PCR (replicação do DNA in vitro)

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Reação da cadeia polimerase
Liz Schettini 
BMC
 
 Na replicação em vivo precisamos da ação de várias enzimas como a: polimerase, ligase, topoisomerase, helicase, primase etc. Essa aula vai abordar o PCR e a replicação do DNA in vitro.
 A origem de replicação tem duas forquilhas, uma forquilha só anda para um lado, o que gera um problema com a polimerase, no caso da in vitro, podemos fazer do jeito mais fácil.
 O PCR é uma técnica que permite a amplificação da quantidade de DNA específica utilizando a enzima TaqDNA polimerase, sequências iniciadoras específicas (primers) e variações de temperatura controladas.
A técnica do PCR é pegar o DNA com outras moléculas, colocar em um tubo e submeter esse tubo a alternâncias de temperaturas (termociclador -> é uma máquina que cicla temperaturas). Primeiro que não vai precisar de helicase aqui nessa reação. Isso porque as ligações de H+ são facilmente rompidas em altas temperaturas (o que vai ocorrer na máquina, que fica a até 95 graus, promovendo a quebra dessas ligações e consequentemente a abertura da dupla fita). 
 Mas qual é o propósito dessa replicação do DNA in vitro? Pode ser feito para várias coisas, aqui especificamente nós queremos replicar o DNA in vitro para diagnóstico de microrganismos. Por exemplo: seu paciente está com diarreia, podemos detectar o microrganismo causador (bactérias ou vírus). Eu posso, fazer uma PCR e aí para isso eu preciso do DNA do paciente. Quando tá infectado por um microrganismo e eu colho o sangue do paciente vem DNA do paciente e do microrganismo (chamado DNA total do sangue). No laboratório, para isolar o genoma do microorganismo, eu faço um primer (de DNA) que só se ligue ao gene do microrganismo, não ao DNA humano, e eu também não preciso sequenciar o genoma inteiro do microrganismo, apenas um pedaço. Precisa-se de um primer para cada fita do DNA (ou seja, um sentido 5’ -> 3’ e outro no sentido 3’ -> 5’). OBS.: um primer de RNA nesse procedimento pode se ligar ao RNA humano, então não é vantagem.
 No tubo então, até agora temos: DNA + Primers específicos do microrganismo que eu estou estudando. Só que eu também preciso de polimerase (TAQ polimerase) para colocar nucleotídeos, então temos: DNA + Primers + Polimerase. Mas também precisamos dos nucleotídeos (DNTPs -> para serem usados pela polimerase) e de magnésio (cofator da polimerase), tampão e água (esses dois são para estabilizar o meio). Então os componentes finais do tubo são: DNA + Primers + Polimerase + DNTPs + Mg + Tampão + H2O.
 A temperatura de 95° abre a dupla fita, mas para o primer funcionar, precisamos baixar a temperatura (para ter anelamento dos primers – 55 até 62 graus) e depois precisamos aumentar novamente para 72° para que a polimerase possa .........................................................polimerizar (no sentido 5’3’).
 Até então ninguém conseguia fazer esse experimento porque as nossas enzimas não funcionam a 95 graus, porém a polimerase das bactérias suportam altas temperaturas. 
 Se amplificar o DNA é porque o primer conectou, isso significa que a pessoa está infectada (já que o primer não se liga ao DNA humano). Uma vantagem do PCR é que detecta a presença de microrganismos muito rapidamente, mesmo na janela imunológica. 
 Se você fizer a PCR para Hepatite. B, e você ver que amplificou é porque a pessoa está infectada. Se não amplificou, é porque não houve infecção. Em caso de vírus de RNA, como a Hepatite C, você pega o RNA total sanguíneo do paciente para detectar o RNA do microrganismo e fazendo uso da transcriptase reversa, converte-se o RNA em DNA porque o PCR só atua sobre DNA. (agora você que tem que desenhar um primer específico para o vírus que você quer detectar). Esse teste não só detecta se o paciente está infectado ou não, mas também detecta a carga viral.
 Esse experimento (PCR) é o ponta pé inicial para várias técnicas de diagnóstico na biologia molecular, por exemplo, sequenciamento genético. Se eu quiser sequenciar o gene da fibrose cística para saber se a pessoa é afetada ou não. Ou seja, eu não preciso sequenciar o genoma inteiro, eu só quero o gene específico do CFTR. Então eu pego apenas um pedaço, eu faço um primer que se prenda no começo e no final do gene, promovendo a multiplicação do gene que aquele primer se grudou. Isso ocorre de forma exponencial. Na hora de sequenciar o gene, não adianta sequenciar de ponta a ponta porque tem muitos íntrons, então é necessário fazer VÁRIOS primers para que eles se liguem apenas aos éxons. Na fibrose cística, grande maioria das pessoas, tem mutação de classe II, que fica em um éxon específico, vamos supor que fica no éxon 1, então eu sequencio o primer apenas para o éxon 1, isso facilita por ser mais rápido, pensando em epidemiologia; mas se for negativo, não exclui o diagnóstico.
 OBS.: PCR também permite teste de paternidade. 
 As etapas:
1. Extração de DNA
2. Desenho dos primers
3. Reação de PCR 
a. Termociclador
4. Análise dos resultados
a. É feita através de eletroforese, precisa de um gel (agarose, geralmente); o pó de agarose + tampão e coloca no micro-ondas para homogeneizar e depois deixa solidificar; depois que está solidificado, enfia-se um pente (os furinhos que ficam será onde será colocada as amostras); em seguida coloca-se o tampão por cima;
b. O corante é misturado com o produto da PCR para que ele permaneça na parte de baixo; 
c. Coloca-se eletrodos positivo e negativo em cada lado da cuba;
d. DNA é carregado negativamente, e por isso tende a correr para o polo positivo;
e. Depois utiliza-se um marcador de peso molecular para comparar com as amostras que a pessoa já tem, sendo que as moléculas mais leves sedimentam primeiro, e as mais pesadas demoram mais. Isso já tem um resultado padrão, então eu sei a altura que minhas fitas de DNA deveriam atingir no tubo para dizer que a pessoa está infectada,
 Existem variações da técnica para obtermos informações diferentes:
· Nested-PCR é a técnica para identificar parasitoses, ele amplifica sequencias de DNA de baixa frequência.
· Real time-PCR é a técnica quantitatica para determinação de carga viral
· Reverse transcriptase-PCR amplifica o RNAm, construindo cópias complementares de DNA (cDNA)
 A alta sensibilidade do método PCR, bem como sua especificidade, nos permite amplificar uma sequência-alvo mesmo a partir de amostras com baixo grau de pureza e de quantidades mínimas de DNA, o que torna o método viável não só para pesquisa básica, mas também para a pesquisa aplicada.
 As limitações na sensibilidade e especifidade dos testes aboratoriais parasitológicos e sorológicos, especialmente quando se trata do diagnóstico de fase crônica, explicam o interesse e a necessidade de implantação de um método direto e mais sensível que permita monitorar a presença do parasita e confirmar a etiologia da doença.
Algumas aplicações do PCR:
· Detecção de deleções/inserções determinadas pela geração de produtos amplificados que apresentam alterações em seu tamanho
· Detecção de mutações pontuais (substituição de bases), conhecidas ou não, que geram polimorfismos genéticos podem ser determinadas pela ação das enzimas de restrição ou através do sequenciamento.
· Diagnostico pré-natal ou pré-implantacional (particularmente para doenças herdadas). Ex.: na família da mãe existem casos de fibrose cística, então aqui podemos coletar amostras de líquido amniótico/coleta da vilosidade coriônica para saber se a criança também tem a mutação da fibrose cística. A fertilização in vitro, tira uma célula do embrião e com uma única célula dá para saber se aquele embrião tem ou não alguma doença em particular que os pais tenham interesse em investigar (particularmente para doenças herdadas).
· Na tipagem para transplantes de órgãos e susceptibilidade para doenças auto-imunes especificas (detecção de polimorfismo para HLA)
· No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem genética, como o câncer, através do estudo dos genes relacionados a essas doenças.
· Na medicina forense (DNA figerprint)
· No diagnóstico de doenças infecciosaspor agentes patogênicos diversos.
 Outras aplicações:
· Clonagem de genes ou segmentos de genes da mesma espécie (parálogos) ou de espécies distintas (ortólogos)
· Mutagênese dirigida para estudos de função de proteínas ou sequências regulatórias
· Diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas
· Identificação de indivíduos (teste de paternidade)
· Detecção de contaminação por bactérias, vírus ou fungos
· Quantificar diferenças na expressão de genes (RT-PCR)
 Sequenciador: primeiro amplifica o gene, e depois faz o sequenciamento. O PCR é o início das detecções seguintes. Essa técnica de sequenciamento é antiga; hoje em dia há o sequenciamento de nova geração, que faz isso com muito mais rapidez. Painéis genéticos (todos os genes descritos na literatura que podem desenvolver aquele tipo de doença) estão sendo utilizados para identificar em pessoas que querem identificar doenças hereditárias. 
 O ELISA é mais barato e mais rápido do que o PCR.