Manual de Bacteriologia

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FACULDADE MAURÍCIO DE NASSAU 
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA 
 
 
 
 
ADRIELE LEANDRA CAMPOS DA SILVA, ANDREINA DE VASCONCELOS 
CORCINO BALBINO, DANYELE BARBOZA BEZERRA, IRLA CRISTINA NEVES 
SOUZA, MAYLLA KENIA NOGUEIRA XIMENES, SAANE NUNES PEREIRA. 
 
 
 
 
MANUAL PRÁTICO DE BACTERIOLOGIA CLÍNICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
Petrolina - PE 
 
 
2020 
 
 
ADRIELE LEANDRA CAMPOS DA SILVA, ANDREINA DE VASCONCELOS 
CORCINO BALBINO, DANYELE BARBOZA BEZERRA, IRLA CRISTINA NEVES 
SOUZA, MAYLLA KENIA NOGUEIRA XIMENES, SAANE NUNES PEREIRA. 
 
 
 
 
 
 
MANUAL PRÁTICO DE BACTERIOLOGIA CLÍNICA 
 
 
 
 
 
Trabalho apresentado para obtenção de nota 
parcial, referente à 1ª avaliação na disciplina de 
Bacteriologia Clínica. 
Orientadora: Profª. Msc. Ana Cristina 
Albuquerque da Silva. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Petrolina - PE 
2020 
 
 
SUMÁRIO 
 INTRODUÇÃO................................................................................................................................. 5 
1. PROCESSAMENTO INICIAL DE AMOSTRAS................................................................................. 6 
2. MEIOS DE CULTURAS.......................................................................................................................8 
3. TIPOS DE SEMEADURAS...................................................................................................................9 
4. METÓDOS DE COLORAÇÃO............................................................................................................13 
5. IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS................................................................................16 
6. STAPHYLOCOCCUS..........................................................................................................................17 
7. STREPTOCOCCUS............................................................................................................................18 
8. ENTEROCOCCUS.............................................................................................................................19 
9. IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS.........................................................................................20 
REFERÊNCIAS.......................................................................................................................................23 
5 
 
INTRODUÇÃO 
A palavra Microbiologia deriva do grego: mikros “pequeno”, bios “vida”, e 
logos “ciência”. Esta Ciência estuda os organismos microscópicos e suas 
atividades biológicas, isto é, estudam as diversas formas, estruturas, reprodução, 
aspectos bioquímico-fisiológicos, e seu relacionamento entre si e com o 
hospedeiro, podendo ser benéficos e prejudiciais. A Microbiologia trata os 
organismos microscópicos unicelulares, onde todos os processos vitais são 
realizados numa única célula. Á Bacteriologia por sua vez, é um ramo da 
Microbiologia que estuda as bactérias, e aborda os aspectos relativos aos 
procedimentos de coleta, isolamento e identificação de principais espécies 
bacterianas isoladas na rotina, preparo de lâminas, métodos de coloração, 
confecção de meios de cultura, soluções e reagentes utilizados na rotina de um 
laboratório de bacteriologia. É uma área que apresenta os vários tipos de meios 
de cultivos, enfatizando a sua aplicação para o isolamento e identificação dos 
diferentes grupos de bactérias mais comuns em nosso meio, descrevendo os 
aspectos mais importantes no que se referem ao crescimento bacteriano, 
características das colônias, produção de pigmento, e outras características 
apresentadas por diferentes bactérias em cada um desses meios de culturas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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1 PROCESSAMENTO INICIAL DE AMOSTRAS EM BACTERIOLOGIA CLÍNICA 
 
 O processamento inicial de amostras é composto por várias etapas e fases, desde a preparação 
do material para a coleta, quanto aos meios de transporte, conservação, armazenamento, e 
recebimentos da amostra, sendo importante também levar as informações sobre os devidos 
procedimento e cuidados que o paciente deve ter com a amostra antes de leva – lá ao 
laboratório. Inclui também, a pesquisa dos microrganismos que vão ser estudados, como: 
fungos, bactérias, e vários outros microrganismos. Além disso exige uma seleção correta dos 
meios de culturas que iram ser usados de acordo com cada tipo de semeadura. O 
processamento também exige um exame microscópico direto, para à analise dos 
microrganismos. O processamento inicial de amostras tem três fases importantes que devem 
ser seguidas e respeitadas, à fase pré-analítica, fase analítica e a fase pós analítica. E é 
importante ressaltar que, o técnico ou o responsável pelo o laboratório tenha clareza na hora 
da solicitação do exame ao paciente, lembrando também que ele deve ter todos os dados 
clínicos do paciente salvos. 
Alguns eventos também podem comprometer os exames microbiológicos como: 
➢ Uma hipótese mal elaborada; 
➢ Uma informação mal colhida ou incompleta sobre o paciente; 
➢ Uma coleta, conservação e transporte inadequado; 
➢ Falhas técnicas durante o processamento da análise do material; 
➢ Uma má interpretação dos resultados; 
➢ Entrega da amostra fora do prazo. 
 
Fase pré-analítica 
 
 
A fase pré-analítica compreende a preparação do paciente, a anamnésia, a coleta e o 
armazenamento de amostras, ou seja, é a etapa laboratorial que antecede o processamento dos 
analitos, a obtenção de amostras no laboratório de microbiologia, assim como as boas práticas 
laboratoriais nos processos analíticos e pós-analíticos, são fundamentais para a acurácia dos 
diagnósticos microbiológicos. Alguns aspectos são fundamentais na fase pré-analítica como: 
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➢ A escolha do teste microbiológico mais adequado, a determinação do melhor sítio 
(evitando ao máximo a contaminação por agentes da microbiota residente) e a escolha 
do melhor momento clínico para a obtenção da amostra; 
➢ A escolha do melhor método de coleta e meio de transporte especifico; 
➢ A coleta deve sempre ser realizada previamente à introdução de terapia 
antimicrobiana ou de sua modificação; 
➢ O volume da amostra deve ser suficiente para a execução dos diversos procedimentos 
solicitados, amostras insuficientes podem levar a resultados falso-negativos; 
➢ Informar claramente ao paciente os procedimentos necessários para à coleta da 
amostra; 
➢ Todas as informações sobre coleta, técnicas de assepsia e transporte de amostras 
devem ser disponibilizadas pelos próprios laboratórios; 
➢ É fundamental que sejam usados frascos estéreis, com ou sem meio de transporte 
tampados, para evitar contaminação e vazamento; 
➢ A identificação correta da amostra, e o seu sítio de origem e a suspeita clínica são 
informações que devem constar na requisição, para que o microbiologista possa 
executar os procedimentos recomendados e utilizar os meios de cultura corretos; 
➢ A identificação do frasco de coleta, nunca deve estar na tampa ou sobre rótulos; 
➢ Rapidez no transporte das amostras; 
➢ Toda amostra clínica é potencialmente infectante e deve ser manuseada com cuidado, 
utilizando-se equipamento de proteção individual (EPI) preconizados. 
 
 
 
 
Fase analítica 
Na fase analítica é realizada à análise do material 
coletado na fase pré-analítica, São diversos os 
processos envolvidos nessa fase na dependência do 
método analítico empregando envolvimento de 
pessoas sobretudo, o emprego dos métodos de 
controle é para garantir os resultados, A fase 
analítica envolve tais processos como: 
➢ A verificação de instrumentos e reagentes; 
➢ A verificação do estado de controle dos 
sistemas; 
➢ A monitoração dos processos de análises; 
➢ A manutenção de soroteca. 
 
 
 
 
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Fase pós-analítica 
 
Após a coleta do material e análise dos dados, o 
exame laboratorial passa pela ultima etapa, à pós-analítica, nela há o envio e interpretação dos 
resultados e consequentemente o diagnóstico e 
tratamento. A fase pós-analítica se materializa no 
laudo do exame. 
 
Fazem parte dessa fase as seguintes etapas: 
➢ O preparo do laudo dos exames; 
➢ A impressão, ou transmissão do laudo; 
➢ O recebimento do laudo; 
➢ A tomada de decisão. 
 
 
 
 
 
 
2. MEIOS DE CULTURAS 
 
 
Os meios de culturas são substâncias, formuladas de maneira adequadas capazes de promover 
o crescimento bacteriano em condições de laboratórios. Os meios de culturas que são 
utilizados em microbiologia podem ser de vários tipos, sendo classificados como: meios 
sólidos, meios líquidos, meios de transporte, meios não seletivos, meios seletivos, meios 
diferencias. Alguns dos meios mais utilizados na microbiologia são os: 
➢ Agar sangue que é um meio não seletivo que não possibilita o crescimento de 
diversos grupos microbianos, além de permitir verificar a presença de hemólise. 
➢ Agar chocolate que também é um meio não seletivo que possibilita além do que se 
obtém, com o uso do Agar do sangue, ele isola cepas de Haemophilus e de Neisseria. 
➢ Agar MacConkey que é um meio seletivo usado para o isolamento de bacilos Gram 
negativos e para verificar a capacidade de fermentação da lactose. 
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➢ Agar SS que é um meio seletivo diferencial usado para o isolamento da Salmonella e 
Shigell. 
➢ Agar Trayer-Martin que é também um meio seletivo usado para o isolamento de 
cepas de Neisseria gonorrhoeae. 
 
 
 EXPLICANDO MELHOR OS TIPOS DE MEIOS UTILIZADOS EM CULTURAS 
MICROBIOLOGICAS: 
 
➢ Meios sólidos: eles geralmente são utilizados para obter colônias isoladas, como o Agar 
sangue e o Agar MacConkey. 
➢ Meios líquidos: esses são geralmente usados para facilitar o desenvolvimento 
microbiano, Mas sem propiciar a obtenção de colônias isoladas, como o caldo 
tioglicolato ou o caldo tripticase soja. 
➢ Meios de transporte: são os que servem apenas para a manutenção da viabilidade das 
bactérias entre a coleta de material e a semeadura nos meios adequados. Exemplos: meio 
de Stuart (secreções) e meio de Cary-Blair (fezes). 
➢ Meios não seletivos: são aqueles meios com suplementos que facilitam o crescimento 
microbiano, como o Agar sangue e o Agar chocolate. 
➢ Meios seletivos: são meios que contêm substâncias inibidoras do crescimento de alguns 
grupos de bactérias, como o Agar MacConkey que inibe o crescimento de cocos Gram 
positivos, sendo útil para o crescimento de bacilos Gram negativos. 
➢ Meios diferenciais: são os meios usados como prova bioquímica, ou, seja para avaliar 
se o microrganismo possui uma enzima responsável por uma determinada via de 
atividade metabólica. Exemplo: Agar DNAse para verificar se a bactéria possui a 
enzima desoxirribonuclease, que degrada o DNA. 
➢ Meio base: eles geralmente são meios utilizados como base à qual adicionamos 
suplementos para obtermos um produto como o Agar sangue, em que podemos usar 
como meio base o Agar tripticase soja ou o Agar Columbia. 
 
 
 
3. TIPOS DE SEMEADURAS 
As técnicas de semeadura em laboratório consistem em métodos pelo qual se transfere pequenas 
quantidades de microrganismos para um meio de cultura em que o material a ser analisado será 
semeado, ou seja: é preparado um ambiente ideal para que determinado microrganismo presente 
na amostra cresça e se desenvolva para análise que será feita. 
 
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➢ Semeadura por estria 
Transfere-se uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça 
bacteriológica sobre o meio. A estria pode ser realizada em movimento de zig-zag (estria 
sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio (estria reta). Essa técnica é muito utilizada 
para a visualização de determinadas propriedades metabólicas, como a produção de 
enzimas hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio - gema de ovo, sangue...), e 
produção de pigmentos. 
 
 
 
 
 
 
➢ Semeadura por Esgotamento 
Essa técnica é utilizada para obtenção 
de colônias isoladas em meio sólido. A técnica visa obter colônias isoladas de 
bactérias presentes em materiais biológicos, permitindo a diferenciação de diferentes 
bactérias. Essa técnica tem o objetivo de quantificar as umidades formadoras de colônias. A 
amostra deve ser coletada com um swab, e colocada em um tubo estéril, contendo solução 
salina, em seguida na câmara laminar faz-me o semeio na placa de Petri e leva a mesma para a 
estufa a 37°C. 
 
 
 
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➢ Semeadura por Espalhamento 
Nessa técnica, após diluição adequada da amostra, são espalhados à superfície do meio sólido, 
0.1 ml da amostra, com o auxílio de uma vareta de vidro em L, previamente esterilizada. Em 
seguida as placas são incubadas, em posição invertida em atmosfera e temperatura adequadas, 
até ao aparecimento de colónias. A observação das colónias obtidas permite avaliar o grau de 
pureza de uma dada cultura. A presença de mais de um tipo de colónias na mesma placa indica 
que a cultura original não estava pura, ou seja, que estava contaminada com outro 
microrganismo. 
 
 
➢ Semeadura em Tapete 
Essa técnica permite obter uma camada homogênea de crescimento bacteriano, por semeadura 
de uma suspensão bacteriana em uma placa de Petri contendo o meio nutriente sólido adequado. 
A técnica se aplica também a algas e leveduras. Geralmente é utilizada para evidenciar a ação 
germicida de alguma substância. Para a forma de semeio, deve-se ter cuidado para rerfurar o 
ágar, colocar na superfície do meio uma alça ou uma gota da suspensão. Este material é o 
inóculo inicial, em seguida espalhar o inóculo inicial em linhas muito juntas, de modo a cobrir 
toda a superfície do meio. Será necessário virar a placa várias vezes para alcançar toda a 
superfície sem perfurar o ágar nutriente. 
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➢ Semeadura Quantitativa 
A técnica consiste em distribuir o material coletado por toda a placa, estriando 
continuamente até o final da placa a fim de realizar a contagem e análise macroscópicas 
das colônias. A realização da técnica é feita atrás da chama, para que a amostra 
permaneça estéril. Com um swab contendo a amostra coletada, estria-se o mesmo 
continuamente até o final da placa com ágar. 
 
 
 
➢ Semeadura em profundidade 
 
Com uma alça em agulhão, escolher uma única colônia, introduz no 
tubo com meio de cultura, fazendo uma estria no ápice. 
Essa técnica é utilizada para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas. 
 
 
 
 
➢ A técnica de semeadura por profundidade (Pour Plate), pode ser realizada com o 
objetivo de realizar a contagem de colônias em placa(estudo quantitativo). O inoculo é 
adicionado ao fundo da placa estéril, e em seguida o meio de cultura é vertido sobre a 
mesma. Movimentos rotacionais são feitos para favorecer a difusão da amostra e 
consequentemente a homogeneização nutriente. 
 
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4. METODOS DE COLORAÇÂO 
Existem tipos de amostras que já recebem coloração diretamente por exemplo em swabs, 
aspiração, fragmentos de biopsias, em secreções entre outros. As colorações tem uma grande 
importância pois são extremamente eficientes em resultados rápidos. Dentro do laboratório de 
microbiologia as técnicas de coloração mais empregadas são as colorações de Gram- 
Kopeloff-Beerman e a Ziehl-Neelsen. 
➢ COLORAÇAO DE GRAN KOPELOFF-BEERMAN: 
Classificam as bactérias de acordo com suas características morfológicas e tintoriais. É um teste 
muito eficiente para se obter um resultado instantâneo se a presença de algum agente for 
infeccioso. O resultado tem total relação com a parede celular das bactérias. As bactérias Gram-
positivas possuem uma parede espessa de peptideoglicano com grande descoloração com álcool 
absoluto, no final do processo de coloração elas apresentam uma coloração azul/roxa. Já as 
gram-negativas possuem uma parede menor de peptideoglicano, uma camada fina, que por 
conseqüência permite a descoloraçãodo corante inicial com o álcool absoluto e 
posteriormente coloração com a fucsina. No final desse processo, as gram-negativas apresentam 
se com tons de rosa avermelhado. 
PROCESSOS DE PREPARAÇAO PARA A COLORAÇÃO 
O preparo do esfregaço é muito importante e deve ser executado com muito cuidado e 
atenção. 
 
➢ Amostras com swab 
Vem geralmente com swab duplo, um para esfregaço e outro para cultura. Deve se passar 
suavemente o swab sobre a superfície da lâmina, caso seja apenas um swab, deve ser feito a 
suspensão, e prepará-lo para o esfregaço. Deixar secar perto da chama do bico de bunsen e 
depois fixar no calor passando a lâmina algumas vezes rapidamente na chama. 
 
➢ Amostras de centrifugação 
Centrifugar a amostra (2000 a 5000 RPM / por 15 min.), depois remover o sobrenadante, deixar 
aproximadamente 0,5 ml do sedimento, homogênese, depois com uma alça estéril, faça o 
esfregaço. Deixe secar próximo ao bico de Bunsen, e depois fixar a amostra da lâmina no calor. 
 
 
➢ Amostra de aspirador, exsudatos escarro e fezes 
Amostras coletadas em frascos ou tubos, deve se pegar a parte mais purulenta para realizar 
o esfregaço. Nas amostras de escarro e utilizado um palito estéril para pegar parte para 
realizar o esfregaço. Caso seja uma amostra na seringa, deve se transferir para um tubo, e 
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homogeneizar, fazer o esfregaço e realizar a semeadura em isolamento. Deixe secar e depois 
fixar no calor como explicado anteriormente nos outros processos. 
 
➢ Amostras de tecidos de biópsias 
Primeiramente colocar a amostra numa placa de Petri, fragmentar o tecido com uma pinça ou 
um bisturi. Retirar uma parte da amostra e passar várias vezes a uma área da lâmina. Deixar 
secar logo em seguida fixar no calor. 
➢ Amostra de urina 
Urina de jato médio- Homogeneizar a urina e depois colocar com a ajuda de uma alça 
calibrada numa lâmina limpa, espalhar, se necessário colocar mais. Deixar secar próximo 
ao bico de Bunsen e fixar rapidamente no calor da chama. 
➢ Esfregaço de colônias bacterianas em meio solido 
Adicione uma pequena gota de solução fisiológica sobre a Lâmina. Com uma alça toque na 
colônia e depois a dissolva suavemente na gota de solução colocada na lâmina, fazendo 
movimentos circulares até o liquido começar a secar. Deixe secar e depois fixe no calor. 
➢ Esfregaços de meios líquidos 
Hemocultura- Primeiramente homogeneíze o frasco e retire uma quantidade da amostra e 
coloque sobre a lâmina, espalhe com uma alça, deixe secar e depois fixe no calor da chama. 
REALIZANDO A COLORAÇÃO 
Após realizar todas as etapas do esfregaço de acordo com cada tipo de amostra, o próximo passo 
e a coloração de GRAM. 
1. Cubra o esfregaço com cristal violeta e deixe agir por 1 minuto. 
2. Lave com água corrente para retirar o excesso de corante. 
3. Cubra o esfregaço com lugol e deixe agir por 1 minuto. 
4. lave com água corrente. 
5. realize a descoloração da lâmina com álcool absoluto até que não escorra mais o cristal violeta 
(cuidado para não descorar demais, normalmente, 15 a 20 segundos são suficientes). 
6. lave com água corrente. 
7. cubra o esfregaço com fucsina e deixe agir por 40 segundos. 
8. lave com água corrente e seque ao ar ou com papel-filtro. 
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9. leve e examine no microscópio. Utilize primeiro a objetiva de 10x para fazer uma análise 
geral do esfregaço. Observando assim a qualidade da coloração, espessura do esfregaço o local 
onde as bactérias estão mais concentradas, presença de fungos etc. 
10. Examine o esfregaço agora com a objetiva de 100x (óleo de imersão). Descreva as 
características morfológicas, do arranjo e coloração. 
 
COLORAÇAO DE ZIEHL-NEELSEN 
A coloração de Ziehl-Neelsene utilizada geralmente para detecção de microbactérias, a parede 
celular é constituída por ácidos micolico e resistentes a descoloração com o álcool , preservando 
a coloração inicial, fucsina é concentrada . Os bacilos tem uma coloração vermelha no final de 
todo o processo. No entanto essa coloração e um método mais rápido para detecção de 
microbactérias em analises de amostras com suspeita de tuberculose ou hanseníase. Essa 
analise pode ser fita em amostras de escarro, lavado brônquio, gástrico, biopsias, secreções 
entre outros. A amostra mais utilizada para realizar esse tipo de análise/esfregaço é o escarro. 
O diagnóstico é feito através de duas amostras a primeira sendo coletada no momento da 
consulta e, a segunda, no dia seguinte, assim que acordar. A coleta deve ser feita em frasco de 
boca larga, descartável, estéril, transparente e com tampa de rosca. As amostras devem ser 
transportadas sob refrigeração e não deve derramar. 
 
PREPARAÇAO DO ESFREGAÇO 
O esfregaço deve ser feito seguindo normas de biossegurança, de preferência em cabines de 
segurança biológica classe A1 e A2. Na falta da cabine, o local para o processamento do 
esfregaço deve ser isolado; lembrando que o bico de Bunsen deverá permanecer ligado em todo 
o processo. 
1.Pegue um palito, quebre ao meio, com as pontas onde ficam as farpas e colete nas partes mais 
purulentas do escarro, logo em seguida colocar de forma homogênea sobre a lâmina, não deve 
deixar espaços vazios. 
2.esperar a lâmina secar em temperatura ambiente, mas próximo ao bico de Bunsen; fixar o 
esfregaço passando na chama a lâmina de 3 a 5 vezes. 
 
REALIZANDO A COLORAÇÂO: 
1.Cobrir o esfregaço com fucsina de Ziehl. 
2.Aqueça a parte inferior da lâmina utilizando um chumaço de algodão fixado na ponta de uma 
vareta e embebido em álcool, até a emissão de vapores por uns 5 minutos. Depois lave com 
água corrente. 
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3.Cobrir o esfregaço com álcool – ácido e deixe por 1 minuto. Lavar com água corrente. 
4.Cobrir o esfregaço com azul de metileno, deixe agir por 2 minutos. Lavar com água corrente. 
5.Deixar secar ao ar livre. 
6.Examinar a lâmina no microscópio na objetiva de 100x(imersão), seguindo as orientações 
recomendadas pelo ministério da saúde para classificação do número de cruzes (+,++,+++ ou 
++++). 
 
 
5. IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS 
Os estafilococos são cocos gram-positivos, podendo se apresentar isolados ou aos pares, em 
cadeias curtas ou agrupados. Estão amplamente distribuídos na natureza e podem ser isolados 
de ambientes ou com os habitantes comensais de pele, mucosas e outros sítios corpóreos dos 
seres s humanos e animais. Possuem em seu aspecto macroscópico da colônia em meio sólido 
e a presença de pigmento e hemólise em ágar, são características auxiliares na identificação 
destes microrganismos. As bactérias gram-positivas são aquelas distinguidas coradas na cor 
azul ou violeta na coloração de Gram, em contraste com as bactérias Gram negativas, que não 
tem a capacidade de reter o corante cristal violeta, apresentando uma coloração vermelha ou 
rosa. Os microrganismos Gram positivos possuem a capacidade de reter o corante cristal violeta 
devido a quantidade de peptídioglicana na parede celular. As bactérias gram-positivas e gram-
negativas têm a coloração diferente por que suas paredes celulares são diferentes e causam 
diferentes tipos de infecções. 
Os cocos Gram positivos de importância médica estão classificados em: 
➢ Staphylococcus; 
➢ Estreptococos; 
➢ Enterococcus; 
Características presentes em microrganismos Gram positivos: 
 A presença de ácido tecóico e lipoíco, formando ácidos lipoteicos, que agem como agentes 
quelantes e capazes de aderência celular. Além disso, as bactérias Gram positivas, 
especialmente os cocos, estão entre os microrganismo mais frequentes e isolados de amostras 
biológicas humanas em laboratórios. Eles produzem uma variedade de doenças, incluindo 
foliculite, furúnculo, carbúnculo, erisipela e celulite, além de pneumonia e bacteremia. Embora 
as bactérias gram-positivas possam causar infecções por multiplicação local e sistêmica, 
algumas delas podem multiplicar-se em sítio localizado e exerce ação patogênica por produçãode exotoxinas ou enzimas que atuam a distância. 
6. STAPHYLOCOCCUS 
Os Staphylococcus são cocos Gram e catalase-positivos, com aproximadamente 0,5 a 1,5 µm 
de diâmetro, imóveis, não-esporulados e geralmente não-encapsulados. Essa bactéria pode 
apresentar-se em diversas formas, que vão desde isolados, aos pares, em cadeias curtas, ou 
agrupados irregularmente (com aspecto semelhante a um cacho de uvas), devido à sua divisão 
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celular, que ocorre em três planos perpendiculares, são bactérias que fazem parte da 
microbiota humana, mas que pode provocar doenças que vão desde uma infecção simples, 
como espinhas e furúnculos, até as mais graves, como pneumonia, meningite, endocardite, 
síndrome do choque tóxico e septicemia, entre outras. O gênero Staphylococcus pertence à 
família Micrococcae, juntamente como os gêneros Planococcus, Micrococcus e 
Stomatococcus. Atualmente, o gênero Staphylococcus possui 33 espécies, sendo que 17 delas 
podem ser isoladas de amostras biológicas humanas. As colorações dessas colônias variam 
desde o acinzentado até o amarelo-ouro, em que a pigmentação aumenta com o tempo de 
incubação prolongado, não chegando a ser formada nos casos de crescimento em condições 
anaeróbicas, ou na cultura em caldo. Em placas de ágar sangue, um halo de hemólise 
desenvolve-se em torno das colônias formadas. Outro meio importante para a identificação do 
Staphylococcus é o ágar manitol-sal, seletivo para essa espécie, uma vez que os Staphylococcus 
conseguem fermentar o manitol, produzindo ácido lático. 
Existem cerca de 31 espécies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, das quais os mais 
frequentes são: 
➢ Staphylococcus epidermidis - causador de infecções de cateteres e próteses e o mais 
freqüente microrganismo encontrado em hemoculturas. 
➢ Staphylococcus saprophyticus - causador de infecção urinária em mulheres jovens. 
➢ Staphylococcus haemolyticus - importante devido à resistência aumentada aos 
antimicrobianos, e por ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemólise 
na placa de ágar sangue de carneiro. 
 
TESTES PARA IDENTIFCAR OS STAPHYLOCOCCUS 
 
➢ TESTE DA COAGULASE EM LÂMINA 
A maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada (ou fator aglutinante) 
“clumping factor” na superfície da parede celular, que reage com o fibrinogênio do 
plasma causando a coagulação do mesmo. 
1. Colocar 2 gotas de salina em uma lâmina; 
2. Emulsionar uma colônia isolada a ser testada; 
3. Colocar uma gota de plasma e misturar com um palito de plástico ou madeira; 
4. Observar se há aglutinação em 10 segundos; 
5. Não se pode executar este teste a partir de um ágar com grande concentração de sal 
como ágar manitol. 
 
➢ TESTE DA COAGULASE EM TUBO 
Este teste baseia-se na presença da coagulase livre que reage com um fator plasmático 
formando um complexo que atua sobre o fibrinogênio formando a fibrina. O teste é 
melhor efetuado se: 
1. Adicionar 0,1 ml de caldo BHI, incubado por uma noite, com colônia suspeita 
a um tubo de ensaio com 0,5 ml de plasma; 
2. Incubar por 4 horas à 35°C em estufa ou banho maria; 
3. A formação do coágulo é observada pela inclinação suave do tubo de ensaio a 
90 graus da vertical. 
Um método alternativo é a emulsificação desta mesma colônia suspeita em um 0,5 
plasma e incubado da mesma forma. Qualquer coágulo indica uma prova positiva, 
porém não confundir com precipitados ou floculação. O melhor plasma a ser usado é o 
de coelho com EDTA, não devendo ser usado o plasma humano vindo do banco de 
sangue. 
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➢ TESTE DA DNASE 
Este teste consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA, (DNAse test 
agar) obtido comercialmente. 
1. Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentração de 0,1%; o 
meio adquire uma coloração azul intensa; 
2. Incubar a 35°C por 24 horas; 
Uma coloração rósea característica ao redor das colônias produtoras de DNAse indica a 
positividade da prova.O meio adicionado com corante demonstra uma melhor facilidade 
na leitura, e permite o repique da amostra positiva para o teste de sensibilidade aos 
antimicrobianos, evitando que se retorne à placa original onde nem sempre as colônias 
estão bem isoladas. 
 
➢ TESTE DA ENDONUCLEASE 
Teste da endonuclease termoestável é efetuado no mesmo meio de DNA. 
1. Fever o caldo de cultura com a bactéria suspeita por 15 minutos; 
2. Colocar ao meio de DNA gotas de caldo de cultura turvo com a colônia suspeita; 
3. Fazer pequenos orifícios no meio (em placa) utilizando canudos de refrigerante; 
4. A leitura do teste é semelhante ao da DNAse. 
 
7.ESTREPTOCOCCUS 
Os estreptococcus podem ser encontradas no organismo, não causando qualquer tipo de doença. 
No entanto, devido a alguma condição, pode haver desequilíbrio entre as várias espécies de 
microrganismos presentes no corpo e, consequentemente, este tipo de bactéria consegue se 
multiplicar mais facilmente, causando diferentes tipos de doenças. Os estreptococos foram os 
maiores causadores de infecção hospitalar na era pré-antibiótica, causando surtos de infecção e 
morte de puérperas. Apesar de não serem atualmente uma importante causa de infecção 
hospitalar, provocam, no entanto, doenças muito graves e muitas vezes letais, mesmo em 
pacientes imunocompetentes, sendo importante o rápido diagnóstico deste agente. Os 
estreptococos podem ser diferenciados de acordo com sua aparência na placa de ágar sangue 
após incubação a 35°C em presença de 5% de CO2, podendo apresentar: hemólise total (beta), 
parcial (alfa, de cor esverdeada) ou nenhuma (gama). 
TESTES PARA IDENTIFICAR OS ESTREPTOCOCCUS 
➢ TESTE DA BACITRACINA 
É importante notar que as identificações devem ser feitas em ágar sangue sem tensão de CO2 
ou os resultados podem ser conflitantes. 
1. Semear meia placa de ágar sangue com o estreptococo a ser identificado, como 
para um antibiograma; 
2. Colocar o disco de bacitracina 0,004 u como indicado; 
3. Incubar por uma noite a 35ºC sem CO2; 
4. Observar qualquer zona de inibição como resultado de sensibilidade. 
 
 
➢ TESTE DO SULFAMETOXAZOL TRIMETOPRIM (SXT) 
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1. Adicionar na mesma placa de ágar sangue o disco de SXT; 
2. Incubar por uma noite a 35°C sem CO2. 
3. Colocar um disco de Bacitracina 0,004 UI à direita e um de Sulfametoxazol-trimetoprim 
à esquerda. 
4. Havendo necessidade, pode ser feito o teste de CAMP na mesma placa, conforme 
desenho abaixo. 
 
➢ TESTE DE CAMP (NA MESMA PLACA) 
 
1. Inocular uma estria única de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta 
lisina (ATCC 25923) no centro de uma placa de ágar sangue preparada obrigatoriamente 
com sangue de carneiro. (Esta linhagem de S. aureus deve ser mantida continuadamente 
em estoque) 
2. Inocular as amostras a serem testadas em estrias formando um ângulo reto com a linha 
de inoculação da amostra teste de estafilococo. As estrias não devem se tocar, ficando 
a 1 mm de distância, e deste modo várias amostras podem ser testadas em uma mesma 
placa de ágar sangue. A maneira de inocular é fundamental para a observação do efeito 
esperado. 
3. Incubar a placa a 35-37°C durante um período de 18-24 horas. 
4. A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), é evidenciada pelo 
alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha característica, na 
área de intersecção entre as duas estrias. 
 
8.ENTEROCOCCUS 
Os micro-organismos do gênero Enterococcus são cocos Gram-positivos e apresentam necessidades 
nutricionais variáveis e o crescimento pode requerer meios complexos, contendo soro ou sangue. A 
temperatura ótima de crescimento é de 35ºC, porém, a maioria das amostras tolera temperaturas que 
variam de 10ºC a 45ºC. São distribuídos em ambientes diversos. Nos seres humanos fazem parte da 
microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato geniturinário. Estes microrganismospodem tolerar temperaturas equivalentes a 60ºC por até 30 minutos e são capazes de crescer em meios 
contendo cloreto de sódio a 6,5% (11). A importância de se identificar corretamente o gênero 
Enterococcus é devido, principalmente, à resistência natural a Vancomicina desses gêneros 
fenotípicamente similares como Leuconostoc spp, Pediococcus spp, Lactobacillus spp, 
Erisipelothrix rhusiopathiae e alguns Corynebacterium spp. 
 
 
 
 
 
20 
 
TESTE PARA IDENTIFICAR ENTEROCOCCUS 
Catalase 
 
PRINCÍPIO 
A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e 
oxigênio, serve para Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, 
Corynebacterium, Micrococcus, Bacillus, Moraxella catarrhalis. 
 
INOCULAÇÃO 
 
1. Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3% sobre uma lâmina 
em um tubo; 
2. Com auxílio de fio bacteriológico, agregar a colônia em estudo na gota de peróxido de 
hidrogênio. 
 
 
 
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
➢ Positivo: Presença imediata de bolhas - a produção de efervescência indica a 
conversão do H2O2 em água e oxigênio gasoso. 
➢ Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência. 
 
9. IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS 
As enterobactérias são compostas por um grande número de bacilos e cocobacilos do tipo 
Gram negativo, que com frequência são encontrados nos laboratórios clínicos não 
resistem a luz solar, dessecações pasteurizadas e desinfetante comuns, são anaeróbicos 
facultativo, fermentadores da glicose com ou sem produção de gás, catalase positivos, 
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reduzem o nitrato a nitrito e são oxidase negativos, formando vários tipos de produtos 
finais. Podem ser cultivadas em vários meios de cultura. Elas crescem em meios como o 
ágar sague, ágar chocolate e ágar cled, elas não crescem em meios seletivos para Gram 
positivo como, ágar manitol salgado, ágar sangue acrescido de azida. As características 
morfológicas que as colônias apresentam em ágar Mac Conkey, ágar EMB e ágar CLED, 
são importantes para a identificação inicial. Estas características se tornam mais evidentes 
com 48 horas de incubação. 
 
 
 
TESTES PARA IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS 
➢ Teste de produção de Indol: Ele permite qualificar este tipo de bactéria segundo a sua 
capacidade de utilizar o aminoácido triptofano como fonte de carbono ou energia. Esse 
teste é feito da seguinte forma: 
1. Precisa de uma alça estéril, 
2. Inocular cada uma das enterobactérias em meio de triptona 1,5%, é preciso incubar 
as culturas em 37c, durante 48horas. 
3. Depois adiciona 0,5 ml de reagente de kvac ao meio de cultura, 
4. Depois agita suavemente. 
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
➢ Se o resultado for positivo fica vermelho. 
➢ Se o resultado for negativo não altera muito sua cor. 
 
 
➢ Teste do Vermelho de Metil 
 Esse teste é usado para detectar as enterobactérias que utilizam a fermentação a ácidos mistos. 
Esse teste é feito da seguinte forma: 
1. Com uma alça estéril, inocular cada uma das enterobactérias em meio MR-VP. 
2. Depois incubar as culturas a 37° C, durante 48 h. 
3. Logo após retirar cuidadosamente 1 ml da cultura para um tubo de ensaio. 
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4. Depois disso tudo feito adicionar, à restante cultura, 5 gotas da solução de vermelho de 
metil. 
5. Agitar muito suavemente 
INTERPRETAÇÃOS DOS RESULTADOS 
➢ Resultado positivo - desenvolvimento de cor vermelha. 
➢ Resultado negativo - a cultura adquire cor amarela ou laranja. 
 
➢ Teste de Voges-Proskauer 
Permite identificar as enterobactérias que utilizam a fermentação a butanodiol.É feito da 
seguinte forma: 
1. Primeiro adiciona 1ml a cada um dos tubos 0,6ml de a-naftol a 5% em entenol absoluto 
2. Depois agitar com bastante cuidado 
3. Adicionar 0.2 ml de uma solução aquosa de KOH a 40% 
4. Agitar novamente com bastante cuidado 
5. Incubar os tubos por um período de 15 a 60 min. Os tubos devem ser incubados 
inclinados. 
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
➢ Resultados positivos: se for encontrada presença de acetoina, fica uma cor vermelha na 
superfície da cultura. 
➢ Resultados negativos: fica uma cor castanha 
 
 
 
➢ Teste de Citrato 
Permite determinar a capacidade das enterobactérias em utilizar citrato como fonte de carbono 
e energia, quando são cultivadas em condições aeróbias. É feito da seguinte forma: 
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1. Com uma ansa estéril, inocular cada uma das enterobactérias em meio de Agar de 
Simmos; 
2. Incubar as culturas a 37 C, por 48 horas. 
 
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
➢ Resultado positivo: apresenta uma cor azul. 
➢ Resultado negativo: apresenta uma cor verde. 
 
 
 
 
Referências Bibliográficas 
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Infecciosas. Disponível em: 
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Acesso em: 28 de abril de 2020 às 15:00. 
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erros na fase pré-analítica de laboratórios clínicos: Revisão sistemática. Disponível em: 
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Serviços de Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Brasília- DF. p.381. 2004. 
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HOLANDA, Cecília Maria. C.X.; ARIMATEIA, Dayse. S.; NETO, Renato. M. Manual de 
Bacteriologia e de Enteroparasitos. p. 30-38. 
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