia líquida. 
Essa estratégia é a biópsia líquida, assim chamada por exigir apenas a coleta de sangue ou outros fluidos corporais, como saliva e urina. Ainda em fase de desenvolvimento, essa técnica é oferecida desde meados de 2016 em alguns hospitais de São Paulo e do Rio de Janeiro e desperta o interesse de médicos e pacientes, além do entusiasmo de empresas de biotecnologia, interessadas em um mercado de venda de equipamentos e insumos e de realização de testes que movimentou US$ 580 milhões nos Estados Unidos no ano passado e deve alcançar US$ 1,7 bilhão em 2021, segundo previsão da empresa de pesquisa de mercado MarketsandMarkets. É que a biópsia líquida promete vantagens em relação à biópsia tradicional, na qual se extraem, por punção com agulha ou por cirurgia, amostras do tecido doente. 
 O primeiro teste de biópsia líquida disponível comercialmente foi desenvolvido por uma empresa farmacêutica multinacional, a Roche, e liberado para uso nos Estados Unidos no início de 2015. Em junho do ano passado, um laboratório do Rio de Janeiro especializado em testes moleculares, o Progenética, passou a fazer biópsia líquida usando o kit importado. O teste detecta no sangue fragmentos de DNA contendo uma alteração no gene EGFR específica do adenocarcinoma de pulmão, o tipo de câncer mais comum nesse órgão e o mais frequente entre os não fumantes. Conhecida pela sigla T790M, essa mutação indica que o tumor se tornou resistente ao tratamento com inibidores de tirosina-quinase de primeira e segunda gerações, medicamentos que agem sobre as células do tumor e poupam as sadias.
 A biópsia líquida que o grupo de Dirce Carraro tornou disponível no A.C.Camargo avalia mutações em outros 13 genes. Alguns estão frequentemente alterados no câncer de pulmão, outros nos tumores de intestino (cólon e reto) e outros ainda no melanoma, a forma mais agressiva de câncer de pele. Assim como no adenocarcinoma pulmonar, nesses casos a biópsia líquida ajuda a orientar o tratamento ao permitir detectar mutações de sensibilidade ou resistência aos medicamentos. “Os médicos que se interessarem também podem solicitar esse teste para outros tumores que tenham algum desses genes alterados”, sugere Dirce, coordenadora do Laboratório de Genômica e Biologia Molecular do A.C.Camargo. Há três anos ela trabalha para desenvolver uma biópsia líquida que auxilie no monitoramento de resposta à quimioterapia para pessoas com tumor de Wilms, um câncer raro nos rins, que costuma ser detectado entre os 2 e os 5 anos de idade e afeta uma em cada 10 mil crianças. O objetivo é que, no longo prazo, também se possa usar o teste para realizar o diagnóstico do problema. “Se um dia conseguirmos fazer o diagnóstico precoce por meio do DNA tumoral na urina, pode se tornar viável iniciar o tratamento antes de surgirem os sintomas”, propõe Dirce
 No Hospital Sírio-Libanês (HSL), biópsias líquidas são usadas experimentalmente pelo grupo da pesquisadora Anamaria Camargo para monitorar a sensibilidade de três tipos de tumor (pulmão, mama e cólon e reto) a medicamentos e detectar de forma precoce o desenvolvimento de resistência ao tratamento. Atualmente, os pesquisadores monitoram 30 pessoas de cada um desses grupos por meio de exames de sangue realizados mensalmente. “Estamos quantificando moléculas de DNA que carregam mutações associadas à resistência ao tratamento em cada um desses tipos de câncer e verificando se existe uma associação entre a quantidade de DNA com alterações, a resposta ao tratamento e a progressão clínica da doença”, conta Anamaria, coordenadora do Centro de Oncologia Molecular do HSL. Ela começou a trabalhar com biópsias líquidas há quase 10 anos quando, em parceria com o grupo de cirurgiões do aparelho digestivo Angelita Habr-Gama e Rodrigo Oliva Perez, do Instituto Angelita e Joaquim Gama, iniciou o desenvolvimento de um testepersonalizado para verificar se o tratamento neoadjuvante com rádio e quimioterapia em tumores de reto estava surtindo o efeito esperado e detectar o reaparecimento da doença. O teste se mostrou viável, mas, em um experimento-piloto, notou-se que precisa de ajustes: ele foi capaz de detectar com 18 meses de antecedência o ressurgimento do tumor, mas nem sempre permitiu definir se a doença foi totalmente eliminada com o tratamento (ver Pesquisa FAPESP nº 237). No sangue de uma pessoa com câncer há mais do que DNA do tumor. Em certas situações, ele pode conter células que se desprenderam do câncer original, além de pequenas bolsas (vesículas) que recebem o nome de exossomos e estão repletas de conteúdo das células tumorais. A bioquímica Ludmilla Chinen, pesquisadora do A.C.Camargo, constatou que elas também revelam muito sobre a enfermidade. Ela e seus colaboradores já acompanharam 280 pessoas com diferentes tipos de câncer e notaram que a concentração de células tumorais no sangue pode servir como indicador dinâmico da resposta aos medicamentos. “Podemos dizer se o tratamento está tendo sucesso em dois meses, quase metade do tempo que levaria para se verificar por um exame de imagem”, conta Ludmilla. Nos últimos anos, ela e seus colaboradores constataram também que moléculas expressas pelas células tumorais circulantes podem indicar tolerância a determinados medicamentos usados contra o câncer de cólon e reto. Os pesquisadores suspeitam ainda que a análise dessas células permita predizer o surgimento de metástase. Eles acompanharam pessoas com câncer de cabeça e pescoço de grau avançado e sem metástase e viram que, quando as células tumorais migram em pequenos grupos, os microêmbolos, há uma probabilidade maior de surgirem novos focos da doença. Por volta de 2008, o grupo do médico David Lyden, da Universidade Cornell, nos Estados Unidos, começou a observar que os exossomos funcionariam como mensageiros celulares, carregando para outros tecidos informações necessárias para preparar novos focos do tumor. Com a colaboração dos bioquímicos brasileiros Bruno Costa Silva e Vilma Regina Martins, a equipe de Cornell criou um modelo de metástase de melanoma em camundongos. Os pesquisadores injetavam na corrente sanguínea de roedores com câncer de pele exossomos característicos do melanoma e acompanhavam o percurso das vesículas. Em um trabalho publicado em 2012 na Nature Medicine, eles verificaram que os exossomos, encontrados em maior quantidade nas formas mais agressivas desse câncer, primeiro migravam até a medula dos ossos. Ali, as informações contidas nos exossomos reprogramavam as células-tronco formadoras de vasos sanguíneos e as orientavam a se dirigirem para os pulmões, onde, além de gerar novos vasos, despertavam uma inflamação. Essa inflamação, por sua vez, criava um ambiente pré-metastático e atraía quimicamente as células tumorais dis persas no sangue. “O tumor libera essas vesículas antes que células comecem a se desprender dele para migrar”, explica Vilma, superintendente de pesquisa do A.C.Camargo. “Isso torna os exossomos um potencial alvo de terapias que tentem bloquear a formação de metástase”, diz a bioquímica. Alguns especialistas estimam que de 20% a 25% dos 30 mil novos casos de câncer de pulmão que surgem por ano no Brasil tenham alguma mutação no gene EGFR e possam se beneficiar das terapias alvo-dirigidas. “Do ponto de vista de saúde pública, vale a pena discutir a possibilidade de tornar a biópsia líquida e o uso desses medicamentos disponíveis no Sistema Único de Saúde (SUS)”, conta Helano Freitas. Apesar desses números, ainda deve levar algum tempo para que a detecção de células tumorais circulantes e de exossomos por biópsia líquida se torne rotina em mais hospitais e centros oncológicos. 
	“O que são os biomarcadores?”
	“Qual tipo de biópsia é mais vantajosa: tecidual ou líquida?”
Essas dificuldades têm impulsionado a busca de alternativas que sejam mais confiáveis do que a biópsia de tecido e mais simples de realizar, como a biópsia líquida. Por poder ser repetida com mais frequência, médicos e pesquisadores começam a ver essa técnica como possível opção para acompanhar a evolução de certos tipos de câncer, monitorar a resposta ao tratamento e identificar o reaparecimento de tumores antes que se tornem detectáveis nos exames de imagem. A versão da biópsia líquida que detecta o material genético tumoral na corrente sanguínea – o DNA tumoral – já é adotada em alguns centros oncológicos do exterior e também em São Paulo e no Rio de Janeiro. A favor de seu uso, há evidências de que o DNA tumoral encontrado no sangue reflete melhor do que a biópsia tradicional ou os marcadores proteicos a atividade das células neoplásicas e as transformações pelas quais o câncer passa ao longo do tempo e do tratamento.
	“Qual o custo da biópsia líquida?”
Em uma fase inicial, mesmo a versão do teste mais consolidada, que identifica o DNA tumoral, deve permanecer restrita aos atendimentos privados ou pagos pelos planos de saúde. “O Brasil não se preparou para oferecer o diagnóstico molecular no sistema único de saúde”, critica o oncologista Carlos Gil Ferreira. De 2002 a 2015, ele foi diretor de pesquisa clínica do Instituto Nacional do Câncer (Inca), no Rio de Janeiro, e no final de 2016 deixou de ser sócio do laboratório Progenética. Atualmente ele coordena a pesquisa em oncologia no Instituto D’Or de Pesquisa e Ensino (Idor), onde um grupo trabalha no desenvolvimento de uma forma de biópsia líquida para tumores de fígado. “Por questão de custo e de estratégia, o país não está pronto para a era da medicina de precisão.” Roger Chammas, professor de oncologia na Faculdade de Medicina na Universidade de São Paulo (FM-USP) e coordenador do Centro de Investigação Translacional em Oncologia do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (Icesp), imagina que a incorporação da biópsia líquida no SUS só deve ocorrer depois que for ampliado o acesso às terapias alvo-dirigidas, cuja aplicação pode ser orientada por esses exames. O biólogo português Rui Reis é mais otimista. Ele coordena o Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular do Hospital do Câncer de Barretos, no interior de São Paulo, que atende exclusivamente pacientes do SUS, e imagina que, colocadas na ponta do lápis, as vantagens proporcionadas por esse tipo de teste podem até baratear o tratamento do câncer. “Esses testes são caros em uma fase inicial, mas o custo diminui quando começam a ser usados em larga escala”, afirma. Antes que se pense em disseminar o uso da biópsia líquida, será preciso ainda descobrir qual das técnicas funciona melhor. “Está todo mundo à procura do melhor método”, lembra Reis 
	“Quem descobriu a biópsia líquida?”	
	“O papel da enfermagem na inovação da biópsia líquida?”
	SALVÀ, Jaime Ribes. Biopsia Líquida en el Diagnóstico del Cáncer.
	“O que é o câncer?”
O câncer é uma das causas de morte com maior incidência sobre a população nestes tempos. Esta enfermidade consiste em divisões anormais e descontroladas de células endógenas do organismo produzidas por uma série de mutações do DNA que permitem a proliferação e o crescimento celular independentemente dos sinais que possa receber esta célula. As massas tumorais em crescimento podem chegar a invadir tecidos adjacentes e inclusive colonizar tecidos distantes de onde se originou o tumor primário (metástases). (...) 
	“Como funciona o diagnóstico oncológico?”
Atualmente, a maioria dos protocolos para o diagnóstico do câncer em pacientes está baseado e biópsias as quais prioritariamente proporcionam informações do tumor primário do qual se obteve a amostra. Atualmente, a maioria dos protocolos para o diagnóstico de câncer em pacientes é baseada em biópsias, que nos fornecem informações sobre o tumor primário a partir do qual a amostra foi obtida, ignorando outras subpopulações de células cancerígenas e sem fornecer muita informação sobre células metastáticas, uma vez que eles podem ter características genômicas muito diferentes daquelas do tumor primário.Dessa maneira, uma biópsia tradicional pode levar a um diagnóstico ineficaz e, portanto, a decisões incorretas no monitoramento do câncer e na escolha de seus alvos terapêuticos. Além disso, certos tipos de câncer, como o câncer de pulmão, ao realizar a biópsia, podem representar um risco para o paciente devido à sua localização. Todas essas limitações levaram à busca de novas e mais precisas metodologias de diagnóstico e monitoramento que forneçam mais informações sobre o câncer. 
	“O que é biópsia líquida e qual a sua importância?”
Desta maneira, surge o conceito de biópsia líquida, que consiste na identificação e análise de marcadores como células tumorais circulantes (CTCs), ácidos nucléicos livres e outros tipos de biomarcadores, que podemos encontrar nos diferentes fluidos corporais, do tumor primário e / ou de tumores resultantes de metástase. Assim, esse método não invasivo nos permite estudar o câncer do paciente com maior facilidade de obtenção e quantidade amostral.
	“O que são os biomarcadores?”
 Os biomarcadores são marcadores biológicos que podem ser objetivamente medidos e avaliados como um indicador de um processo biológico normal, um processo patológico ou uma resposta farmacológica a uma intervenção terapêutica. Em 1869 o médico australiano T.R. Ashworth encontrou, durante uma autópsia, células com características muito parecidas as cancerosas no sangue de um cadáver próximos a tumores subcutâneos, 3 anos depois de Johannes Müller definiu que os tumores são formados por células. Apesar disso, até 2004 que o termo biópsia líquida não tinha sido cunhado, porque a tecnologia necessária para separar, detectar, enriquecer e estudar CTCs, ácidos nucleicos tumorais circulantes ou outros tipos de biomarcadores tumorais foi desenvolvida durante esses nos últimos anos, permitindo um grande avanço na capacidade de identificar e analisar os marcadores que a biópsia líquida pode nos fornecer. Atualmente, já são utilizados marcadores tumorais proteicos presentes no sangue periférico, como PSA, no câncer de próstata, CA 19-9 e antígeno carcinoembrionário, principalmente no câncer de cólon ou pancreático, e CA 125, que é um marcador muito baixo. específicos, importantes ao diagnosticar e atribuir um tipo de tratamento ou outro em pacientes com câncer. Apesar disso, a maioria dos tumores não possui marcadores ou não é muito específica.
	“Qual tipo de biópsia é mais vantajosa: tecidual ou líquida?”
 A vantagem de estudar CTCs, ácidos nucleicos tumorais circulantes ou outros 6 biomarcadores obtidos por biópsia líquida sobre marcadores de proteínas tumorais, é o monitoramento da dinâmica do tumor e, portanto, de sua evolução no paciente em resposta à terapia ou cirurgia. curativo e em um diagnóstico mais preciso do tipo de câncer, tentando torná-lo o mais precocemente possível. Embora todos esses métodos ainda estejam em fase experimental e não em uso clínico, a grande maioria das pesquisas indica que em um futuro não muito distante, por meio de biópsia líquida, será obtido um perfil genômico personalizado de cada paciente, o que nos permitirá descobrir diferentes fatores esteja ciente do câncer. Ele nos fornecerá informações sobre a agressividade do tumor, seu desenvolvimento contra um determinado tratamento, os tecidos mais sensíveis às metástases, os níveis de doença residual mínima após terapia ou cirurgia curativa e o desenvolvimento de padrões diagnósticos mais específicos. 
	“Qual o custo da biópsia líquida?”
	“Quem descobriu a biópsia líquida?”	
	“O papel da enfermagem na inovação da biópsia líquida?”
	HUESO, María Villaverde de. El papel de la enfermería en la Biopsia Líquida. 
	“O que é o câncer?”
O câncer continua sendo uma das principais causas de morbidade no mundo. As estimativas populacionais indicam que é provável que o número de casos aumente para 70% nas próximas décadas. Desde 2000, em nosso país, o número de tumores experimenta um crescimento constante devido ao crescimento populacional, ao aumento da expectativa de vida e ao uso de técnicas de detecção precoce mais precisas. Uma dessas ferramentas é a LB, que potencialmente permite o diagnóstico e a triagem de tumores por uma via não invasiva, que em um futuro próximo representará uma mudança no entendimento da biologia molecular dos cânceres. Justificativa e objetivos: A atual prática biossanitária na disciplina de oncologia deve diagnosticar um paciente com maior exatidão e precisão para adotar a melhor opção terapêutica individual e naquele momento específico.
	“Como funciona o diagnóstico oncológico?”
5.3 PERFIL E DIAGNÓSTICO MOLECULAR O tratamento do câncer é baseado em diagnóstico histológico e perfil molecular para selecionar as terapias apropriadas para cada situação clínica. Com a extração sanguínea e o estudo molecular de produtos tumorais, principalmente cfDNA, mas também CTCs ou exossomos, são estabelecidas as características moleculares e evolutivas do tumor, como a heterogeneidade do tumor
 Nos últimos anos, houve um aumento notável no conhecimento do câncer, acompanhado por um desenvolvimento tecnológico muito importante que nos apresenta o caminho da medicina de precisão e da oncologia de precisão em particular (1). ) (Figura 2). Desde o seu início, a medicina de precisão foi entendida como o conjunto de testes de diagnóstico e os tratamentos resultantes voltados para as necessidades particulares dos pacientes. Onde a especialidade oncológica deve oferecer todas as ferramentas que permitam conhecer as características fundamentais e diferenciais do câncer, além da ativação contínua de sinais específicos de proliferação, principalmente aqueles relacionados a fatores que estimulam a progressão e crescimento aberrante das células. Isso permite que certos medicamentos, pelo menos em teoria, sejam capazes de inibir especificamente um oncogene ativado e alterar seletivamente as células tumorais, evitando células viáveis ​​saudáveis ​​(9). Uma dessas ferramentas, a mais atual e a que mais investe, tanto em termos de tempo quanto de recursos financeiros, é a biópsia líquida (BL), que potencialmente permite o diagnóstico e a triagem de tumores por vias não invasivas, que no futuro próximo representarão uma mudança no paradigma da compreensão da biologia molecular dos cânceres e, particularmente, da CM, devido à sua heterogeneidade. 
	“O que é biópsia líquida e qual a sua importância?”
5.2 APLICAÇÕES POTENCIAIS DA BIOPSIA LÍQUIDA Por meio de uma extração sanguínea, uma técnica não invasiva que também permite que seja repetida quantas vezes for necessário, pode ser estabelecido um perfil molecular que abre as portas para um número significativo de aplicações clínicas que são o objetivo da medicina de precisão. Embora o desafio científico, instrumental, humano e tecnológico seja ambicioso com os avanços atuais, é possível que seja alcançado no futuro imediato. Posteriormente, será necessário validar e padronizar todo o processo, desde a obtenção da amostra, passando por sua análise, até a demonstração de sua utilidade clínica. Porque surge a questão de saber se os resultados alcançados no plasma reproduzem os obtidos no tecido. Nesse sentido, o potencial do cfDNA permite que aplicações clínicas sejam adquiridas a partir da biópsia que será utilizada nos próximos anos (17).
 O termo biópsia líquida foi cunhado por Klaus Pantel e Catherine Alix-Panabières para estudar células tumorais circulantes (CTCs) no sangue de pacientes, mas atualmente está sendo expandido para estudar o ácido desoxirribonucleico (DNA) 6 do tumor circulante (DNA) 6 (ctADNA), o ácido ribonucleico (RNA), o conteúdo dos exossomos e até as informações sobre tumores que as plaquetas possuem e que estão associadas aos tumores. Os estudos de LB podem ser realizados tanto no sangue quanto em outros fluidos corporais, como urina, saliva, líquido cefalorraquidiano (LCR) ou derrame pleural, entre outros (10) (Figura 3). 1.6.1 BIOFLUIDOS COMO FONTE DE INFORMAÇÃO PARA A BIOPSIA LÍQUIDA A seleção de um ou outro fluidopara obter informações sobre a doença dependerá do tumor e da acessibilidade da amostra. Em cada um desses biofluidos, há informações moleculares que são coletadas para análise por BL. O sangue é o biofluido mais utilizado na busca de marcadores tumorais. Nos tumores de disseminação hemática (mama, próstata, cólon ou pulmão), podemos encontrar células tumorais e ácidos nucléicos que escapam do tumor primário ou metástase e têm a capacidade de migrar e intravascularizar a circulação. Essas "impressões digitais" ou marcadores de tumor fornecem informações valiosas sobre a doença. Como a coleta da amostra é baseada, por exemplo, em uma simples coleta de sangue (Figura 4) - um procedimento invasivo de rotina e muito pouco - é possível coletar amostras diferentes em toda a doença e, assim, acompanhar o progresso como a evolução do câncer, em oposição à imagem estática obtida nas biópsias de tecidos (10). No plasma e / ou soro de pacientes com câncer, vamos encontrar uma grande quantidade de proteínas marcadoras de tumor de origem proteica, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno de carboidratos 19-9 (CA19.9) ou antígeno específico da próstata (PSA). No entanto, a atual revolução no campo de estudo de marcadores sanguíneos, graças ao desenvolvimento de técnicas genômicas, possibilita o estudo de ácidos nucléicos circulantes, tanto de DNA quanto de RNA, com grande sensibilidade (11). Em relação ao estudo da urina como biofluido no BL, ele é dividido em sedimentos (estudo macroscópico das estruturas cristalinas dos sais) e no sobrenadante, onde encontramos proteínas, metabólitos, ácidos nucléicos e vesículas de origem extracelular. Em relação à análise de proteínas, um marcador de proteínas amplamente utilizado é o PSA, que é aumentado na urina em pacientes com câncer de próstata, embora a rotina clínica o determine no sangue (12). O DNA na urina provém da filtração glomerular, onde os fragmentos são 100 pares de bases (13), embora dependa do estado do paciente. A atividade enzimática da DNase-1 nos leva a encontrar uma alta fragmentação do DNA, fragmentos de DNA com peso molecular alto (≥ 1kpb) ou baixo (<100 bp). Mutações do DNA presente na urina, do KRAS de pacientes com câncer colorretal e pancreático, bem como do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) foram analisadas em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas com sensibilidades do tipo plasma. A detecção do RNA mensageiro é praticamente nula, devido à ação das RNases, embora seja possível detectar micro RNAs encontrados nos exossomos (11). Na solução hipotônica da saliva, proteínas, DNA e RNA foram isolados, o que faz com que esse biofluido tenha potencial como fonte de biomarcadores, para ser utilizado no BL. Em relação à identificação de proteínas na saliva, foram identificados altos níveis de sensibilidade e especificidade: haptoglobina hp2 (HP), 2-glicoproteína de zinco (AZGP1) e calpropectina no câncer de pulmão e fator de crescimento epidérmico (EGF), p53 , receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2 / neu) e antígeno 15-3 de carboidratos (CA 15-3) em CM (14). A quantidade e a qualidade do DNA salivar é semelhante à do plasma e o fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), inibidor dependente de ciclina da quinansa 2A (CDKN2A), domínio de repetição W-box e WD contendo 7 (foi usado para detectar mutações) FBXW7), HRAS e KRAS; com uma sensibilidade de detecção de 100% com tumores localizados na cavidade oral. O RNA mensageiro salivar permite a identificação no câncer de pâncreas de KRAS, Proteína 3 Like 2 do Domínio de Ligação Metil-CpG (MBD3L2), Proteína 1 da Vesícula Acrossômica (ACRV1) e Subunidade 1 do DolichylPhosphate Mannosiltransferase (DPM1) com sensibilidade de 90% e uma 95% de especificidade (15). A obtenção do LCR, embora seja um procedimento invasivo, é uma alternativa melhor ao LB em tumores localizados no sistema nervoso central, onde a maioria dos pacientes analisados ​​apresentava ácidos nucléicos circulantes no LCR, mas não no plasma (10). Nesse sentido, foram identificados pacientes com diagnóstico de linfomas localizados no sistema nervoso, micro RNA (15b, 21, 19, 92a) (11). 1.7 BIOPSIA LÍQUIDA VERSUS BIOPSIA DO TECIDO "TRADICIONAL" A biópsia do tecido tem sido tradicionalmente considerada uma ferramenta essencial para o diagnóstico e controle de inúmeras doenças. No caso do câncer, a biópsia tecidual permite determinar as propriedades histológicas do tumor, bem como seu perfil genético, para diagnosticar e prever sua evolução e até prever a resposta ao tratamento. Até recentemente, o tecido era a única maneira de estudar mutações tumorais. Apesar dos avanços na obtenção de amostras de tecido, as biópsias têm limitações reais, como a dificuldade de realizá-lo devido à localização em si, a ausência de um tumor visível e a iatrogênese implícita do método e, finalmente, a impossibilidade de repeti-lo. freqüentemente, o que o exclui como método de monitoramento. Isso geralmente é comum, por exemplo, no câncer de pulmão, principalmente nos estágios I ou II, ou seja, estágios muito precoces (16). Outras limitações podem ser devidas a comorbidades dos pacientes, disponibilidade logística, custo e, no caso de análise de tecidos armazenados em bancos, o tempo decorrido que pode degradar muitos elementos. Mas a grande restrição é determinada pela natureza evolutiva do próprio câncer, uma vez que, no processo biológico de formação e expansão da massa tumoral, os clones divergem e formam subpopulações ou subclones diferentes que causam heterogeneidade do tumor. Essa diversidade e plasticidade não é representada em uma amostra de tecido, limitada em tempo e espaço. Nesse sentido, uma das ferramentas que possibilita superar essas barreiras é o chamado BL (Figura 5) (17). O BL permite determinar o fenótipo do tumor ao longo do tempo, ou seja, a evolução do tumor, essencial na administração de um tratamento, pois permite monitorar sua eficácia, bem como as possíveis resistências que possam surgir durante o mesmo. A detecção desses fenótipos celulares resistentes permite não apenas evitar toxicidades desnecessárias, mas também ajustar individualmente o tratamento antes que a doença progrida. Outra vantagem da biópsia líquida é que ela permite determinar a doença residual mínima (EMR). Isso é importante em duas situações clínicas: em tratamentos adjuvantes ou após cirurgia intencional ou na detecção precoce de recidivas (16). A biópsia líquida pode ser um avanço para alcançar os objetivos clínicos de avaliar a eficácia dos tratamentos (sobrevivência global ou sobrevida livre de progressão da doença) ou por meio de biomarcadores que servem como substitutos de um desfecho clinicamente significativo e que é esperado para prever o efeito de uma intervenção terapêutica, devido a critérios anteriores e mais gerenciáveis, tanto em clínicas convencionais quanto em ensaios clínicos (17). 
	“O que são os biomarcadores?”
COMPONENTES DA BIOPSIA LÍQUIDA A biópsia líquida refere-se à análise de células tumorais circulantes (CTCs) e ácidos nucleicos circulantes livres de células, principalmente DNA tumoral circulante (cDNA), RNA e exossomos. Todos eles são liberados no sangue periférico do tumor primário e / ou em depósitos metastáticos. Os componentes de uma biópsia líquida fornecem a paisagem genética e epigenética de todas as lesões cancerígenas e oferecem a oportunidade de acompanhar sistematicamente a evolução genômica do tumor (10). 5.1.1 CÉLULAS TUMORAS CIRCULANTES (CTCS) As CTCs são células cancerígenas que foram mortas e estão migrando ativamente para a corrente sanguínea do tumor primário. Eles podem sofrer metástases para lesões primárias ou outras (hipótese de semeadura) em órgãos distantes e são responsáveis ​​pela maioria das mortes relacionadas ao câncer. A transição epitélio-mesenquimal (EMT) facilita a disseminação metastática e a progressão das células tumorais do tumor primário para os tecidos circundantes e órgãos distantes. Alterações na expressão que ocorrem nas células durante o processoEMT alteram a polaridade das células epiteliais, de modo que elas adquirem as características morfológicas e bioquímicas das células mesenquimais. Esse processo é essencial para as células tumorais contornarem a apoptose, anoikis, senescência celular e escaparem do sistema imunológico. Por tudo isso, é importante lembrar que as células tumorais modificam sua expressão ao longo do processo metastático (18). Um paciente com carcinoma metastático médio mostra entre 5-50 CTCs em aproximadamente 7,5 ml de sangue. Um alto número de CTCs está correlacionado com doenças agressivas, aumento de metástases e diminuição do tempo de recaída. Os CTCs podem conter informações valiosas sobre a composição do tumor, invasividade, suscetibilidade a medicamentos e resistência à terapia empregada. Como a alta carga dos CTCs serve como elemento de diagnóstico, eles também podem ser usados ​​como marcadores em tempo real para monitorar a progressão e / ou a sobrevivência da doença. Os CTCs também podem orientar o tratamento terapêutico, determinar a eficácia ou a necessidade de terapia, mesmo na ausência de metástases detectáveis, e fornecer informações sobre os mecanismos de resistência aos medicamentos. Os CTCs são alguns dos marcadores mais importantes de metástase, mas a detecção, quantificação e isolamento dessas células ainda estão sob investigação (19).
A falta de padronização técnica e dados imaturos sobre suas células e moléculas ainda pesam nessa ferramenta promissora. Mas o desenvolvimento tecnológico dos últimos anos permitiu muito progresso nos métodos para isolar as CTCs do sangue. Todas as opções de isolamento disponíveis isolam células da fração hematopoiética de maneira inespecífica junto com os CTCs. É necessário, antes do isolamento, considerar a especificidade e a sensibilidade e os testes que se deseja realizar nos CTCs, como quantificação, caracterização molecular ou estudos funcionais. Com base nas propriedades físicas ou biológicas, os métodos de isolamento utilizados são: imunoisolação, uso de anticorpos específicos que identificam moléculas presentes na superfície celular dos CTCs; propriedades físicas, exclusão por tamanho, densidade, 13 deformabilidade ou ponto dielétrico celular, dadas as diferenças morfológicas entre os CTCs e o restante das células sanguíneas (20). Outro método de isolamento é baseado no enriquecimento positivo e negativo da fração sanguínea obtida. O enriquecimento positivo permite a seleção positiva de CTCs, usa antígenos como EpCAM (expresso em células epiteliais) ou marcadores específicos de órgãos como HER2, EGFR e CEA. Em relação ao enriquecimento negativo, a fração não selecionada é a que interessa ao antígeno mais comumente utilizado é o CD45 (19). Uma tecnologia emergente de imunoafinidade é o CELLSEARCH® System, uma plataforma de diagnóstico de referência para o isolamento e detecção de CTCs através do uso de tecnologia imunomagnética. Ele fornece uma análise precisa e reproduzível que permite detectar CTCs em uma densidade tão baixa quanto CTCs em 7,5 mL de sangue total, com uma especificidade> 99%. O teste CELLSEARCH® System CTC é um exame de sangue simples e prático que ajuda os oncologistas a avaliar o prognóstico de pacientes com câncer de mama metastático, prostático ou colorretal. Sendo o primeiro e único clinicamente validado e aprovado pelo exame de sangue da Food Drug American (FDA) a listar células tumorais circulantes (CTC) que se separam de um tumor primário e viajam pela corrente sanguínea ou sistema linfático para outras partes do corpo (20). Metodologicamente, este sistema utiliza sangue total e baseia o isolamento dos CTCs na expressão EpCAM positiva usando esferas magnéticas. Posteriormente, realiza uma imunofluororescência da fração enriquecida de CTCs para identificar aquelas que são positivas para citoqueratinas e negativas para CD45. O próprio sistema propõe eventos como CTCs em potencial e é o técnico especialista que deve selecionar aqueles que atendem ao critério CTC + (que combina expressão e morfologia do marcador, razão núcleo / citoplasma). O sistema atual do CellSearch define um CTC como um evento que possui um núcleo (DAPI positivo); expressa citoqueratinas (CK8, CK18 e CK19); não expressa CD45 e tem mais de 4 × 4 µm2 de tamanho (21). Os sistemas de isolamento descritos por Pantel et al. (22), estabelecem que é obrigatório que os CTC mantenham sua integridade e sejam viáveis ​​para realizar testes funcionais. As técnicas de isolamento a serem utilizadas não devem estabelecer uma fase de fixação ou produzir estresse celular. Além disso, condições estéreis devem ser usadas se desejamos realizar a cultura in vitro de CTCs. O EPithelial Immuno SPOT (EPISPOT), é um sistema que permite analisar o secretoma de CTCs isolados, que identificou CTCs viáveis ​​através da detecção de KRT-19, MUC1, PSA e FGF-2 secretado (23). Em relação à cultura ex vivo de CTCs, não foram obtidos protocolos que garantam sucesso devido ao baixo número de células isoladas por amostra, porque nem todas são viáveis ​​e à meia-vida celular baixa (2 horas atingindo o máximo de 24 desde a migração do tumor primário) (21). 
O avanço metodológico no BL no isolamento, identificação e análise de CTCs é contínuo. No entanto, os CTCs ainda não são utilizados rotineiramente nas clínicas como marcador prognóstico. Isso se deve ao contraste entre os resultados da conexão entre os CTCs, o prognóstico estabelecido e as características particulares do tumor, e o que é mais importante para a difícil demonstração de sua utilidade como 14 marcadores preditivos e adequados para o diagnóstico complementar. Além disso, os estudos nem sempre foram facilmente comparáveis, o que não permitiu solucionar os problemas que eles apresentam, como a detecção mínima de doença residual (EMR) (24). A necessidade clínica de CTCs no CM inicial (CMP), devido às vantagens oferecidas pelo BL, é uma opção possível da abordagem molecular e fenotípica que contribui para uma melhor compreensão e gerenciamento clínico dos pacientes com CMP, principalmente no campo. de EMR em: vigilância, melhor seleção de medicamentos específicos e resistência adquirida ao tratamento (20, 24). Talvez seja a hipótese de que os CTCs possam ser explorados em todos os estágios da doença CM, desde o diagnóstico até a manifestação da resistência aos medicamentos, através do monitoramento de EMR, recidiva precoce, eficácia do tratamento terapêutico. , surgimento de resistência e direcionamento a medicamentos, fazem dos CTCs fornecidos pelo BL uma ferramenta de tradução para o futuro. 5.1.2 CIRCULANDO ÁCIDOS NUCLEICOS Além dos CTCs, outro componente importante no sangue são os ácidos nucleicos: DNA e RNA. Eles são frequentemente referidos como ácidos nucleicos livres ou fora da célula (18). 5.1.2.1 DNA CIRCULANTE (cfDNA) O CfDNA foi descrito pela primeira vez há mais de 60 anos e foi reconhecido pela primeira vez no sangue de pacientes com câncer na década de 1970, quando altos níveis de DNA foram detectados no soro dos pacientes. com câncer. No entanto, nem todo o cfDNA encontrado no sangue é de origem tumoral e pode vir de células sanguíneas ou outros tecidos. A liberação do DNA pode ser realizada de forma passiva ou ativa, o mecanismo passivo do DNA é medido por mecanismos de apoptose ou necrose e com um tamanho de cfDNA de 150-200 bp, proporcional ao tamanho do DNA dos nucleossomos que aparecem nos processos apoptóticos . O cfDNA é eliminado no fígado, rim e baço, com meia-vida aproximada em circulação de 16 minutos (19). Em indivíduos saudáveis, origina-se principalmente da apoptose das células sanguíneas nucleadas, é encontrada em baixos níveis no plasma sanguíneo e pode aumentar em algumas condições inflamatórias e mesmo após o exercício, e às vezes também são observados altos níveis de cfDNA. em doenças benignas da mama (44, 54). Em pacientes com tumores malignos, eles apresentavam níveis mais altos de cfDNA do que naqueles com tumores benignos e esses níveis são altamente elevados no cfDNA, particularmente em estágiosavançados da doença, com uma faixa de 0 a 65%, em parte devido à redução da atividade da DNAase. No entanto, o cfDNA tumoral é encontrado em uma porcentagem muito baixa (1-0,01%) em relação a todo o cfDNA total (19). O cfDNA tumoral é mais heterogêneo porque deriva de uma combinação de apoptose, necrose e secreção ativa de células cancerígenas em proliferação, CTCs e a rotatividade de células tumorais espalhadas nos tecidos celulares com micrometastástases (35, 54). A heterogeneidade do cfDNA, juntamente com a limitação da biópsia clássica que representa apenas uma pequena região tumoral, permite que o BL seja posicionado, através da repetição da amostragem sanguínea, como um método potencial para rastrear alterações mutacionais no ctDNA. tumor (25. 15 5.1.2.2 A RELAÇÃO ENTRE CTCs E CFDNA A quantidade média de cfDNA em 1 ml de plasma de pacientes com câncer em estágio avançado (17 nano gramas) e a quantidade de DNA contida em uma única célula humana ( 6 gramas de pico), seria necessário mais de 2x103 CTCs liberando seu conteúdo genético nesse volume de plasma, mas como apenas 10 CTCs são detectados em média em 7,5 ml de sangue, grande parte do cDNA de pacientes com câncer tem origem tumor que vai além das células circulantes e pode vir de qualquer célula presente no tumor, o que reafirma seu importante papel como representante da heterogeneidade do tumor. 
Esse fato, juntamente com sua alta concentração no sangue, torna o DNA circulante um melhor biomarcador para o tumor presente na biópsia líquida (19, 25). Na prática clínica de rotina, a presença de uma amplificação é determinada pela análise de uma biópsia de tumor no diagnóstico inicial. No entanto, as amplificações de ctDNA podem ser "adquiridas e perdidas", através da progressão e tratamento do tumor (19), representando um desafio para a MP no desenvolvimento de terapias personalizadas contra o câncer. , é necessário ter métodos confiáveis ​​e precisos para quantificar a fração tumoral do ctDNA, detectando mutações somáticas.Para CM, foram observados altos níveis e maior tamanho molecular do ctDNA (57), o que mostra, de acordo com a pesquisa dos últimos anos que O ctDNA é um biomarcador preciso e dinâmico para pacientes com CM metastático e, além disso, foi recentemente utilizado como uma maneira precisa de prever recaídas em pacientes com CMP (58, 59). 5.1.2.3 RNA CIRCULANTE (cfRNA) Embora menos abundante que o cfDNA, também existe RNA na circulação (cfRNA) que pode ser determinado no soro dos pacientes.Este cfRNA pode estar na forma de RNA mensageiro (mRNA) ou microRNA (miRNA). Por exemplo, é comum encontrar altos níveis de mRNA da transcriptase reversa da telomerase (hTERT) em diferentes tipos de tumores, como câncer de mama ou cólon. Os miRNAs estão presentes em alta concentração de biofluidos, mais que os mRNAs, e também são mais estáveis ​​(25). Antes da análise do miRNA, é necessário usar métodos de isolamento, preferencialmente no soro, que permitam que eles sejam separados das proteínas às quais estão associados. RT-PCR porque tem uma sensibilidade aceitável e requer uma baixa concentração de RNA. Outros métodos de análise que fornecem mais informações sobre miRNAs e atualmente utilizados em pesquisas são os microarrays de expressão, sequenciamento de RNA e nanoString Technologies), que permitem quantificar diretamente os miRNAs em biofluidos (11). 5.1.2.4 LIBERAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS PARA O SANGUE Dependendo de como são liberados, os ácidos nucléicos circulantes podem ser encontrados em diferentes formas, incluindo complexos moleculares ou macromoleculares, ligados às proteínas séricas ou internalizados em vesículas como exossomos ou microvesículas. De um modo geral, os ácidos nucleicos em circulação podem ser liberados passivamente, por células apoptóticas e necróticas, ou ativamente liberados por células vivas (26). 16 A liberação passiva durante mecanismos de morte celular, como necrose ou apoptose, tanto o DNA celular quanto o RNA podem ser liberados na circulação por células mortas ou moribundas. O processo de necrose não é a principal fonte de DNA circulante, embora possa contribuir para seus níveis, pois são observados fragmentos de DNA entre 21-80 kb que coincidem com os fragmentos liberados pela clivagem da cromatina nos nucleossomos, pela ação de dexosiribonuclease ativada por caspase, que é ativada durante a apoptose (27). Os ácidos nucleicos em circulação podem ser ativamente liberados através de vesículas secretadas pelas células vivas, como exossomos e microvesículas (13). 5.1.3 EXOSOMOS Exossomos são vesículas endocíticas, secretadas por vários tipos de células tumorais que contêm ácidos nucléicos de RNA (principalmente mRNA e miRNA), e a presença de DNA de fita simples e dupla, proteínas (citoesquelético, transmembranar e proteínas de choque térmico) e enzimas (GAPDH, ATPase, PGK1). O conteúdo dos exossomos reflete a natureza e a condição das células tumorais originais, e os exossomos são capazes de transferir ácidos nucleicos e proteínas específicas para células receptoras do microambiente tumoral ou em locais distantes específicos. Portanto, alguns tipos de câncer têm utilizado exossomos como ferramenta para transferir o fenótipo maligno para células normais e estabelecer um microambiente local distante e fértil para auxiliar no crescimento e proliferação de células cancerígenas (28). Marcadores foram descritos para a caracterização de exossomos em diferentes tipos de câncer: EpCAM (cólon e ovário), EGFR (cérebro) e HER2 (CM) (11). Antes dos estudos de mRNA e miRNA, após a lise do exossomo, por técnicas genômicas, é necessário isolá-los por processos de ultracentrifugação, que é a técnica convencional. Comercialmente, existem kits que permitem uma metodologia menos complexa, baseada em técnicas de ultrafiltração, exclusão cromatográfica, precipitação e imunoisolação. Estes últimos são utilizados com pequenos volumes de amostra e com o objetivo de isolar populações específicas (13, 28). O desenvolvimento de perfis exossômicos na ausência de biópsias teciduais pode resultar em resultados muito promissores para o diagnóstico precoce da doença e o monitoramento da eficácia da terapia antitumoral (62). Nesse sentido, os exossomos desempenham um papel importante nos diferentes estágios de desenvolvimento do MC, através da transferência horizontal de informações genéticas entre suas células, incluindo a estimulação da angiogênese tumoral, a reorganização do estroma para estabelecer o microambiente tumoral, bem como como promover o crescimento tumoral e a resistência a medicamentos (13). 5.1.4 MICROVESÍLIOS Maior que os exossomos (100-1000 nm), a composição de sua membrana é mais semelhante à da célula da qual eles se originam, de maneira a representar praticamente o perfil proteômico do tumor. As microvesículas emergem das membranas de diferentes tipos de células: células hematopoiéticas, células endoteliais, células-tronco mesenquimais e células cancerígenas. No CM, os macrófagos associados a 17 tumores secretam microvesículas com miRNAs dentro deles, o que estimula a agressividade das células cancerígenas (29). 5.1.5 PLACAS É recente a possibilidade de usar plaquetas sangüíneas alteradas por tumor como biomarcador no BL. As plaquetas estão envolvidas na progressão e disseminação de vários tumores sólidos; além disso, seu RNA indicaria a presença, localização e características moleculares do tumor, o que fornece informações adicionais para o diagnóstico da doença. Nesse sentido, as plaquetas de pacientes com câncer, como CM ou pulmão, são diferentes de indivíduos com doenças inflamatórias e outras doenças além do câncer (30). Em qualquer um dos elementos que compõem a gama de componentes tumorais do sangue, permite uma análise molecular que fornece informações diferentes e complementares (11). (Tabela 3.) 
	“Qual tipo de biópsia é mais vantajosa: tecidual ou líquida?”
 Em resumo, o estudo das células tumorais circulantes CTCs, ctDNA, RNA, o conteúdo de exossomos no sangue dos pacientes tem a capacidade potencial defornecer informações sobre as características de tumores ou metástases geralmente obtidas por patologistas ( Figura 5). Além das informações sobre mutações genômicas e alterações no número de cópias geralmente obtidas de CTCs ou ctDNA, o BL é cada vez mais utilizado para gerar informações sobre o transcriptoma, epigenoma, proteoma e metaboloma (17). Isso permite que esses analitos se tornem uma plataforma clínica e de pesquisa para superar as limitações dos métodos atuais de diagnóstico e monitoramento do paciente com câncer. 2 JUSTIFICAÇÃO A atual prática biossanitária na disciplina de oncologia deve diagnosticar um paciente com a maior exatidão e precisão para adotar a melhor opção terapêutica individual e naquele momento específico. Além disso, os diferentes medicamentos utilizados contra o câncer têm um índice terapêutico muito baixo (razão dose terapêutica / dose tóxica), portanto a precisão deve ser muito alta e, além disso, deve ter continuidade ao longo do tempo. Isso representa um desafio devido à complexidade molecular, celular, tecidual e clínica da doença do câncer; que a enfermagem deve ser atualizada, pois em um futuro próximo será uma das ferramentas de trabalho que devemos conhecer perfeitamente para poder colaborar da melhor maneira em seu diagnóstico e tratamento.A chamada biópsia líquida, conceitualmente, atende a todos esses requisitos. . Portanto, poderia mudar radicalmente a abordagem diagnóstica e terapêutica do câncer, bem como o monitoramento clínico desta doença. Ser capaz de oferecer aos pacientes um atendimento de qualidade, de acordo com cada estágio e estágio em que a doença se encontra. Este trabalho visa conscientizar a enfermagem sobre a importância da pesquisa para o desenvolvimento da profissão e os benefícios da identificação de seu papel. neste campo como enfermeira profissional.
5.4 MONITORANDO A RESPOSTA E ESTABELECENDO OS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ANTECIPADOS Isso pode ser alcançado com até 10 meses de antecedência na progressão radiológica, mas acima de tudo, ser capaz de indicar novos tratamentos ou retratamentos e também permite monitorar a evolução clonal e as respostas a diferentes pressões evolutivas e / ou terapêuticas, por exemplo, de câncer colorretal ou CM (31). 5.5 DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA (EMR) A detecção de EMR representa um problema insolúvel. A detecção de CfDNA pode ser útil, como demonstrado por Tie et al. em pacientes com câncer de cólon e retal nos estágios III e II, onde não há método padronizado e / ou definição ou consenso na população em risco de doença micrometastática, observaram que o percentual de recorrência era 10 vezes maior quando o ctDNA foi detectado após a cirurgia. (31
5.6 Detecção e triagem precoces A última promessa que pode ser cumprida sobre a utilidade da biópsia líquida é a detecção de doenças precoces, muito antes de aparecer clínica ou radiologicamente. Até então, deve-se trabalhar para melhorar a sensibilidade na detecção de ctDNA em pacientes assintomáticos e com tumores em estágios muito precoces (21). 5.7 IMPACTO DA APLICABILIDADE DA BIOPSIA LÍQUIDA EM DIFERENTES TUMORES. A eficácia dessa ferramenta foi demonstrada em diferentes tumores, incluindo câncer de pulmão, colorretal, próstata, melanoma, mama e pancreático, entre outros tumores (32). O câncer de pulmão evoluiu de praticamente uma única doença e um único tratamento para que todos sejam o paradigma da oncologia moderna, com diferentes diagnósticos moleculares que condicionam tratamentos direcionados. Essas estratégias personalizadas requerem tecido recente, que nesta doença é muitas vezes insuficiente em muitos casos; portanto, determinações moleculares baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR) ou no seqüenciamento de nova geração (NGS) no plasma são uma alternativa complementar. Também no câncer de pulmão, a imunoterapia moderna baseada em anticorpos contra o receptor ou ligante PD-L1 explodiu com respostas de 20% a 30% em pacientes não selecionados, o que melhora quando a imuno-histoquímica é realizada, mas continua a ser insuficiente como marcador preditivo. Nessas circunstâncias, as técnicas de biópsia líquida têm grande potencial como possibilidade de detectar a expressão de PD-L1 em ​​CTCs ou glóbulos brancos, embora com a limitação do isolamento desses CTCs, da concordância com o tecido e da repercussão clínica dos os mesmos. Nesse tumor, a carga mutacional do tumor está sendo sugerida como um biomarcador preditivo da imunoterapia, sendo possível realizá-lo no plasma e identificar pacientes que se beneficiariam do atezolizumabe na segunda linha (33). Por sua vez, o câncer colorretal é caracterizado por possuir um perfil genético muito heterogêneo e variável, resultante da constante aquisição de novas mutações ao longo do desenvolvimento do tumor. Dessa forma, a detecção de mutações tumorais por biópsia líquida pode ser de grande ajuda no monitoramento da doença. A análise genética do tumor não é apenas útil para monitorar a doença, mas também para determinar a resposta ao tratamento, como é o caso da terapia anti-EGFR, na qual apenas pacientes com o gene KRAS não mutado respondem (34). No câncer de pâncreas, a biópsia líquida é apresentada como uma tecnologia muito vantajosa, dada a complexidade anatômica do tecido, bem como a dificuldade de acessá-lo. Essa situação implica que um pequeno número de pacientes com câncer de pâncreas sobreviva mais de 5 anos, em parte porque a maioria dos pacientes identifica seu status de tumor quando a doença está em estágio avançado (35). Na detecção de adenocarcinoma ductal pancreático, exames de sangue para detectar mutações no ctDNA, especificamente no gene KRAS, foram combinados com biomarcadores de proteínas que incluem antígeno cancerígeno embrionário (CEA), antígeno de carboidratos 19- 9 (CA19-9) e antígeno de câncer 125 (CA125). A combinação desses marcadores foi determinada como sendo superior a qualquer marcador único empregado. Além disso, a combinação detectou quase dois terços dos cânceres pancreáticos que não apresentavam evidências de metástases à distância no momento da ressecção cirúrgica. Mutações no KRAS plasmáticas foram detectadas em 30% dos pacientes, e cada mutação encontrada no plasma foi idêntica à encontrada posteriormente no tumor primário do paciente, que é 100% de concordância. O uso do KRAS em conjunto com esses quatro biomarcadores de proteínas aumentou a sensibilidade para 64%. Apenas uma das 182 amostras de plasma da coorte controle foi positiva para qualquer um dos biomarcadores de DNA ou proteína (especificidade de 99,5%). 
Essa abordagem de co-utilização de ctDNA e proteínas pode ser útil para a detecção precoce de muitos tipos de câncer (36). Na CM, o desenvolvimento de técnicas sensíveis que detectam mutações e heterogeneidade intertumoral e intratumoral usando uma amostra de sangue é essencial para entender a biologia da CM e fornecer informações moleculares para adaptá-la à terapia individualizada para cada paciente (8). Avanços recentes no sequenciamento de células únicas que permitem a caracterização genômica de genes de acionamento e mutações acionáveis ​​em tumores da mama, juntamente com o desenvolvimento de técnicas minimamente invasivas capazes de avaliar biomarcadores circulantes baseados em sangue e outros fluidos biológicos usando biópsias líquidos (BL), permitindo uma caracterização completa do CM (3, 21). Assim, por meio do BL, o estudo de biomarcadores pode ser de grande ajuda na detecção precoce de casos em que os sintomas não aparecem até que o tumor esteja em estado muito avançado e também em pacientes com alto risco de recidiva. estabelecer em ambos os casos o tratamento sistêmico adequado e a possível resposta ao rádio ou quimioterapia, principalmente quando não houver evidências clínicas e instrumentais (8). Um BL fornece a paisagem genética e as características epigenéticas de todas as lesões cancerígenas e oferece a oportunidade de monitorar sistematicamente a evolução genômica (10). Na clínica, o BL é uma ferramenta para a MP e fornece uma avaliaçãoem tempo real da CM após o diagnóstico e a recidiva, através da análise de mutações genéticas no ctDNA e CTCs, liberadas no sangue periférico do tumor primário e / ou depósitos metastáticos. Portanto, CTCs, ctDNAs e exossomos permitem triagem e detecção precoce do câncer, monitoramento em tempo real da terapia, estratificação e intervenção terapêutica, alvo terapêutico e mecanismo de resistência, risco de recaída metastática (prognóstico) e administração melhorada de medicamentos. com exossomos (19, 21, 37) 
	“Qual o custo da biópsia líquida?”
	“Quem descobriu a biópsia líquida?”	
	“O papel da enfermagem na inovação da biópsia líquida?”
Este trabalho visa conscientizar os enfermeiros sobre a importância da pesquisa para o desenvolvimento da profissão e os benefícios da identificação de seu papel na pesquisa como profissional de enfermagem.
FUTURO PAPEL DE LA ENFERMERÍA EN BL Si tenemos en cuenta todo lo destacado anteriormente a través de la investigación podemos demostrar la evolución en la práctica asistencial, fomentar la autonomía profesional y el papel independiente de enfermería. Consiguiendo que se haga patente en los equipos interdisciplinares y que los usuarios y la sociedad lo perciban. Llegados a este punto cabe destacar la importancia que tiene la continua actualización de conocimientos en la enfermería, para con ello conseguir:  Un mayor empoderamiento de la profesión enfermera.  Garantizar una adecuada gestión e interpretación tanto de la muestra como de los resultados, permitiendo defender unos estándares mínimos de calidad. 23 6 
PAPEL FUTURO DA ENFERMAGEM NO BL Se levarmos em conta tudo o que foi exposto por meio de pesquisas, podemos demonstrar a evolução da prática em saúde, promover a autonomia profissional e o papel independente da enfermagem. Tornar isso evidente nas equipes interdisciplinares e que os usuários e a sociedade percebem. Nesse momento, vale destacar a importância da atualização contínua do conhecimento em enfermagem, a fim de alcançar:  Maior empoderamento da profissão de enfermagem.  Garantir gerenciamento e interpretação adequados da amostra e dos resultados, permitindo a defesa de padrões mínimos de qualidade.
 23 6 CONCLUSÕES • A oncologia de precisão deve oferecer ferramentas que permitam conhecer as características fundamentais e diferenciais do câncer, a ativação contínua de sinais de proliferação, principalmente os relacionados a fatores de crescimento.
 • Biópsia líquida (BL) que potencialmente permite o diagnóstico e a triagem de tumores de maneira não invasiva. 
• O termo biópsia líquida estuda as células tumorais circulantes (CTCs) no sangue dos pacientes, o DNA tumoral circulante (ctDNA), o RNA, o conteúdo dos exossomos e as informações tumorais das plaquetas associadas aos tumores. .
 • O LB pode ser realizado a partir de sangue e outros fluidos corporais: urina, saliva, líquido cefalorraquidiano (LCR) ou derrame pleural. 
• O BL nos permite superar as limitações da biópsia de tecidos, oferecendo possibilidades de identificação de tumores, refletindo a heterogeneidade do tumor em tempo real. 
• O BL permite a triagem e detecção precoce do câncer, monitoramento em tempo real da terapia, estratificação e intervenção terapêutica, alvo terapêutico e mecanismo de resistência, risco de recaída metastática. 
• O BL demonstrou ser eficaz para sua aplicação em diferentes tipos de tumores, incluindo câncer de pulmão, colorretal, próstata, melanoma, mama e pâncreas. 
• O estudo dos genes HER2 e PIK3CA HER2 no CM é viável para uso na prática clínica e pode complementar ou mesmo substituir métodos convencionais
	SANTOS,Marcos; CUSTODIO, Marcelo Graziano; MATSUO, Alisson Leonardo; MONTENEGRO, Giuliana; PEPE, Camila; ASANO, Enzo; ARAUJO, Luiz Henrique.Cost effectiveness analysis of plasma genotyping versus tumor genotyping in detection of advanced non-small-cell lung cancer with epidermal growth factor receptor and T790M mutation under the Brazilian private healthcare system perspective.
	“O que é o câncer?”
	“Como funciona o diagnóstico oncológico?”
	“O que é biópsia líquida e qual a sua importância?”
	“O que são os biomarcadores?”
	“Qual tipo de biópsia é mais vantajosa: tecidual ou líquida?”
	“Qual o custo da biópsia líquida?”
Objetivo: Comparar os custos e efetividade da biópsia líquida versus biópsia tecidual para detecção da mutação T790M no câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) avançado com mutação no receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e que progrediram após o uso de um inibidor do sítio da tirosina cinase associada ao EGFR (EGFR-TKI), sob a perspectiva do sistema suplementar de saúde do Brasil. Métodos: Pacientes com mutação EGFR-T790M pós-EGFR-TKI são elegíveis ao tratamento de segunda linha com um EGFR-TKI de terceira geração (osimertinibe). Para a estimativa dos custos relacionados ao método de diagnóstico de mutação T790M, foi elaborado um modelo de árvore de decisão. A utilização de recursos foi estimada por painel de especialistas e os custos diretos foram estimados utilizando-se bases de dados oficiais. Resultados: A biópsia líquida proporcionou redução de R$ 391 por paciente, devido a uma redução no custo com complicações; evitou que 40,96% dos pacientes passassem por um procedimento invasivo e que 31,95% dos pacientes tivessem algum tipo de complicação. Conclusão: Os dados observados embasam um novo paradigma para o manejo da resistência aos EGFR-TKIs, com genotipagem pelo plasma como primeira opção diagnóstica, o que pode auxiliar na melhor definição do tratamento e reduzir custos ao sistema de saúde suplementar brasileiro.
Comparar os custos e efetividade da biópsia líquida versus biópsia tecidual para detec-ção da mutação T790M no câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) avançado com mutação no receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e que progrediram após o uso de um inibidor do sítio da tirosina cinase associada ao EGFR (EGFR-TKI), sob a perspectiva do sistema suplementar de saúde do Brasil.
A biópsia líquida proporcionou redução de R$ 391 por paciente, devido a uma redução no custo com compli-cações; evitou que 40,96% dos pacientes passassem por um procedimento invasivo e que 31,95% dos pacientes tivessem algum tipo de complicação. Conclusão: Os dados observados embasam um novo paradigma para o manejo da resistência aos EGFR-TKIs, com genotipagem pelo plasma como primeira opção diagnóstica, o que pode auxiliar na melhor definição do tratamento e reduzir custos ao sistema de saúde suplementar brasileiro.
E a genotipagem plasm-ma, comparada à genotipagem tumoral, tem a vantagem inicial de permitir obter informações relevantes para o tratamento subsequente daqueles pacientes para os quais não é possível obter esse material por métodos invasivos. A genotipagem plasmática pode ser realizada através de um procedimento simples e minimamente invasivo, uma punção venosa, pois, embora o tumor possa ser de difícil acesso, as veias são facilmente acessíveis. Além da facilidade de obter a amostra do tumor, as amostras obtidas por punção periférica podem mostrar como o perfil molecular do tumor se desenvolve ao longo do tempo, em resposta a muitos fatores que podem causar interferências no local, incluindo os tratamentos administrados (Friedrich, 2017). Isto pode servir como monitorização in vivo do tratamento terapêutico administrado.
	“Quem descobriu a biópsia líquida?”	
	“O papel da enfermagem na inovação da biópsia líquida?”
	ABRAHAM, Jessy; SINGH, Sunita; JOSHI, Shalaka. Liquid biopsy - emergence of a new era in personalized cancer care. 
	“O que é o câncer?”
Antecedentes Hoje, o câncer continua sendo a principal causa de mortes prematuras em todo o mundo. O tratamento depende da criação de perfil de um pedaço de tecido tumoral biopsiado. No entanto, a facilidade de aquisição da biópsia depende da condição do paciente e da acessibilidade do tumor. No caso de câncer de pulmãode células não pequenas (NSCLC) avançado ou metastático, 31% dos casos não possuem tecido acessível [1]. Da mesma forma, a maioria dos pacientes com câncer de pâncreas progride para doença localmente avançada ou metastática na fase assintomática e até 80% apresenta tardia metástase no diagnóstico [2]. O progresso continua sendo dificultado também por diversas paisagens de tumores e limitações técnicas envolvidas na amostragem de tecido biopsiado. Após a excisão, as amostras de biópsia são fixadas e as seções, semelhantes a um pão, são cortadas e a maioria das camadas é cortada novamente para coloração patológica. Mas os tumores são caracterizados pela heterogeneidade intra-tumoral decorrente da evolução clonal de células tumorais individuais (Fig. 1) [3]. Portanto, a técnica pode falhar na captura de células geneticamente distintas, em evolução recente, que não se encontram na superfície da seção do pão (Fig. 2). Da mesma forma, o tecido primário de pacientes com adenocarcinoma ductal pancreático geralmente está disponível apenas por biópsias de aspiração por agulha fina e há uma grande chance de faltar clones agressivos [4]. Além disso, um protocolo padrão no tratamento do câncer envolve monitoramento periódico da progressão e / ou recorrência do câncer. Como uma biópsia de tecido pode ser dolorosa e cara, a maioria dos pacientes evita uma biópsia repetida. E na maioria dos casos, o médico não sabe onde procurar por metástases. Mesmo técnicas de imagem comumente usadas como ultrassonografia, tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética (RM) [5] não conseguem detectar muitos cânceres em estágio inicial e metástases muito pequenas [6]. Embora os desafios na obtenção de tecido tumoral adequado e as questões de heterogeneidade continuem prejudicando o perfil do tecido, tecnologias minimamente invasivas para capturar o conteúdo genômico do tumor em vários fluidos corporais como sangue, urina, saliva, suor e lágrimas combinadas com ensaios de genotipagem sensíveis, tornaram-se disponíveis. "Biópsia líquida" é o termo cunhado para descrever esses procedimentos de diagnóstico realizados em material derivado de câncer capturado em uma amostra de sangue. Como células cancerígenas que se separam de tumores sólidos circulam no sangue periférico, a análise de sangue de pacientes com câncer mantém a possibilidade de captura e análise molecular de diversos materiais derivados de tumores. Em indivíduos normais e saudáveis, os detritos celulares das células apoptóticas ou necróticas são normalmente fagocitados pela infiltração de macrófagos e eliminados da circulação. No entanto, esse mecanismo de depuração não procede efetivamente nas células derivadas da massa tumoral, levando a um acúmulo de detritos celulares, incluindo o DNA, e sua liberação na circulação [7]. Em geral, os componentes celulares amostraram amostras e seu uso clínico, concentrando-se principalmente naqueles associados ao DNA derivado de amostras de sangue. Abordagens para biópsia líquida O câncer em qualquer estágio pode liberar células tumorais, bem como fragmentos de DNA causador de câncer no sistema sanguíneo e pode dar uma boa indicação de mutações no tumor no momento da amostragem. Quanto mais avançado o câncer, maior a probabilidade de encontrar células tumorais e DNA causador de câncer no sangue. As técnicas de biópsia líquida detectam diferentes biomarcadores sanguíneos, incluindo células tumorais circulantes (CTCs), DNA tumoral circulante (ctDNA), também conhecido como DNA livre de células (cfDNA), RNA circulante (cfRNA) e exossomos. Células tumorais circulantes (CTCs) As CTCs representam células não hematológicas viáveis ​​e intactas, com características malignas que podem ser isoladas do sangue [10]. Já em 1869, Ashworth descreveu CTCs em pacientes com câncer [11] e sua presença na corrente sanguínea foi demonstrada por Engell em 1955 [12]. No entanto, o interesse em CTCs aumentou quando altas contagens de amostras de sangue de pacientes com câncer de mama metastático se correlacionaram com prognóstico ruim e, portanto, mostraram potencial prognóstico. Os CTCs são liberados na corrente sanguínea durante a disseminação metastática do câncer pelo sangue e estão presentes como células ou aglomerados únicos [13]. Eles foram detectados em vários carcinomas metastáticos, incluindo câncer de pulmão [14], mama [15, 16], próstata [17] e colorretal [18], mas são extremamente raros em indivíduos saudáveis ​​e pacientes com doenças não malignas [19]. Mesmo em pacientes com câncer metastático, eles ocorrem em média com uma frequência de 1 em 100 milhões de células e são misturados com aproximadamente 10 milhões de leucócitos e 5 bilhões de eritrócitos por 1 ml de sangue [20]. E, devido à apoptose dos CTCs, que começam logo após a separação do tumor de origem, eles são extremamente frágeis [21]. O sequenciamento de próxima geração (NGS) revelou que os CTCs possuem assinaturas de mutações que se assemelham às assinaturas de seus tumores primários, incluindo mutações controláveis ​​e druggable como APC, KRAS, TP53, ERBB3, FBXW7 e ERBB2 [22]. DNA livre de células (cfDNA) O DNA livre de células circulante (cfDNA) são pequenos fragmentos de DNA encontrados circulando no plasma ou soro, bem como outros fluidos corporais. A presença de cfDNA no plasma sanguíneo foi descoberta em 1948 por Mandel e Metais [23]. Mas foi demonstrado apenas recentemente que o perfil molecular do cfDNA é semelhante ao DNA do tecido tumoral. 
Um grande avanço ocorreu com o avanço das tecnologias NGS para detecção de mutações, que permitiram o seqüenciamento de DNA e RNA muito mais rapidamente e com menos custos do que o sequenciamento Sanger usado anteriormente. Muitos ensaios clínicos estão investigando intensivamente a correlação de mutações no cfDNA com a progressão da doença, especialmente para cânceres de difícil acesso, como NSCLC e câncer de pâncreas [24]. Pacientes com metástases distantes têm um nível significativamente maior de cfDNA em comparação com pacientes sem metástases. O cfDNA total específico da mutação diminui durante o tratamento, mas os níveis aumentam mais tarde em pacientes com recorrência [25, 26]. O cfDNA plasmático geralmente são fragmentos de cerca de ~ 170–500 pb, que se originam principalmente de células apoptóticas [27]. Estudos iniciais, como os realizados por Diaz et al., Sugerem que, quando cfDNA e CTCs estão presentes, os fragmentos de cfDNA superam os CTCs em 50 a 1 [28]. Além disso, uma comparação direta da detecção de mutação no cfDNA vs CTCs mostrou uma maior abundância da mutação no cfDNA do mesmo paciente [29]. Uma vantagem do cfDNA é que eles são relativamente estáveis ​​e podem ser analisados ​​a partir de biofluidos bio-bancários, como plasma congelado. Os vacutainers mais comumente usados ​​para coleta de sangue para isolamento do cfDNA são os tubos Streck Cell-Free DNA BCT® e CellSave e os tubos padrão K2EDTA. Estudos comparando as condições ideais para a coleta de sangue e a temperatura de armazenamento para o cfDNA encontraram abundância e estabilidade semelhantes por até 6 h em todos os tipos de tubos, sem afetar o rendimento [30, 31]. 
Exossomos e RNA circulante As células tumorais liberam ativamente várias espécies de cfRNAs no sangue, incluindo RNAs não codificadores (por exemplo, microRNAs ou miRNA, pequenos RNAs nucleolares, RNAs que interagem com PIWI e RNAs não codificadores longos). Tais espécies são enriquecidas em exossomos e resistem fortemente às RNases. Altos níveis de exossomos são encontrados em vários fluidos corporais de pacientes com câncer [32] e, devido à sua natureza resistente, exossomos e miRNA podem ser isolados de amostras de biofluidos e armazenados por muitos anos no congelador [33]. Sua composição parece refletir a das células parentais e, portanto, fornece um novo tipo de biomarcador para vários cenários de pacientes [34]. Como o cfDNA, o miRNA circulante parece fornecer uma imagem melhor das variações presentes no tumor do que a CTC [35]. Nosúltimos anos, diferentes alterações foram descritas dentro dos exossomos derivados das células NSCLC, espelhando os processos dentro das células tumorais, como mutação no EGFR, translocações ou desregulação do miRNA [36]. Estudos recentes mostraram que os níveis plasmáticos de miRNA se correlacionam significativamente com um tamanho maior do tumor, quimiorresistência e recorrência de tumores [37]. O miRNA-144-3p e o miR-210 são significativamente regulados para cima no plasma e tecidos do carcinoma de células renais de células claras em comparação com plasmas de controle saudáveis ​​ou amostras de urina [38, 39]. Um estudo dos níveis plasmáticos de miR-224 em pacientes com carcinoma hepatocelular constatou que os níveis plasmáticos podiam prever com precisão a presença de pequenos tumores com menos de 18 mm no pré-operatório [37]. Da mesma forma, a superexpressão do miR-21 e sua detecção no plasma contribuíram para a quimio-resistência no carcinoma de células escamosas do esôfago [40]. Porém, nem todo miRNA é supra-regulado em câncer. Os fãs e colegas de trabalho encontraram cinco miRNAs séricos (miR-16-5p, miR-17b-5p, miR-19-3p, miR-20a-5p e miR-92-3p) que foram significativamente desregulados enquanto miR-15b-5p foi significativamente aumentada em NSCLC [41
] Os procedimentos de tratamento também afetam os níveis de miRNA circulante. Após a quimioterapia, os níveis de miR-199b-5p, miR-301b, miR-326, miR-361-5p, miR-625 e miR-655 reduziram no plasma os pacientes com leucemia mielóide aguda, embora fossem abundantes no diagnóstico [42] . Da mesma forma, o miR-375 plasmático pode diferenciar entre pacientes com câncer de próstata e hiperplasia prostática benigna [43]. Extração de informações moleculares O primeiro passo para obter informações valiosas relacionadas ao tratamento do câncer é o isolamento eficiente e a recuperação específica dos CTC circulantes, cfDNA e cfRNA eliminados pelas células tumorais, deixando para trás as moléculas eliminadas pelas células normais. Como muito poucos CTC, cfDNA, exossomos e cfRNA estão circulando no sangue, o passo inicial envolve o enriquecimento ou a purificação desses materiais liberados pelo tumor de outros componentes do sangue, a fim de aumentar a sensibilidade e a especificidade. Eles foram purificados com base em propriedades físicas, incluindo tamanho, densidade e cargas elétricas. Os CTCs também podem ser enriquecidos positiva ou negativamente com base na expressão de anticorpos da superfície celular como EpCAM. A maioria dos autores utiliza o ácido nucléico circulante QIAamp (Qiagen), que utiliza tecnologia baseada em esferas magnéticas para isolar o DNA derivado de tumor no plasma. Uma comparação de três kits populares dos autores Pérez-Barrios e do grupo não encontrou diferenças significativas na recuperação do cfDNA extraído usando o kit do Qiagen ou Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit (Promega), mas o rendimento do cfDNA do MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I Roche) foi significativamente menor [44]. Mas outros descobriram que o rendimento do cfDNA usando o método tradicional fenol / clorofórmio / etanol na presença de glicogênio era melhor do que o isolado na ausência de glicogênio ou por kit comercialmente disponível [45]. Após o isolamento, a análise subsequente inclui hibridização in situ por fluorescência (FISH), microarray, imunofluorescência, sequenciação, citometria de fluxo e RT-PCR. A PCR digital composta por sistemas baseados em gotículas (ddPCR), plataformas microfluídicas para PCR paralela, NGS, BEAMing (miçangas, emulsões, amplificação e magnetismo) e o sistema de mutação refratária à amplificação (Scorpion-ARMS) são técnicas adicionais que podem detectar DNA tumoral raro em circulação seqüências sem a necessidade de referência padrão ou curvas padrão. As abordagens atuais para a detecção de componentes de biópsia líquida a partir do sangue podem ser divididas em três categorias diferentes: métodos direcionados a mutações controláveis ​​druggable específicas ou todas as aberrações possíveis no cfDNA, métodos para isolar e identificar CTCs e métodos para isolar e identificar exossomos, discutidos em detalhe abaixo. Métodos direcionados à mutação druggable e outras aberrações nos estudos de maioria do cfDNA relatam a triagem de mutações que já foram validadas na biópsia de tecido cancerígeno e comparam a concordância de amostras de tecido tumoral e plasma do paciente. A super expressão do receptor do fator de crescimento epidérmico mutado (EGFR ou ErbB1 ou HER1) é um desses principais marcadores observados tanto na biópsia de tecido quanto no cfDNA. As duas mutações mais comuns são as deleções do exão 19 (Del19) e as substituições por missense L858R, resultando na ativação constitutiva do receptor sem ligação ao ligante. A presença dessas mutações são fortes preditores de eficácia para inibidores de tirosina quinase (TKI), como Gefitinib, Afatinib e Erlotinib, ou mAb, como Cetuximab. Portanto, essas mutações no EGFR também são conhecidas como mutações sensíveis ao TKI [46]. Uma mutação pontual que substitui a metionina por treonina na posição de aminoácido 790 (T790 M) produz a maioria dos casos resistentes adquiridos por TKI para inibidores de EGFR de primeira geração e é conhecida como mutação resistente a TKI [47]. Para a detecção de mutações no EGFR, o número máximo de autores utiliza o iniciador e sondas comercialmente disponíveis e a amplificação por PCR em tempo real. No entanto, houve casos de diagnóstico incorreto de mutações no EGFR por testes de rotina de mutações no EGFR [4, 48]. Wu et al. [49] publicaram recentemente um artigo sobre a avaliação da viabilidade da detecção de mutações no EGFR no adenocarcinoma de pulmão. Usando o kit Therascreen EGFR 29 (Qiagen), eles testaram o cfDNA purificado de 3,0 ml de soro ou 4,0 ml de plasma para detectar 29 mutações somáticas no EGFR por PCR em tempo real. Eles encontraram taxas mais altas de detecção de mutações no plasma do que no soro (60,5% e 28,6%, respectivamente). Os pacientes que foram cfDNA + para mutações no EGFR exibiram características associadas a doenças mais avançadas em comparação aos pacientes com cfDNA. O afatinib melhorou significativamente a sobrevida livre de progressão versus quimioterapia em pacientes com mutações comuns de EGFR, sendo o benefício efetivo mais pronunciado em pacientes com tumores positivos para a mutação Del19 vs L858R (8,3-9,7 meses vs 3,3-4,6 meses; P = 0,0009). Karachaliou e colegas [50] encontraram a mutação sérica de EGFR L858R correlacionada com sobrevida global, sobrevida livre de progressão e resposta à terapia com erlotinibe em uma coorte de pacientes com NSCLC inscritos no estudo EURTAC. Para a triagem, eles usaram um PCR em tempo real mediado por 5'-nuclease mediado por ácido nucleico desenvolvido internamente. Yu et al., Desenvolveram um PCR digital multiplex de gotículas de picolitro para avaliação quantitativa de mutações de EGFR no cfDNA derivado de pacientes avançados com NSCLC. Eles descobriram flutuações na abundância de mutantes de EGFR no cfDNA plasmático em série (coletados ao longo de 2 meses) correlacionando-se com as alterações no tamanho do tumor, avaliadas por exames de imagem [51]. Mok e colegas [25] extraíram o cfDNA do sangue e usaram ensaios Cobas 4800 PCR específicos para alelos da Roche Molecular Systems Inc. para detectar mutações no EGFR em pacientes com NSCLC. As coortes do estudo incluíram pacientes randomizados para receber quimioterapia à base de platina mais Erlotinibe seqüencial ou placebo. Os autores consideraram amostras mostrando pelo menos uma mutação ativadora (Del19, L858R, G719x ou L861Q) como positivas para mutações no EGFR. Pacientes com cfDNA específico da mutação EGFR e tratados com Erlotinibe apresentaram um resultado significativamente melhor do que pacientes tratados com placebo [sobrevida livre de progressão-13,1 vs 6,0 meses; P <0,0001], Para a detecção de mutações no EGFR, o número máximo de autores utiliza o iniciador e sondas comercialmente disponíveis e a amplificação por