Um método melhorado para DNA do Sul e Northern Blotting de RNA usando um mini

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Um método melhorado para DNA do Sul e Northern Blotting de RNA usando um mini-gel Mupid®-2 unidade de eletroforese
Um método melhorado para DNA Southern e Northern RNA blotting usando o Mupid®-2 Mini-Gel System é descrito. Obtemos bandas nítidas e claras no Southern e Northern blotting após apenas 30 minutos de electroforese em gel curta em vez das várias horas de electroforese em gel de grandes dimensões dos métodos convencionais. A alta voltagem elétrica com uma corrente de pulso do Mupid®-2 Mini-Gel System também permite a redução da quantidade de formaldeído, um reagente nocivo, do tampão de execução do gel na transferência de RNA. Esta pequena modificação da técnica de blotting de DNA e RNA nos permite realizar o procedimento experimental completo mais rapidamente e economicamente em menos espaço, do que o convencional Southern e Northern blotting, bem como usar uma quantidade extremamente pequena de formaldeído em blotting de RNA. 
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é a técnica laboratorial mais utilizada em estudos moleculares. biologia, e os progressos recentes no sequenciamento direto do genoma baseado em PCR e na RT-PCR quantitativa tecnologia, eliminou em grande parte os métodos tradicionais de análise genética, incluindo o DNA Northern RNA blotting.
 Genoma regiões ou genes que são fáceis de amplificar com PCR e aqueles que são difíceis de amplificar. O último incluir áreas candidatas a doenças repetidas em tripletos com expansões superiores a 0,25 a 6,0 kb, omo segmentos com repetições triplas simples 'CTG' (MIM 160900; distrofia miotônica tipo 1 (DM1) [1] ), repetições diminuídas com fragmentos Eco RI de 10 kb (MIM 158900; distrofia muscular do tipo FSH) [2] , 'ATTCT' repetir expansões variando de 920 a 4140 repetições (MIM603516; spinocerebellar atrofia 10 (SCA10)) [3] ) e expandiu as repetições de 'CCTG' variando de 75 a aproximadamente 11.000 repetições (MIM 602668; distrofia miotônica tipo 2 (DM2)) [4] , todos os quais estão além da capacidade de Polimerase Taq em reaco PCR. Além disso, a expansão de uma repetição em tandem de um dodecamer ('CC CCGCCCCGCG ') na região não traduzida 5-prime do gene da cistatina B (MIM 601145; CSTB) pode alterar a complexa estrutura secundária de uma única fita de DNA na transcrição gênica, resultando em falha na amplificação por PCR na doença de Unverricht-Lundborg (MIM 254800; ULD) [5] Assim, para o diagnóstico molecular destes distúrbios neuromusculares, a tecnologia de PCR comum é inútil. No Por outro lado, Northern blotting ainda é um método popular para a análise de expressões gênicas em que o O padrão de emenda não é claro. Nesses casos, os métodos convencionais de blotting de DNA e RNA, que são demorado e caro, são aplicados para o diagnóstico ou análise da expressão gênica. 
A Unidade de Eletroforese Mini-Gel Mupid®-2 (Advance Co., Ltd.) (13,0 cm × 18,0 cm × 5,0 cmaltura) é um sistema de análise de genes mini-gel comumente usado para análise genética preliminar ou de pequena escala Análise de DNA. Ao contrário de outros sistemas de análise de gel, ele usauma corrente semelhante a pulso semi-direta em vez da unidade de potência usual, e tem um sistema de gel muito pequeno (6,0 cm × 5,5 cm, 6 pistas) combinado com o poder fornecimento em uma unidade [6,7] .
Aqui descrevemos uma pequena modificação da eletroforese em gel de DNA e RNA usando o Mupid®- 2 Sistema Mini-Gel que nos permite melhorar a quantificação mesmo em um formato de gel pequeno e reduzir o tempo de análise, diminuindo a quantidade de formaldeído prejudicial necessário no gel de RNA eletroforese.
1. Southern blotting
O DNA genômico é obtido a partir de amostras de sangue humano. O DNA genômico (10μg) é digerido com o enzima de restrição e precipitado com etanol, e a concentração é quantificada por meio de um Espectrofotômetro NanoDrop (NanoDrop Tech). Então 7,5 μg do DNA é submetido a eletroforese em um gel de agarose, usando o tampão TAE usual (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA (pH 8,0)) [8,9] , no maior faixa do Mupid®-2 Mini-Gel System e passando o gel a 100 V por 30-40 min até que o corante azul de bromphenol migrou para a posição apropriada. Nós mudamos o buffer TAE no
Fig. 1. Configuração de transferência de gel descartável para Southern e Northern blotting via transferência capilar. Toalhas de papel saturadas comtampão de transferência e coberto por filme plástico é usado em vez do banho de reservatório, o que economiza espaço.
Fig. 2. Anise de transfercia de Southern ap autorradiografia com (a) electroforese em gel de ADN convencional (o tamanho do gel 5,5 cm × 14 cm com 6 pistas) e (b) o sistema Mupid®-2 (5,5 cm × 6,0 cm com 6 pistas). O DNA genômico foi digerido com EcoRI e HindIII seguido por electroforese em gel. Na análise convencional, aplica-se electroforese de 5 h (a). No O sistema Mupid®-2, 100 V, foi aplicado em gel de mini-agarose por 30 min (b). Após a transferência do DNA, essas membranas hibridizado com uma sonda de ADN marcado com P 32 (exão 2 e 3 subclonado fragmento de ADN genómico do gene humano CSTB). Nota a nitidez e bom isolamento de bandas no gel curto do sistema Mupid®-2 (b)
meio da eletroforese se o gel é executado mais de 30 min para evitar elevar a temperatura do buffer. O ADN deste gel é transferido para uma membrana Hybond N + (Amersham Inc.) pelo sistema de transferência de gel descartável (Fig. 1) utilizando uma solução desnaturante alcalina (NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M) como tampão de transferência. Estas membranas são hibridizadas com uma sonda de DNA e marcadas pelo sistema de marcação Random Primer usando [32P] dCTP como o nucleotídeo radioativo. Pré-hibridação e hibridização são realizadas usando o tampão de hibridização da Church sem albumina de soro bovino (BSA) [9]. Os borrões são expostos em placas de imagem, e a radioatividade das bandas é visualizada com o sistema BAS2000 (Fujifilm Inc.) (Fig. 2).
2. Northern blotting
O RNA total é extraído das células cultivadas com um kit RNeasy Mini (Qiagen), e a concentração é medida por meio de um espectrofotômetro NanoDrop (NanoDrop Tech). Em seguida, 1 a 10 μg do RNA total é submetido à eletroforese em gel de agarose a 1% usando o tampão TAE usual sem formaldeído no poço grande do Mupid®-2 Mini-Gel System. Amostras de RNA total são preparadas para carregamento com 1 × tampão de formaldeído em gel (formaldeído a 17,5% e formamida a 50% em
Fig. 3. Anise Northern blot ap autorradiografia com (a) electroforese em gel de ARN convencional e (b) o Mupid-2 sistema de RNA total extraído de células PC12 expressando estavelmente o gene da luciferase [10] . Na análise convencional, 30 V foi aplicado em gel de agarose a 1% com formaldeído durante 5 h de electroforese (a). No sistema Mupid®-2, 100 V foram aplicados a um gel de mini-agarose sem formaldeído por 30 min (b). Depois de transferir o RNA para a membrana Hybond N + , estes As membranas foram hibridadas com uma sonda de ADNc de luciferase de 32 P-marcado. O tamanho do gel é o mesmo da figura 2 .
a concentração final) seguida por vórtex, microcentrifugação breve e incubação de 5 min a 65 ° C [8]. Um volume de 10% do formaldeído tampão de carregamento de gel é adicionado, e o gel é executado em 100 V por 30-45 min até que o corante azul de bromphenol tenha migrado para a posição apropriada [8]. Nós mudamos o tampão TAE no meio da eletroforese se o gel é executado mais de 30 min. Em seguida, o RNA no gel é transferido para uma membrana Hybond N + pelo sistema de transferência de gel descartável (Fig. 1) com 20 x SSC como tampão de transferência. Pré e hibridação e visualização da banda alvo são realizadas pelo mesmo método usado para análise de transferência de Southern [8,9] (Fig. 3). A radioatividade das bandas de mRNA demonstra a expressão gênica quantitativamente [10].
Em ambos os Southern e Northern blotting, obtemos uma banda que é tão clara e afiada em um gel curto (6,0 cm de comprimento) como em um gel de 14,0 cm (Figs. 2, 3). Isso se deve provavelmente ao caráter da corrente elétrica semidirecional no sistema Mupid®-2. Os fragmentosde nucleotídeos formam uma estrutura secundária forte, especialmente no RNA, porque os RNAs são de cadeia simples e capazes de formar estruturas secundárias por pares de bases intramoleculares. Os RNAs devem, portanto, ser submetidos à eletroforese sob condições desnaturantes, para obtenção de boas separações.
Essa é a razão pela qual os nucleotídeos do mesmo tamanho não migram necessariamente a mesma distância. Este fenômeno é amplamente explorado na análise de polimorfismos de conformação de fita simples para detectar RFLP. Para evitar esse problema, especialmente na análise da separação de cromossomos, a eletroforese em gel de campo de pulso é geralmente aplicada. Porque o sistema Mupid®-2 gera um sistema elétrico Corrente e corre o gel em alta a concentração final) seguida por vórtex, microcentrifugação breve e incubação de 5 min a 65 ° C [8]. Um volume de 10% do formaldeído tampão de carregamento de gel é adicionado, e o gel é executado em 100 V por 30-45 min até que o corante azul de bromphenol tenha migrado para a posição apropriada [8]. Nós mudamos o tampão TAE no meio da eletroforese se o gel é executado mais de 30 min. Em seguida, o RNA no gel é transferido para uma membrana Hybond N + pelo sistema de transferência de gel descartável (Fig. 1) com 20 x SSC como tampão de transferência. Pré e hibridação e visualização da banda alvo são realizadas pelo mesmo método usado para análise de transferência de Southern [8,9] (Fig. 3). A radioatividade das bandas de mRNA demonstra a expressão gênica quantitativamente [10].
Em ambos os Southern e Northern blotting, obtemos uma banda que é tão clara e afiada em um gel curto (6,0 cm de comprimento) como em um gel de 14,0 cm (Figs. 2, 3). Isso se deve provavelmente ao caráter da corrente elétrica semidirecional no sistema Mupid®-2. Os fragmentos de nucleotídeos formam uma estrutura secundária forte, especialmente no RNA, porque os RNAs são de cadeia simples e capazes de formar estruturas secundárias por pares de bases intramoleculares. Os RNAs devem, portanto, ser submetidos à eletroforese sob condições desnaturantes, para obtenção de boas separações.
Essa é a razão pela qual os nucleotídeos do mesmo tamanho não migram necessariamente a mesma distância. Este fenômeno é amplamente explorado na análise de polimorfismos de conformação de fita simples para detectar RFLP. Para evitar esse problema, especialmente na análise da separação de cromossomos, a eletroforese em gel de campo de pulso é geralmente aplicada. Porque o sistema Mupid®-2 gera um sistema elétrico
Corrente e corre o gel em alta tensão em um curto espaço de tempo, temos uma banda afiada.
A desnaturação é conseguida por adição de formaldeído ao gel e tampões de carga ou por tratamento do ARN com glioxal e DMSO antes do carregamento para Northern blotting convencional. No entanto, nosso protocolo usando o sistema Mupid®-2 elimina a necessidade de formaldeído no buffer de gel em funcionamento. Como o sistema Mupid®-2 gera uma corrente elétrica semelhante a pulso e opera o gel em alta voltagem em pouco tempo, obtemos uma faixa nítida mesmo no gel de agarose sem formaldeído e no tampão de corrida [6,7].
Em conclusão, uma pequena modificação do Southern e Northern blotting usando o sistema Mupid®-2 nos permite quantificar a expressão gênica rapidamente, economizar espaço e reduzir custos, enquanto usamos uma quantidade extremamente pequena de formaldeído na transferência de RNA.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado em parte por uma bolsa de pesquisa (16A-1) para distúrbios nervosos e mentais do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar do Japão.A desnaturação é conseguida por adição de formaldeído ao gel e tampões de carga ou por tratamento do ARN com glioxal e DMSO antes do carregamento para Northern blotting convencional. No entanto, nosso protocolo usando o sistema Mupid®-2 elimina a necessidade de formaldeído no buffer de gel em funcionamento. Como o sistema Mupid®-2 gera uma corrente elétrica semelhante a pulso e opera o gel em alta voltagem em pouco tempo, obtemos uma faixa nítida mesmo no gel de agarose sem formaldeído e no tampão de corrida [6,7].
Em conclusão, uma pequena modificação do Southern e Northern blotting usando o sistema Mupid®-2 nos permite quantificar a expressão gênica rapidamente, economizar espaço e reduzir custos, enquanto usamos uma quantidade extremamente pequena de formaldeído na transferência de RNA.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado em parte por uma bolsa de pesquisa (16A-1) para distúrbios nervosos e mentais do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar do Japão.