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Determinação citológica de Malassezia pachydermatis auricular em cães sadios e otopatas Auricular Malassezia pachydermatis cytologic determination in healthy and ear diseased dogs Mariana Mezzadri de Oliveira - Médica Veterinária – Universidade Tuiuti do Paraná. Especialista em Clínica Médica de Pequenos Animais – Equalis. Pet & Love – Centro Veterinário, Curitiba/PR. E-mail: mariana@petelove.com.br Luciano de Luca - Médico Veterinário – Universidade Tuiuti do Paraná. Pet & Love – Centro Veterinário, Curitiba/PR. E-mail: luciano@petelove.com.br Vanessa Wotkoski Benoni - Médica Veterinária – Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Especialista em Patologia Clínica Veterinária – Qualittas. Bionostic Diagnósticos Veterinários, Curitiba/PR. E-mail: vanessa@bionostic.com.br Marlon Richard Hilário da Silva - Professor do Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Estadual do Centro-Oeste do Paraná (UNICENTRO). E-mail: marlon_rhs@hotmail.com Matheus Folgearini Silveira - Médico Veterinário – Universidade Federal de Pelotas. Mestre em Sanidade Animal – Universidade Federal de Pelotas. Especialista em Clínica Médica de Pequenos Animais – Equalis. Professor do Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Estadual do Centro-Oeste do Paraná (UNI- CENTRO), Guarapuava/PR. Autor para correspondência. E-mail: matheusmedvet@gmail.com Oliveira MM, Luca L, Benoni VW, Silva MRH, Silveira MF. Medvep - Revista Científica de Medicina Veterinária - Pequenos Animais e Animais de Estimação; 2012; 10(34); 408-413. Resumo A otite externa é considerada uma doença comum em cães com etiologia multifatorial, onde a levedu- ra Malassezia. pachydermatis é um dos principais microrganismos associados a esta enfermidade. Para o diagnóstico, o exame citológico é uma ferramenta importante clinicamente, mas a falta de parâmetros quanto à presença de leveduras gera dúvidas quanto ao tratamento. Nesta premissa, os objetivos deste trabalho foram avaliar a importância e a prevalência da determinação de Malassezia pachydermatis em cães sadios e otopatas através do exame citológico pela técnica de coloração panótico simples, auxiliando no diagnóstico através da citologia e do esfregaço otológico do agente, analisando o número observado por campo de microscopia óptica tendo como meta padronizar uma média dessa levedura estabelecendo nú- mero máximo de agentes sem induzir otopatias. Através dos dados epidemiológicos e do exame citológi- co pode-se obter um parâmetro de contagem e metodologia de análise e, conseguir um controle racional da levedura através da graduação clínica proposta. Dentre 36 animais deste estudo, os mesmos foram classificados clinicamente e distribuídos entre 18 cães sadios e 18 otopatas. Foi realizada a colheita de material auricular por meio de swab estéril e encaminhado para análise citopatológica. Os cães otopatas apresentaram média de contagem de leveduras elevada (4,09) comparando-se com os cães clinicamente sadios (0,14), sendo que apresentaram média de escore elevada. Na interação dos sinais clínicos, observa- ram-se correlação com eritema e edema (r2=0,77; p<0,01), odor e secreção (r2=0,77; p<0,01), prurido e odor (r2=0,72; p<0,01) e eritema e prurido (r2=0,67; p<0,01). Identificou-se que cães sadios possuem menor rela- ção leveduras por campo, mesmo apresentando baixa contagem e reduzido escore clínico, ressaltando a importância do diagnóstico diferencial. Com isso deve-se ressaltar a necessidade e aplicabilidade do exa- me citológico para o diagnóstico e tratamento de otopatias, considerando que a M. pachydermatis faz parte da microbiota auricular tegumentar, mas não necessariamente é a causa de base de muitas otopatias. Palavras-chave: Otite, Malassezia pachydermatis, citologia, cães Abstract Otitis externa is considered a common disease in dogs with multifactorial etiology, where the yeast Malassezia pachydermatis is the main microorganisms associated with the disease. For diagnosis, cyto- trabalho De pesquisa G er al 408 Medvep - Revista Científica de Medicina Veterinária - Pequenos Animais e Animais de Estimação 2012;10(34); 408-413. logical examination is a clinically important tool, but the lack of parameters for the presence of yeast raises doubts for the treatment. On this premise the main objectives were to evaluate the importance and prevalence Malassezia pachydematis determination in healthy and diseased dogs by examining cytologi- cal staining technique samples, helping to diagnose by smear cytology and otological agent analyzing the observed number of agents by optical microscopy aiming to standardize this yeast establishing the maximum number of agents without inducing ear diseases. Through epidemiological and cytological examination can obtain a count parameter and methodology of analysis and achieve a rational control of the yeast through the proposed clinical graduate. Among 36 animals in this study, they were clinically classified and divided between as 18 healthy dogs and 18 ear diseased dogs. Cytological ear sampling was performed using a sterile swab and sent for cytological analysis. Ear diseased dogs had a high avera- ge yeast count (4.09) compared with the healthy dogs (0.14) and achieve high medium values. In the in- teraction of clinical signs was observed correlation with erytema and edema (r2 = 0.77, p <0.01) odor and discharge (r2 = 0.77, p <0.01), pruritus and odor (r2 = 0.72, p <0.01) and erythema and pruritus (r2 = 0.67, p <0.01). It was found that healthy dogs have smaller related yeasts per field, even with low counts and reduced clinical score emphasizing the importance of the differential diagnosis. This should highlight the need and applicability of cytology for the diagnosis and treatment of ear diseases, where M. pachydermatis is a part of cutaneous flora, but not necessarily is the underlying cause of many ear diseases. Keywords: Otitis, Malassezia pachydermatis, cytology, dogs queratinização, distúrbios endócrinos, doença autoimune, pólipos inflamatórios e neoplasias (5,6). Assim como a localização, os sinais clínicos depen- dem da extensão, sendo observadas alterações como eri- tema, edema, descamação, cerume e crostas, alopecias, escoriações, inclinação e ato de balançar a cabeça, prurido e presença de dor quando ocorre a palpação da cartila- gem auricular ou da bula timpânica (5). O diagnóstico se inicia analisando fatores como his- tórico, exame clínico, otoscopia e citologia, cultura e sen- sibilidade, bem como avaliação da otite média e biópsia nos casos mais graves e recorrentes. Exames complemen- tares podem ser necessários dependendo da causa sub- jacente (7). Radiografia, tomografia computadorizada e ressonância magnética podem ser solicitados em casos de suspeita de otite média (4). O exame citopatológico visa estabelecer diagnósticos de lesões inflamatórias e neoplásicas sem a presença de arquitetura tecidual, e, quando não é possível chegar a uma conclusão, pode restringir os possíveis diagnósti- cos diferenciais (8), sendo considerada a mais importan- te ferramenta diagnóstica simples depois de um exame completo do canal auditivo (6). É realizado em esfrega- ços em lâminas coradas pela técnica de panótico simples, observados em microscopia de imersão anotando-se por número de leveduras por campo examinado. Essa técnica é considerada um método simples, rápido e eficaz para se ter uma avaliação precoce do agente envolvido, até que o exame microbiológico possa ser realizado (8). Determinação citológica de Malassezia pachydermatis auricular em cães sadios e otopatas introdução A orelha é considerada um órgão complexo, pois en- volve componentes neurológicos e diferencia-se em virtu- de de ser uma estrutura cutânea ímpar. Anatomicamen- te, o canal auditivo é divido em orelha externa, média e interna, estendendo-se desde a entrada do canal verticalaté a membrana timpânica. Possui glândulas sebáceas e ceruminosas adjacentes à morfologia auricular (1). A microbiota bacteriana e fúngica do canal externo de cães com otite externa e sadios é composta por agentes como Staphylococcus intermedius e Malassezia pachydermatis, sendo estes os principais microrganismos isolados no conduto auditivo de cães (2). É muito importante notar que as bacté- rias ou leveduras associadas com casos de otite externa são, invariavelmente, oportunistas e não são apenas patógenos primários os únicos responsáveis por um determinado caso de otite externa (3). Os processos inflamatórios da orelha constituem a otite, onde tais agentes supracitados podem ser deflagradores e associados a demais fatores que iniciam a resposta local. As otites são classificadas de acordo com o grau de acometimento anatômico do pavilhão auricular, sendo estas externas, médias ou internas (4). Os fatores predisponentes são os que aumentam o risco de possíveis otopatias, e podem ser: a umidade excessiva, irritação iatrogênica, conformação anatômica e predileção por raças, estreitamento e pelos nos condutos auditivos. Além disso, outras causas primárias de otite podem ser pa- rasita, corpos estranhos, dermatites alérgicas, alterações de G er al 409Medvep - Revista Científica de Medicina Veterinária - Pequenos Animais e Animais de Estimação 2012;10(34); 408-413. Determinação citológica de Malassezia pachydermatis auricular em cães sadios e otopatas A terapia da otite depende da identificação e do controle das causas primárias de otite e do resultado do diagnóstico. Pode ser feita aplicação sistêmica de antibióticos, antifún- gicos, corticosteróides e parasiticidas, que serão recomen- dados de acordo com a infecção do conduto auditivo, que pode ser de origem bacteriana, fúngica, parasitária e alérgi- ca (6). Medicações tópicas podem ser recomendadas após a correta limpeza da orelha, e se for necessário remover exsu- datos e debris acumulados após a correta sedação (5). Através desse trabalho priorizou-se determinar os pa- râmetros do agente Malassezia pachydermartis com o nú- mero observado por campo de microscopia óptica através da citopatologia auricular, empregando a comparação es- tatística de uma média de leveduras por campo em cães sadios e otopatas. Com isso, visa-se estabelecer número máximo de agentes sem induzir otopatias, já que essa le- vedura faz parte da microbiota de cães. Material e Metódos Para a determinação e quantificação da levedura Ma- lassezia pachydermatis, foi realizada a colheita de secreção otológica em 36 cães durante o atendimento clínico. Os cães foram encaminhados ao atendimento clínico particu- lar no município de Curitiba, no Estado do Paraná no pe- ríodo de 30 de maio a 30 de setembro do presente ano. Os mesmos foram identificados de acordo com os dados de resenha, incluindo raça, pelagem, sexo, idade e acompa- nhados ao longo de 30 dias, independente de apresentar ou não otopatia após o exame físico específico. No exame avaliaram-se os pavilhões auriculares em relação à presença de características semiológicas de oto- patias (quadro 1; figura 1). Desta forma, considerando os sinais clínicos apresentados, as amostras foram qualifica- das em dois grupos: um com animais que apresentam pelo menos um sinal clínico de otopatia classificado como leve e um segundo grupo composto por animais sem sinais oto- lógicos. As amostras de secreção auricular foram enviadas para um laboratório de patologia animal em Curitiba. Sinal Clínico Graduação Eritema Ausente=0 Ausente=0 Ausente=0 Ausente=0 Ausente=0 Leve=1 Leve=1 Leve=1 Leve=1 Leve=1 Médio=2 Médio=2 Médio=2 Médio=2 Médio=2 Moderado=3 Moderado=3 Moderado=3 Moderado=3 Moderado=3 Grave=4 Grave=4 Grave=4 Grave=4 Grave=4 Edema Prurido Odor Secreção Quadro 1 - Classificação de otite de acordo com o grau de sinais clínicos identificados. Figura 1 - Características macroscópicas do pavilhão auricular de cães apresentando quadro clínico de otite classificada como leve [A] e grave [B]. Os swabs estéreis foram inseridos no interior de cada conduto auditivo, sendo gentilmente friccionados ao encontro da parede da orelha a fim de obter o conteúdo celular e eventuais microrganismos presentes. Tendo o swab em mãos, foi realizado o deslizamento do mesmo sobre uma lâmina de vidro para microscopia óptica, sen- do feito assim um desgaste do excesso de conteúdo por duas vezes. Após isso, obteve-se o material do terceiro rolamento, gerando assim o conteúdo a ser visualizado à microscopia óptica após coloração via panótico simples. As amostras foram analisadas individualmente, sem conhecimento de informações clínicas e/ou do animal A B G er al 410 Medvep - Revista Científica de Medicina Veterinária - Pequenos Animais e Animais de Estimação 2012;10(34); 408-413. pelo patologista, tornando-o assim duplo cego. Somente a área referente à terceira rolagem foi avaliada, onde nes- ta grande superfície selecionaram-se cinco campos alea- tórios, buscando a presença de Malassezia pachydermatis. Tendo analisados os campos, foram somadas as visuali- zações e determinado o número médio de leveduras pre- sentes no pavilhão auricular. Os dados foram organizados em blocos casualisados de acordo com as características de resenha dos pacientes, divididos entre otopatas e sadios. Correlacionaram-se os sinais clínicos entre si dentre os dois grupos a fim de es- tabelecer relação com os achados de microscopia, propor- cionando dados referentes a parâmetros de Malassezia pachydermatis em cães sadios e otopatas com padroniza- ção de técnica de colheita e processamento. A análise estatística aplicada foi o teste de Tukey, sen- do considerado significativo p<0,05 por meio do software ASSISTAT®. resultados e Discussão Após a pesquisa com 36 cães com amostras coletadas de ambas orelhas através da microscopia direta, as raças mais frequentes em relação aos dois grupos foram os mes- tiços (19,4%), Poodle (16,6%) e Yorkshire Terrier (16,6%). Dentre as demais, destacam-se os cães Pinscher (8,3%), Labrador (5,5%), em seguida Beagle,(5,5%), Teckel (5,5%), Cocker Spaniel Inglês (2,7%), Lhasa Apso (2,7%), Golden Retriever (2,7%) , Pequinês (2,7%), Pit Bull (2,7 %), Shar- pei (2,7%), Bulldog Inglês (2,7%) resultado semelhante ao de Reme et al., (2006) e Zur et al, (2011). A idade média dos dois grupos foi de cinco anos resultado não avaliado no estudo de Zur et al (10) .O gênero predominante foi de (55,5 %) fêmeas para (44,5 %) machos, resultado seme- lhante ao estudo de Fernandez e colaboradores (9). Em cães sadios, as raças predominantes foram os mestiços (27,7%), Poodle (22,2%), Yorkshire Terrier 16,6 %, Beagle (5,5%), Bulldog Inglês (5,5%), Sharpei(5,5%), Pit Bull (5,5%), Pinscher (5,5%) e Teckel (5,5%). A ida- de média do grupo foi de 6,4 anos. E o gênero predo- minante foi de fêmeas (61,1 %) em relação aos machos (38,9%). No caso dos otopatas, observaram-se os Mestiços (22,2%), Yorkshire Terrier (16,6%), Pinscher (11,1%), Poo- dle (11,1%) e Labrador (11,1%). As outras raças analisa- das foram Cocker Spaniel Inglês (5,5%), Beagle (5,5 %), Golden Retriever (5,5%), Lhasa Apso (5,5%) e Pug (5,5 %). Certas raças são propensas a otite devido à conformação anatômica confirmado pelo estudo de Girão et al. (11) . A idade média do grupo dos otopatas foi de 3,6 anos re- sultado parcialmente semelhante ao de Pulido et. al (12), que foi de (25,9%) entre três e seis anos. Girão et al. (11) observaram que eram cães de um a três anos (44,7%) e os resultados significativos e de maior incidência em relação ao segundo resultado de quatro a seis anos (35,7%). Os sinais clínicos presentes em cães foram: eritema (15,4%), edema(12,3%), prurido (19,5%), odor (20,6%) e secreção (21,6%) resultado semelhante ao de Remé et al.(13). Observou-se uma diferença significativa da leve- dura nas orelhas e segundo Oliveira et al.(15) as amos- tras devem ser colhidas e cultivadas de ambos os ouvidos para melhor tratamento e prognóstico (tabela 1). Os otopatas apresentaram valor médio de leveduras em cinco campos maior do que os sadios, sendo que estes possuíram uma contagem reduzida, mas estavam evi- dentes, reafirmando a sua presença na microbiota auricu- lar. Com os dados descritos, evidencia-se que a presença de mais de uma levedura é indicativo de um processo inflamatório local, onde a Malassezia pachydermatis possui papel relevante (figura 2). Em relação aos sinais clínicos, nos otopatas identifi- caram-se a presença de secreção de escore pronunciado (1,89) seguido de odor (1,44) e prurido (1,44), semelhante aos sadios, porém com valores menos significativos (Ta- bela 1), perfazendo o caráter incipiente do agente em de- sencadear a doença, onde algum sinal clínico ainda era identificado, mas de forma inexpressiva. O diagnóstico com citologia otológica mostra a de- vida importância desse exame na rotina das clínicas veterinárias e em cães com sinais clínicos compatíveis com otite. Ao analisar as orelhas dos cães podemos sus- peitar que seja levedura, bactéria ou parasita pela cor e odor característicos, mas em certos casos isso não é possível. O melhor método de diagnóstico é através da citologia auricular, e após o correto diagnóstico pode- mos direcionar o tratamento específico conforme estu- do de Angus (15). Tratamento Leveduras/ campo* Sinais Clínicos* Eritema Prurido Edema Odor Secreção Otopata Sadio Desvio padrão Coeficiente de Variância (%) As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey; p<0,01) a 4,09 b 0,14 4,83 211,03 a 1,06 b 0,22 0,93 131,66 a 1,44 b 0,28 1,02 97,68 a 0,83 b 0,17 0,81 149,51 a 1,44 b 0,39 1,10 107,02 a 1,89 b 0,39 1,35 99,95 Tabela 1 - Comparação entre os pacientes caninos otopatas e sadios de acordo com a média de contagem de leveduras e res- pectiva apresentação clínica. Determinação citológica de Malassezia pachydermatis auricular em cães sadios e otopatas G er al 411Medvep - Revista Científica de Medicina Veterinária - Pequenos Animais e Animais de Estimação 2012;10(34); 408-413. Conclusão O presente trabalho avaliou através de levantamen- to de dados epidemiológicos, clínicos e citológicos de Malassezia pachydermatis em cães atendidos na roti- na clínica, mostrando a importância de estabelecer um parâmetro de contagem e de metodologia de análise do agente a fim de que se possam determinar formas de controle racional da levedura. Soma-se a isso a gradu- ação clínica aqui estabelecida, sendo os sinais clínicos: eritema, edema, prurido, odor e secreção com graduação de 0 a 4, proporcionando categorização e a correlação en- tre os achados laboratoriais e semiológicos. referências 1. Lyskova, M.; Vydrzalova, J.; Mazurova. Identification and Antimi- Figura 2 - Aspecto citológico auricular ótico em cães com Malassezia pachydermatis [A] - seta escura - onde a mesma pode-se apresentar isolada, adjacente às células epiteliais descamativas [B, C] - seta escura - ou aglomerada em pequenos [C] - seta branca - ou grandes grupos [D]. Panótico simples, 100X [A,B,C] e 40X [D]. Em relação aos sinais clínicos, observou-se cor- relação significativa no estadiamento clínico, prin- cipalmente entre eritema e edema, odor e secreção e prurido e odor (tabela 2). Este dado demonstra a relevância da graduação clínica para determinar os principais sinais clínicos, assim como a interação en- tre os mesmos a fim de somar às formas de diagnós- tico complementares. Tabela 2 - Interação entre os sinais clínicos dos pacientes sadios e otopatas (p<0,01). Variáveis Correlação (r²) Correlação (r²)Variáveis Eritema* Edema 0,77 Edema*Odor 0,52 Eritema*Prurido 0,67 Edema*Secreção 0,48 Eritema*Odor 0,58 Prurido*Odor 0,72 Eritema*Secreção 0,56 Prurido*Secreção 0,59 Edema*Prurido 0,53 Odor*Secreção 0,77 Determinação citológica de Malassezia pachydermatis auricular em cães sadios e otopatas A B C D G er al 412 Medvep - Revista Científica de Medicina Veterinária - Pequenos Animais e Animais de Estimação 2012;10(34); 408-413. crobial Susceptibility of Bacteria and Yeasts Isolated from Healthy Dogs and Dogs with Otitis Externa. J. Vet. Med., v. 54, p. 559- 563, 2007. 2. Rosser, E.J. Causes Of Otitis Externa . The Veterinary Clinics Of North America: Small Animal Practice, v. 34, p. 459-468, 2004. 3. Scott D.W.; Miller W.H.; Griffin C.E.; Small Animal Dermatology, 6 ed. Philadelphia:Saunders, p.1203-1229, 2001. 4. Medleau, L.; Hnilca, K.A. Dermatologia De Pequenos Animais: Atlas Colorido e Guia Terapêutico. p. 274-282, 2003 5. Werner, A.H. 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