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Imunologia – Inflamação e Hipertensão 1 Ana Luiza Azevedo de Paula Imunologia IMUNOLOGIA CASO 05 – SISTEMA IMUNE E HIPERTENSÃO A inflamação é definida como uma reação dos tecidos vascularizados a um agente agressor caracterizada morfologicamente pela saída de líquidos e de células do sangue para o interstício, sendo a resposta inflamatória uma das principais tipos de reação da imunidade inata, além dos mecanismos imunes antivirais. Os Agentes inflamatórios promovem a síntese de moléculas sinalizadoras que induzem os mediadores inflamatórios, resultando em saída de plasma e leucócitos dos vasos e em estímulos para reparar os danos produzidos pelas agressões. É dividida em aguda e crônica.A aguda é a resposta inicial alesão celular e tecidual, predominando fenômenos de aumento de permeabilidade vascular e migração de leucócitos, particularmente neutrófilos. Localmente caracteriza-se pelos sinais cardinais da inflamação e o exemplo mais claro é o abscesso. Se a reação for intensa, pode haver envolvimento regional dos linfonodos e resposta sistêmica na forma de neutrofilia e febre, caracterizando a reação da fase aguda da inflamação. Neutrofilia - é a condição na qual uma pessoa possui no sangue um número aumentado de granulócitos neutrófilos. Todas estas respostas são mediadas por substâncias oriundas do plasma, das células do conjuntivo, do endotélio, dos leucócitos e plaquetas, que regulam a inflamação e são chamados de mediadores químicos da inflamação. A inflamação aguda tem como objetivo principal a eliminação do agente agressor, ocorrendo frequentemente destruição tecidual. Os fenômenos agudos, como o próprio nome diz, são transitórios, havendo posteriormente a regeneração ou cicatrização da área envolvida, ou cronicidade do processo se o agente agressor não for eliminado. COMPONENTES DO PROCESSO INFLAMATÓRIO Embora os processos de resposta inflamatória dependam da natureza precisa do estímulo inicial e de sua localização no corpo, todos compartilham um mecanismo comum, que pode ser resumido da seguinte forma: ▪ Receptores de Padrões Moleculares (PRRs) São moléculas fundamentais para respostas imunes inatas ao reconhecerem danos celulares e patógenos, e que são expressos na superfície celular, em vesículas (endossomos) e no citoplasma. Ana Luiza Azevedo de Paula Medicina 2 Imunologia – Inflamação e Hipertensão Eles podem ser: • Transmembrânico: alocados na membrana celular. Ex.: TLRs (Toll –Like Receptors); • Citoplasmáticos: alocados no citosol. Ex.: NLRs (NOD – Like Receptors) e RLRs (RIG- Like Receptors). PRRS E APOPTOSE A Apoptose ou Morte Celular Programada é um tipo de "autodestruição celular" que requer energia e síntese protéica para a sua execução. Está relacionado com a homeostase na regulação fisiológica do tamanho dos tecidos, exercendo um papel oposto ao da mitose. A ativação das proteases endógenas compromete a integridade do citoesqueleto, provocando verdadeiro colapso da estrutura celular. Em resposta à contração do volume citoplasmático, a membrana celular forma bolhas e se altera o posicionamento de seus lipídios constituintes. A necrose difere da apoptose por representar um fenômeno degenerativo irreversível, causado por um agressão intensa. Trata-se pois da degradação progressiva das estruturas celulares sempre que existam agressões ambientais severas. Diferentes insultos patológicos como isquemia, hipoxia, hipertermia, irradiação e metabólitos tóxicos podem levar à perda abrupta da integridade da membrana plasmática (citólise) e à alteração de seus gradientes eletroquímicos. Ademais, a liberação dos constituintes intracelulares para o meio extracelular estimulam a resposta inflamatória e ampliam a lesão tecidual. CLASSES DE FAMÍLIAS DE PRRS INCLUEM: • Receptores Toll (TLRs) Os receptores Toll-Like são moléculas de superfície, presentes nas células de defesa do hospedeiro, responsáveis pelo reconhecimento de estruturas microbianas e na geração de sinais, que levam à produção de citocinas proinflamatórias essenciais para a ativação das respostas imunes inatas. Embora os receptores Toll-Like desempenhem um papel primordial na defesa do hospedeiro contra os processos infecciosos e inflamatórios, deve haver um equilíbrio entre a ativação e inativação destes receptores para evitar uma resposta inflamatória ou imunológica excessiva, como ocorre nas doenças crônicas inflamatórias e autoimunes sistêmicas, como o lúpus eritematoso sistêmico e a artrite reumatóide. O fator de diferenciação mieloide 88 (MyD88) e o fator de macrófago associado ao tumor (TAM) medeiam a transmissão de sinais, após reconhecimento de PAMPs e DAMPs por receptores TLRs. TLRs ativam cascatas de sinalização intracelulares que levam à translocação nuclear de AP-1 e NF-κB ou IRF3, que regula a resposta inflamatória. • Ativam fagócitos. • Induzem a liberação de citocinas e quimiocinas. • Reconhecem padrões moleculares, geralmente, por interação direta com as moléculas de superfície. Ana Luiza Azevedo de Paula Medicina 3 Imunologia – Inflamação e Hipertensão Ex. TLR4 macrofágico + CD14 = reconhecimento de LPS→ via NFkB→produção sistêmica de TNF-α. Os receptores Toll-Like 1, 2, 4, 5, 6 estão presentes na membrana plasmática, de modo que eles contêm domínios intracelular, devido à presença de proteínas do tipo TIR (MyD88, TIRAP, TRIF e TRAM) e extracelular (repetições ricas em leucina - LRR), enquanto que os receptores Toll-Like 3, 7, 8, 9 e 10 estão localizados intracelularmente, ou seja, nos endossomos e não possuem domínio extracelular. O domínio TIR é requerido para iniciar a geração dos sinais intracelulares, visto que a proteína MyD88 está presente em todos os receptores, exceto no TLR3. Cada receptor Toll-Like tem sua própria via de sinalização intrínseca e induz respostas biológicas específicas contra micro-organismos. Quando algum PAMP é reconhecido por algum receptor Toll-Like específico, a proteína MyD88 recruta as cinases associadas ao receptor da interleucina-1(IRAK-1 e IRAK-4) para ativar o fator associado ao receptor do fator de necrose tumoral (TRAF6). Este ativa o fator de crescimento β associado à cinase 1 (TAK1), que, por sua vez, promove a ativação do complexo IKK formado por duas subunidades catalíticas (IKKα e IKKβ) e por uma subunidade regulatória (NEMO/ IKKγ). Este complexo promove a fosforilação do IκB e a sua degradação resulta no fator de transcrição nuclear (NF-κB), que será translocado ao núcleo para induzir a expressão das citocinas inflamatórias e das moléculas de adesão. As citocinas liberadas em resposta à ativação dos receptores Toll-Like pelos micro- organismos, como exemplo a IL-1 produzida pelos macrófagos e células epiteliais, promovem o recrutamento de leucócitos e outros macrófagos para o local da infecção. A IL-2 liberada pelos linfócitos Th1 promove a ativação dos linfócitos B e a proliferação de células T. As IL-4 e IL-5 produzidas pelos linfócitos Th2 induzem a produção da IgE (permite a degranulação de mastócitos e basófilos, com a liberação de histamina, fatores quimiotáticos para eosinófilos e neutrófilos, além de induzir reações de hipersensibilidade imediata). A IgA (permite a opsonização de parasitas facilitando a fagocitose pelo macrófago e ativação do complemento) respectivamente pelos linfócitos B. A IL-12 produzida por macrófagos e células dendríticas, promove a diferenciação dos linfócitos T em Th1 e a ativação das células NK, ambas responsáveis em secretar o interferon-γ (IFN-γ), que atua na ativação de macrófagos e dos linfócitos TCD8+. •Lectina do tipo C (CLRs) A lectina tipo C é um tipo de domínio proteico de ligação a carboidratos de proteínas lectinas.A designação tipo C refere-se ao seu requisito de cálcio para ligar-se. As proteínas que contêm domínios de lectina tipo C apresentam uma gama diversificada de funções incluindo a adesão célula a célula, resposta imune a patógenos e apoptose. • Receptores do tipo I do gene induzível pelo ácido retinóico (RIG) (RLRs Os receptores do tipo RIG (RLRs) são sensores citosólicos do RNA viral que respondem aos ácidos nucleicos virais induzindo a produção de interferons tipo I antivirais. • Receptores do tipo NOD (NLRs). Complexo multiproteico citoplasmático que ativa caspase. São capazes de reconhecer produtos de células mortas (ATP extracelular, ácido úrico, cristais exógenos, ERO etc.), além de produtos microbianos. 1. Inflamassoma ativado→ 2. Ativa caspase-1→ 3. Clivagem de precursor da IL-1β→ 4. IL-1β ativada recruta leucócitos na resposta aguda. Quando esses receptores de reconhecimento de padrão associados a células se ligam a PAMPs, ativam vias de transdução de sinal que promovem as funções antimicrobianas e pró- Ana Luiza Azevedo de Paula Medicina 4 Imunologia – Inflamação e Hipertensão inflamatórias das células na quais estão expressos. • Moléculas do Complemento ▪ Vias inflamatórias ativadas •Marcadores (mediadores) inflamatórios liberados CÉLULAS INFLAMATÓRIAS RECRUTADAS As primeiras células atraídas para um local de lesão são neutrófilos, seguidas por monócitos, linfócitos e mastócitos. Macrófagos ativados ✓ São fundamentais no início, manutenção e resolução da inflamação. Apresentam antígenos, fagocitam e modulam a resposta imune através de citocinas e fatores de crescimento. Monócitos ✓ Recrutados por fatores quimiotáticos a tecidos lesados, diferenciam-se em macrófagos ou DCs Neutrófilos ✓ Mediadores chave na resposta inflamatória, estimulam APCs a ativarem células T, liberam quimioatratores para monócitos e células dendríticas. Mastócitos ativados ✓Iniciam respostas inflamatórias liberando diversos mediadores inflamatórios (citocinas, quimiocinas, histamina, proteases, prostaglandinas, leucotrienos etc. Células epiteliais e endoteliais ✓ Liberam fatores estimuladores de cascatas inflamatórias, junto com quimiocinas e fatores de crescimento que atraem neutrófilos e monócitos. As Proteínas de fase aguda são uma classe de proteínas cuja concentração plasmática aumenta ( proteínas de fase aguda positivas) ou diminui (proteínas de fase aguda negativas) em resposta à inflamação. Essa resposta é chamada de resposta de fase aguda. As proteínas de fase aguda positivas servem a diversas funções fisiológicas do sistema imune. Algumas agem destruindo ou inibindo o crescimento de micóbios. Ex:Proteína C-reactiva , proteína ligadora de manose (MBP), fatores do complemento, ferritina, ceruloplasmina, amilóide A sérico e haptoglobina. As proteínas de fase aguda negativas tem sua concentração diminuída pela inflamação. Exemplos incluem albumina, transferrina, transtiretina, proteína ligadora de retinol, antitrombina e transcortina. A diminuição de tais proteínas pode ser usada como marcadores de inflamação . O papel fisiológico da diminuição da síntese de tais proteínas é geralmente a economia de aminoácidos para a produção mais efetiva de proteínas de fase aguda; Teoricamente, uma diminuição em transferrina poderia também ser desencadeada por uma regulação positiva dos receptores de transferrina, mas esses aparentemente não mudam com a inflamação. Ana Luiza Azevedo de Paula Medicina 5 Imunologia – Inflamação e Hipertensão PROCESSO INFLAMATÓRIO Toda inflamação começa com uma irritação 1) Agente biológico (PAMP – pathogen associated molecular pattern) – bactérias, virus, parasitas, etc. 2) Do próprio organismo, e induz os tecidos agredidos a liberar moléculas que indicam a presença de agressão (DAMP – damage associated molecular pattern) – subprodutos da necrose celular A intensidade e o tipo de agressão irá direcionar a resposta inflamatória Alguns mediadores são mais universais A inflamação inicia-se com a liberação de substâncias vasoativas que provocam a vasodilatação dos pequenos vasos locais. Esta vasodilatação é precedida de uma vaso constrição passageira de origem nervosa, que é fugaz e sem maiores conseqüências. Além de determinar a vaso dilatação, os mediadores químicos modificam o revestimento endotelial provocando aumento de permeabilidade. As células endoteliais se contraem, abrindo as junções intercelulares. Os vasos ficam dilatados, hiperemiados e com circulação mais lenta. A hiperemia é importante na intensidade da permeabilidade vascular. É a razão principal de se usar gelo após traumatismos, para diminuir o edema. Anestésicos com vaso constritor, não só prolongam o tempo de anestesia, como também diminuem a hemorragia e edema MIGRAÇÃO CELULAR Os leucócitos que se acumulam num foco inflamatório migram seletivamente dos vasos sangüíneos. As células migram através de movimentos ativos, com formação de pseudópodos e ativação de filamentos de actina e miosina, através do aumento do gradiente de Ca++ intracelular, através da participação da fosfolipase C, fosfoinositol e calmodulina. O estímulo para a migração é variável para cada leucócito. A injeção de 0,1% de glicogênio na Ana Luiza Azevedo de Paula Medicina 6 Imunologia – Inflamação e Hipertensão cavidade peritonial, causa após 4h o acúmulo quase que exclusivamente de neutrófilos. A passagem ocorre através das junções intercelulares abertas, sendo mediada por substâncias químicas que atuam nos leucócitos, células endoteliais e tecido conjuntivo. A saída de hemácias ocorre por processo passivo, em vasos que sofreram ruptura, por gradiente de pressão positiva em direção ao espaço extravascular. Embora possa ocorrer concomitantemente, a migração leucocitária pode ocorrer independentemente do extravasamento de líquido plasmático (edema). Moléculas de adesão são expressas nas superfícies dos leucócitos e do endotélio, facilitando a adesão posterior migração. Admite-se que os leucócitos inicialmente rolam sobre a superfície do endotélio (rolagem), posteriormente aderem e migram. Moléculas de adesão do endotélio- Seletinas- têm estrutura similar a lecitinas, ligando-se a açúcares. TIPOS DE EXSUDATO INFLAMATÓRIO: O exsudato inflamatório é composto de proteínas plasmáticas e leucócitos que extravasam dos vasos e se acumulam no local inflamado. Tem a função de destruir o agente agressor, degradar e remover o tecido necrosado. A drenagem linfática fica aumentada, levando mais facilmente antígenos aos linfonodos regionais. Dependendo do local, da intensidade da reação e do agente injuriante, o exsudato pode ter diferentes características. Segundo o tipo de exsudato a inflamação será classificada em: • Exsudação plasmática Possibita a saída de anticorpos e sistema complemento . Fibrinogênio polimeriza, facilitando migração de leucócitos e formando uma barreira contra invasão de microorganismos. Saída de proteínas com potencial de remover proteases e radicais livres (ex.: proteínas de fase aguda). • Exsudação celular É um processo ativo que independe da permeabilidade vascular. Saída de plaquetas e hemácias é passiva, por lesões no endotélio. Células predominantes no exsudato nas primeiras 24 horas: Macrófagos → citocinas → Neutrófilos PMN → citocinas → Monócitos Neutrófilos exsudados produzem quimiocinas (CCL 2, 3, 4, 8, 9, 20 e 23) e atraem os monócitos que passam a ser predominantes em 48 h. Presença decertas citocinas aumenta a meia vida dos neutrófilos e monócitos SEROSA O líquido extravasado tem alto teor aquoso, apresentando pouca quantidade de moléculas protéicas. Este líquido pobre em proteínas além da origem vascular, pode ser produzido também pelas células mesoteliais que recobrem a cavidade pleural, peritoneal e pericárdica. Devido ao seu baixo conteúdo protéico, o exsudato seroso não é detectado histologicamente deixando apenas espaços entre os elementos tissulares. O caso mais comum de inflamação serosa é a queimadura da pele com formação de “bolhas”. Ocorre nas doenças vesículo-bolhosas. FIBRINOSA Quando a lesão vascular é mais intensa permitindo a saída de moléculas grandes, o líquido extravasado será rico em proteínas, especialmente fibrinogênio, formando uma rede de fibrina no território inflamado e é chamado de exsudato fibrinoso. Pode ocorrer na cavidade pericárdica em certas doenças reumáticas ficando o espaço pericárdico preenchido por uma massa de fibrina. Nos pulmões em casos de pneumonia pneumocóccica, os alvéolos podem estar ocupados por uma rede de fibrina com grande quantidade de leucócitos. O exsudato fibrinoso é mais comum nas membranas serosas do pericárdio, pulmão e peritônio. A rede de fibrina pode ser invadida por fibroblastos, substituindo o exsudato fibrinoso por tecido fibroso, que pode interferir nas funções do pulmão e coração. CATARRAL Quando a inflamação ocorre nas superfícies mucosas, há a formação de grande quantidade de muco sendo então chamada de catarral. É Ana Luiza Azevedo de Paula Medicina 7 Imunologia – Inflamação e Hipertensão encontrada, portanto, apenas quando o tecido inflamado é capaz de secretar muco como a nasofaringe, pulmões, trato intestinal, útero e glândulas secretoras de muco. Exemplos comuns de inflamação catarral são a gripe e o resfriado. HEMORRÁGICA Quando há o rompimento da parede vascular, grandes quantidades de hemácias estão presentes no território inflamado. É uma classificação pouco usada. PSEUDOMEMBRANOSA Se caracteriza pela formação de uma falsa membrana composta de fibrina, epitélio necrosado e leucócitos. Resulta da descamação do epitélio juntamente com um exsudato fibrinopurulento. Ocorre apenas nas superfícies mucosas, mais comumente na faringe, laringe, trato respiratório e intestinal. Na difteria ocorre este tipo de inflamação. PURULENTO O exsudato purulento é formado pelo acúmulo de grande quantidade de neutrófilos, que interagem com o agente agressor, geralmente bactérias, provocando a destruição tecidual. A viscosidade do pus é devida em grande parte ao conteúdo de DNA, oriundo dos próprios neutrófilos. Devido a viscosidade, o abscesso é difícil de ser reabsorvido, devendo quando possível ser drenado naturalmente ou cirurgicamente. O pus pode ser formado por agentes químicos, como terebentina e nitrato de prata, mostrando que não é dependente de bactérias. A celulite ou flegmão é uma infecção supurativa disseminada causada pelos estreptococos hemolíticos do grupo A de Lancefield. Deve-se ressaltar que nem sempre há a predominância de um tipo de exsudato, existindo então os tipos mistos que poderão ser chamados de serofibrinosos, fibrinopurulentos, mucopurulentos e assim por diante. REAÇÃO DA FASE AGUDA DA INFLAMAÇÃO Na fase aguda das inflamações, particularmente das mais intensas, há formação de mediadores químicos sistêmicos cujos alvos principais são o fígado e hipotálamo. As citocinas IL-1, IL-6, TNF, IL-8 são os principais mediadores sistêmicos. As ações sistêmicas destas citocinas são mediadas pelas PG e portanto inibidas por anti-inflamatórios não esteroidais. O fígado produz proteínas que são lançadas no sangue e a ação no hipotálamo provoca febre. Reações associadas a febre ou a fase aguda - sonolência, astenia, mialgia, artralgia, cefaléia, anorexia. São os sintomas da gripe. Proteínas hepáticas sofrem aumento como amilóide, PCR (Proteína C Reativa), fibrinogênio e diminuição da albumina. Proteínas da fase aguda também sofrem alteração plasmática após trauma, isquemia, neoplasia e reações de hipersensibilidade. SÍNDROME DA LIBERAÇÃO DE CITOCINAS A liberação maciça de citocinas (IL-1, IL-2, IFN e TNF) tem efeito de cascata produzindo muitas repercussões clínicas graves, podendo levar ao óbito. O melhor exemplo é o choque circulatório provocado por LPS (lipopolissacrídeos) (choque séptico). Pode ocorrer também após traumas graves, grandes cirurgias, queimaduras e pancreatite aguda. As citocinas são liberadas principalmente por células imunes. São classificadas como ILs, fatores estimuladores de colônias (CSF), IFNs, TNFs, TGFs e quimiocinas. A produção excessiva de citocinas inflamatórias pode induzir a danos teciduais, alterações hemodinâmicas, falência de órgãos e, finalmente, morte. Ana Luiza Azevedo de Paula Medicina 8 Imunologia – Inflamação e Hipertensão SISTEMA IMUNE X HIPERTENSÃO A hipertensão arterial é um dos maiores fatores de risco a eventos cérebro e cardiovasculares, com alta prevalência na população mundial. Diversos fatores podem conduzir à elevação da pressão arterial; no entanto, estudos recentes têm demonstrado o papel do sistema imune na modulação da pressão e no surgimento da hipertensão. A infiltração de células imunes nos rins provoca uma inflamação crônica que, por sua vez, altera o sistema de controle da pressão arterial. Além disso, outros estudos revelam que o sistema imune pode provocar mudanças no sistema nervoso central que podem alterar o controle da pressão arterial. Diferentes subtipos de linfócitos estão relacionados à modulação da pressão arterial, bem como à resposta humoral a antígenos que possuem a capacidade de alterar o endotélio. A resposta autoimune também se apresenta como um possível fator causador da hipertensão. Este manuscrito teve por objetivo abordar os mecanismos pelos quais os linfócitos e as respostas humorais contribuem para a modulação da pressão arterial. Evidências apontam que o sistema nervoso simpático, as glândulas suprarrenais, o sistema cardiovascular e diversos hormônios vasoativos contribuem para a patogênese da hipertensão arterial. No passar da última década observou-se que a infiltração de células T (linfócitos T) nos rins e nas artérias é responsável pelas mudanças nos níveis de pressão arterial,e que a inflamação tem um importante componente na patogênese da hipertensão. OS LINFÓCITOS T E HIPERTENSÃO Com os avanços da imunologia e da tecnologia genética nos últi- mos anos, o papel das células T na patogênese da hipertensão passou a fazer parte de diferentes frentes de estudos.11 Diversos subtipos de linfócitos T podem influenciar a pressão arterial por meio da ação das citocinas liberadas pelas células T e outras células que podem ser ativadas pelo sistema imune. As célu- las T se originam a partir de células-tronco hematopoiéticas na medula óssea e amadurecem no timo antes de migrarem para os tecidos. Com base na expressão de proteínas marcadoras de superfície, os linfócitos T podem ser classificados em diferentes subtipos, apresentando funções distintas com base nas proteí- nas que serão expressas. Em termos simplificados, as células T CD4+ são reconhecidas como T auxiliar (células Th) e as células T CD8+ são consideradas células T citotóxicas.1 Em pacientes hipertensos observa-se a infiltração de linfócitos nos rins, associada com o aumento dos níveis circulantes de citocinas (TNF- α, IL-6, IL-4 e IFN-γ). Além disso, em condições inflamatórias crônicas, como no lúpus eritematoso ativo, em que ocorre alta atividade linfocítica, observa-se que em pacientes que não apresentam insuficiência renal ocorre maior prevalência dehipertensão arterial, quando comparada aos pacientes com lupos controlado Pacientes em estágios precoces da hipertensão arterial apre- sentam anticorpos IgG e IgM contra células endoteliais, revelando um possível papel da resposta humoral na patofisiologia da hiper- tensão.As células endoteliais, em seus processos de apoptose, liberam micropartículas que também podem ser reconhecidas pela resposta humoral, e especialmente por anticorpos IgM que têm uma maior afinidade por Ana Luiza Azevedo de Paula Medicina 9 Imunologia – Inflamação e Hipertensão lípides oxidados de membranas que são componentes abundantes nas micropartículas e em células senescentes. O processo de liberação de micropartículas está implicado na elevação crônica da pressão arterial e na senescência das células endoteliais, que são mecanismos importantes para o estabelecimento da hipertensão arterial. Dessa forma, os anticorpos naturais realizam o “clearence” do material derivado do processo apoptótico das células endoteliais e seus títulos elevados podem refletir a disfunção endotelial e também o grau da hipertensão arterial. O processo oxidativo que contribui para o estabelecimento da hipertensão arterial também contribui para a oxidação das partículas de LDL, que, adentrando a íntima vascular, recrutarão células imunes, iniciando o processo de aterosclerose. O sistema humoral pode reconhecer essas partículas de LDL oxidadas de forma semelhante às células apoptóticas discutidas acima, iniciando uma resposta por anticorpos anti- oxLDL dos tipos IgG e IgM, mais especificamente contra os epítopos formados durante o processo de oxidação. A redução da pressão arterial pode modular a resposta humoral por IgGanti-oxLDL e que fatores metabólicos associados à obesidade podem também modificar a resposta imune de pacientes com maior grau de hipertensão. Fontes: https://w2.fop.unicamp.br/ddo/patologia/downloads/db301_ un4_InflamAguda.pdf http://docs.bvsalud.org/biblioref/2018/03/881234/rbh_v22n 3_93-97.pdf http://revodonto.bvsalud.org/scielo.php?script=sci_arttext& pid=S1981-86372011000400019&lng=en&nrm=iso
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