TECNICA WESTERN BLOT- Fabiana Marcela

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Western Blot é uma técnica usada para detectar proteínas de uma determinada amostra e serve como teste confirmatório dos resultados obtidos em testes imunoenzimaticos. Pode	ser usada para detectar proteínas dos anticorpos do vírus do HIV, doença da Vaca Louca, doença de Lyme, Saccharomyces serevisiae e etc.
Preparação do tecido;
Eletroforese em gel;
Transferência;
Bloqueio;
Detecção;
Método de dois passos:
Anticorpo primário;
Anticorpo secundário.
Método de um passo;
Detecção
Detecção colorimétrica;
Quimioluminescência;
Detecção radioativa;
Detecção fluorescente;
Sondagem secundaria.
Analise.
Preparação do tecido;
Eletroforese em gel;
Transferência;
Bloqueio;
Detecção;
Analise.
Amostra : Tecido Biológico e/ou cultura de células.
Elas são esfriadas ou aquecidas rapidamente.
São homogeneizadas por sonicação (quebra das células por alta freqüência sonora) ou por força mecânica a qual resultará em uma mistura homogênea dos componentes das células.
Após	esse passo o tecido pode ser	usado como esta ou sujeito a uma centrifugação onde passará por uma serie de passos para a isolar o material do citozóico (material do
interior da célula externo ao seu núcleo).
Fervura das amostras : carentes elétricas, composto sulfuroso e DSS*
DSS*= Dodecil sulfato de sódio.
Géis
A separação é feita de acordo com o peso molecular.
É feita por aplicação de cargas elétricas a qual vai fazer com
que as proteínas caminhem em uma única direção ao longo
do gel. As amostras são carregadas lado-a-lado	em valas feitas no gel. As proteínas são então separadas por massa
em
“bandas” dentro de cada “raia” formada a partir da vala. Uma raia é reservada para um marcador ladder que é uma
proteína de peso molecular conhecido.
As proteínas são separadas em duas dimensões .
As proteínas são separadas na primeira dimensão de acordo com o seu ponto isoelétrico: pH com uma carga total igual a zero.
As proteínas separadas na segunda dimensão	é de acordo com seus pesos moleculares.
As proteínas acessíveis à detecção dos anticorpos têm que ser removidas do gel e posto em uma membrana	de nitrocelulose ou PVDF. Para tal mecanismo é preciso a aplicação de uma corrente elétrica. Seu resultado é uma fina camada da proteína para sua detecção.
Ambas as variedades de membranas são escolhidas por-
que elas tem a capacidade de ligar-se a proteínas não especificamente.
Interações hidrofóbicas .
Interações de carga.
Custo.
O boquei é usado para impedir as interações não específicas entre a membrana e os anticorpos usados para a detecção da proteína alvo.
Solução diluída de uma proteína- tipicamente albina de soro bovino(BSA).
Leite seco desnatado com uma pequena quantidade de detergente: Tween 20 ou carbono coloidal.
Método de um passo
Rapidez no processo;
Menos material consumido;
Anticorpo sonda: Marca a proteína de interesse e	uma marcação detectável(freqüências protéicas conhecidas);
A sonda primaria é incubada com a membrana de forma similar	ao método	de dois passos. Ela pode então ser detectada de forma direta após varias lavagens.
Método de dois passos
A membrana será testada com os anticorpos da proteína de
interesse, ligadas por enzimas reveladoras.(muda a cor)
Anticorpos primários: Liga-se direto à proteína.
Anticorpos secundários: São ligados onde os anticorpos primários não se ligaram.
Detecção colorimétrica;
Quimioluminescência;
Detecção radioativa;
Detecção fluorescente.
Após	a realização de toda	a	técnica, as proteínas	alvo	estão prontas para serem estudadas e	é na analise que isso será feito.
A analise é feita nas partes em que as sondas	são marcadas e ligadas as proteínas e as que não forem ligadas a esta são retiradas.
A sondagem secundaria é como se fosse uma continuação da transferência. São usados tanto a membrana de nitrocelulose quanto o PVDF.
Esse passo é responsável pela identificação dos anticorpos e pode também ser	reutilizado para sondagens subseqüentes.
Atualmente a mais utilizada é a M. de N. do que a PVDF. Esta por sua vez é muito mais cara e permite uma revelação muito mais fácil e pode ser reutilizada muito mais vezes.
A técnica western blot	tem sua aplicação muito importante em diagnósticos médicos, o qual ajuda na detecção dos anticorpos, produzidos por nós, de varias doenças, como por exemplo a AIDS, a doença da Vaca Louca e outras.
DESVANTAGENS:
Por ser uma técnica laboriosa(trabalhosa ou custosa ) e demorada, que necessita da separação de proteínas por eletroforese antes que ocorra a transferência delas para a membrana de nitrocelulose.
Neste trabalho explanamos sobre o tema Western Blot, que é um exame mais especifico para a detecção de proteínas virais.
Esse método utiliza eletroforese em gel para obter o resultado esperado.
Ele é muito utilizado em testes imunoenzimáticos.
Também exames confirmatórios de doenças, como a doença da vaca louca e doença de Lyme.
A técnica Western Blot foi e é para a medicina um grande avanço, pois através deste podemos dizer com precisão resultados de doenças como a AIDS entre outras.