Western Blot - Biologia molecular

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O que é?
Western Blot
BioMolBioMol
É uma técnica que separa e identifica proteínas em uma amostra utilizando
os anticorpos como marcador específico. É um método quantitativo, pois é
possível saber a quantidade de proteína presente na amostra através da
quantidade de anticorpos ligados a ela e qualitativo, pois é possível ver a
ligação antígeno anticorpo.
Aplicações
 - A amostra coletada terá que sofrer uma homogeneização mecânica ou
 ultrassônica, para que o tecido ou a célula seja macerado. As células vão 
 passar por um processo de lise, usando um tampão de lise, e são agitadas 
 para que ocorra a liberação de todas as proteínas existentes na célula. Essa
 amostra vai conter várias proteínas além da que eu vou querer identificar
- Método de Bradford: Quantificação de proteínas na amostra através do ensaio
 colorimétrico, ou seja, é colocado um tampão de quantificação que irá conter
 um agente clorófilo/corante luminoso que irá se ligar as proteínas. Então,
 quanto maior for a absorbância, maior a quantidade de proteínas. (quanto
 mais escura a cor, maior a concentração proteica e quanto mais fraca menor);
- Quem irá fazer a leitura da absorbância será o espectofotômetro;
- Confirmação de doenças;
- Pesquisa científica;
- Análise forense;
- Verificar silenciamento de proteínas;
- Expressão pós clonagem
- Cada amostra de proteína colocada nos poços deve conter a mesma
 quantidade.
- Para que as proteínas que se encontram enoveladas possam correr em gel de
 eletroforese, é necessário que elas se desenrolem e se abram, por isso é
 necessário passar pelo processo de desnaturação. Pois caso elas estivessem
 enoveladas, teriam dificuldade em passar 
- Tampão: Tris-HCLpH 6.8, SDS(detergente que permite a desnaturação da
 proteína), B-Mercaptoethanol (dá carga negativa as proteínas), Bromophenol
 blue (corante que permite a visualização das proteínas), glicerol (aumenta a
 densidade das proteínas), ddH2O (garante o mesmo volume para todos os
 pocinhos);
Preparo da amostra1.
2. Quantificação das proteínas
3. Tampão de corrida
Vantagens
- É uma técnica sensível e específica;
- Possibilidade de múltiplas réplicas do ensaio;
- Membranas úmidas são de fácil manuseio;
- Estocagem da membrana por longos tempos;
- Reutilização da membrana para novas análises
Etapas
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- O processo vai se basear na migração vertical das proteínas do eletrodo 
 negativo para o eletrodo positivo, diferenciando-se pelo peso molecular;
- O gel será de poliacrilamida e terá poros seletivos que vai permitir a corrida
 dessas proteínas. Esse gel estará numa cuba e essa cuba estará ligada por
 eletrodos;
- O gel será a união de bisacrilamida e acrilamida e essa junção é que vai formar
 os poros. Quando o gel for feito com uma maior concentração de acrilamida
 (15%), ele formará poros menores. Enquanto o que é feito com uma menor
 concentração de acrilamida(7,5%), formará poros maiores. Isso é importante
 porque quando eu quiser identificar proteínas com peso molecular menor, eu
 irei colocar uma maior quantidade de acrilamida nesse gel, o que permitirá a
 passagem dessas proteínas mais leves e menores deixando pra trás as mais
 pesadas e menores. Consequentemente, se eu quiser identificar proteínas 
 mais pesadas e maiores, vou fazer esse gel com uma menor concentração de
 acrilamida, a fim de que os poros formados sejam mais abertos e permitam a
 passagem da proteína que quero identificar;
- O último agente que será colocado no preparo do gel será o persulfato de
 amônio, que dará será responsável pela polimerização da acrilamida e o 
 TEMED estabilizará os dois agentes responsáveis pela formação dos poros. 
 Essa junção fará com que esses poros se solidifiquem;
- As amostras que contém proteínas mais leves estará na parte inferior e as
 proteínas mais pesadas estará na parte superior;
4. Eletroforese Gel de empilhamento (stacking gel): Prepara e diminui a mobilidade das
proteínas para que elas possam sair ao mesmo tempo da linha de largada;
Gel de corrida (separating gel): Campo de corrida das proteínas.
Um dos pocinhos da extremidade será reservado para ser colocado um
marcador chamado ''ladder''que irá nos dar um parâmetro acerca do peso
molecular das proteínas
5. Blotting/Transferência para membrana
- Essa etapa será a transferência das proteínas do gel para uma membrana de
 nitrocelulose, que dará uma estabilização a essas proteínas, possibilitando a
 ligação do anticorpo com a proteína específica do meu interesse;
- É feito uma espécie de sanduíche que irá servir como uma xérox para que as
 proteínas sejam transferidas do gel para a membrana através da corrida do 
 polo negativo para o polo positivo em uma temperatura de 4°C;
- A membrana deve está do lado do polo positivo e o gel do lado do polo negativo;
- É usado um tampão de transferência (Tris + Glicerol);
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6. Bloqueio de proteínas inespecíficas
- Estará presente na amostra todo tipo de proteína, as que são do meu interesse
 (específicas) e também as que não são (inespecíficas);
- Portanto, para bloquear as proteínas que não são o meu alvo, eu adiciono
 proteínas, pois proteína se liga com proteína. E, neste caso, usamos leite ou a
 albumina (proteína bovina). Porém os leites também vão bloquear as proteínas
 do meu interesse, uma vez que esse processo é inespecífico;
- Após isso é feita sucessivas lavagens na membrana com a intenção de eliminar 
 o background;
- Isso vai reduzir o ruído no produto final do western blot, tornando os resultados
 mais claros e eliminando a possibilidade de resultados falsos
7. Aplicação do anticorpo primário
- O anticorpo primário é adicionado a fim de se ligar especificamente na proteína
 de interesse. A ligação da proteína com o anticorpo é muito mais forte do que 
 a ligação da proteína com o leite, uma vez que a primeira é uma ligação
 específica e a segunda é uma ligação inespecífica;
- Esse anticorpo é diluído em uma solução de BSA a fim de bloquear as proteínas
inespecíficas e só se ligar na proteína alvo, enquanto que as outras proteínas
ficam bloqueadas pelo leite;
- Essa incubação dura cerca de 3-12hrs
Anticorpo monoclonal: É mais caro e não precisaria da parte do bloqueio com
o leite, uma vez que é muito específico e seletivo;
Anticorpo policlonal: É mais barato e precisa da parte do bloqueio com o leite
de proteínas inespecíficas, pois o seus epítopos podem se ligar as proteínas
inespecíficas e resultar em um resultado falso.
8. Aplicação do anticorpo secundário
- É uma espécie-específica para o anticorpo primário e esse anticorpo
 secundário é o que vai permitir a visualização e irá emitir uma luz quando o
 complexo for formado (antígeno-anticorpo);
9. Detecção
- A visualização das bandas é que vai permitir que saibamos que o complexo foi
 formado, pois esse complexo irá dar um emitir um sinal, seja por fluorescência
 ou quimioluminescência. Desse modo é possível identificar se determinada
proteína está presente ou não em um organismo.
- Para que seja possível visualizar as bandas, é necessário que a membrana
 passe por uma análise de bandas, então ela passará por uma máquina;
- A imagem será analisada por densitometria (mede a densidade de proteínas na
 amostra e mostrará o quão intensa é a banda), a qual avaliará a quantidade de
 proteína colorida e quantifica os resultados em termos de intensidade óptica;
- É utilizada diferentes máquinas para diferentes tipos de detecção.