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Encontro 4: O Laboratório de Microbiologia
Prof. Gustavo Wildes
Gustavo Wildes
O AMBIENTE DE TRABALHO
Conduta ética e profissional
Equipamentos de Proteção Individual
Limpeza e Organização
Riscos ocupacionais
INSTRUMENTOS DE PESQUISA
Equipamentos mais utilizados em Microbiologia
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Coleta de Amostras
Inoculação
Cultivo
Meios de Cultura
Técnicas Assépticas
Técnicas de Isolamento de Microrganismos
Técnicas de Quantificação
Identificação de Microrganismos
ATIVIDADES PRÁTICAS
Preparo de Meios de Cultivo
Preparo de Infusão de vegetais e solo
Inoculação em Meios Sólidos em Placas
ATIVIDADE DE REVISÃO
Sumário:
Gustavo Wildes
Conduta ética e profissional
O AMBIENTE DE TRABALHO
• O laboratório é um local sério e perigoso (sem brincadeiras e discussões inúteis). 
• É obrigatório o uso de EPI’s durante atividades potencialmente perigosas.
• Não usar pulseiras, anéis ou quaisquer adereços nas mãos, braços e pescoço.
• Não fumar, comer ou beber dentro do laboratório.
• É proibido o uso de aparelhos eletrônicos não diretamente relacionados à aula. 
• Usar sapatos fechados e cabelos presos;
• Não provar, inalar ou tocar qualquer substância desconhecida ou perigosa; 
• Não retirar ou introduzir nenhum item ao laboratório sem autorização;
• Não é permitida a entrada de animais, plantas ou pessoas não autorizadas;
• Não fazer uso indevido ou não autorizado de qualquer item do laboratório; 
• Comunicar imediatamente ao professor qualquer acidente ou situação perigosa.
Gustavo Wildes
Equipamentos de Proteção Individual
O AMBIENTE DE TRABALHO
Gustavo Wildes
Limpeza e Organização
O AMBIENTE DE TRABALHO
• Respeitar a sinalização, normas ou avisos presentes nos laboratórios. 
• Lavar bem as mãos antes e após as atividades práticas. 
• Isolar, proteger e identificar todo material quebrado ou em mau funcionamento. 
• Não jogar em pias quaisquer resíduos corrosivos, infectantes ou poluentes;
• Identificar materiais ou experimentos em andamento.
Ao término das atividades, deixar os equipamentos e a 
bancada nas mesmas condições encontradas.
Gustavo Wildes
Riscos ocupacionais
O AMBIENTE DE TRABALHO
O Mapa de Riscos afixado em ambientes públicos e privados são representações 
gráficas de um conjunto de fatores presentes nos locais de trabalho, capazes de 
acarretar prejuízos à saúde dos trabalhadores (acidentes e doenças). 
Tais fatores têm origem nos diversos elementos do processo de trabalho 
(materiais, equipamentos, instalações e espaço físico) e no gerenciamento do 
trabalho (intensidade, métodos, posturas, jornadas, treinamentos, etc.).
Além do mapa de riscos, o aluno deve estar atento aos demais Símbolos de 
Segurança espalhados pelo laboratório, em equipamentos e rótulos de produtos.
Gustavo Wildes
Equipamentos mais utilizados em Microbiologia
INSTRUMENTOS DE PESQUISA
• Bico de Gás: utilizado para esterilização direta de alças de transferência, lâminas, 
tubos, etc. A área ao redor da chama, por ser um ambiente estéril, é utilizada para 
manipulação asséptica de equipamentos.
• Erlenmeyer: frasco utilizado no preparo de meios de cultivo e soluções 
complementares que precisem ser esterilizadas em alta temperatura. A abertura do 
frasco é protegida com material apropriado.
• Placa de Petri: recipiente transparente, composto por uma base e uma tampa. 
Utilizada para cultivar microrganismos em meio-sólido e também para observações 
em microscópios estereoscópicos (lupa).
Gustavo Wildes
Equipamentos mais utilizados em Microbiologia
INSTRUMENTOS DE PESQUISA
• Alça e agulha de transferência: de metal ou descartáveis, são utilizados para
transferir microrganismos de um meio para outro. A alça é usada para espalhar e
agulha para perfurar o meio de cultivo.
• Tubo de Ensaio: cultivo de microrganismos em meios líquidos ou sólidos,
principalmente para estoque. Também é usado para esterilizar líquidos em geral
(água, salina, etc.).
• Suporte de coloração: nele, são posicionadas lâminas de microscopia para
gotejamento de corantes.
• Lâminas de microscopia: utilizada para confecção de preparações a serem
observadas ao microscópio óptico. É utilizada também como suporte para blocos de
Agar no cultivo de fungos filamentosos.
• Lamínula: fina película de vidro colocada sobre preparações líquidas em lâminas
de microscopia. Além de espalhar melhor os líquidos, evita que sequem rápido.
Gustavo Wildes
Equipamentos mais utilizados em Microbiologia
INSTRUMENTOS DE PESQUISA
• Microscópio óptico: aparelho composto por lentes sobrepostas capazes de ampliar em 
centenas de vezes uma imagem. Nele, a luz atravessa a preparação, portanto, a mesma 
deve ser translúcida.
• Estufa de incubação: com temperatura controlada, serve para manter placas e tubos 
contendo meio de cultivo e microrganismos para que haja o crescimento.
• Autoclave: equipamento utilizado para esterilizar ou descontaminar materiais e meios 
de cultivo, agindo através de temperatura e pressão altas.
• Contador de colônias: facilita a contagem de colônias em placas de petri.
• Jarra anaeróbica: para cultivo de microrganismos em ambiente com ausência total (ou 
quase total) de oxigênio.
• Agitador de tubos: permite uma agitação uniforme de soluções e meios de cultivo.
Gustavo Wildes
Coleta de Amostras
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
• Uso de “swabs” para coleta em superfícies, secreções, fendas, etc.
• Coleta direta de amostras de água ou solo em recipientes adequados.
• Coleta direta de fluidos corpóreos, fezes, biópsias, etc.
• Exposição de placas ao ar por determinado tempo.
Um microbiologista pode analisar a presença, quantidade ou ação dos 
microrganismos em diversos ambientes: água, ar, solo, na superfície ou interior de 
seres vivos, etc. Desta maneira, cada local de origem dos microrganismos exige um 
ou mais técnicas de coleta. Dentre as mais comuns estão:
Gustavo Wildes
Inoculação
• Inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a
transferência de um determinado número de microrganismos para um meio de cultura
a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificação.
• A origem dos microrganismos a serem inoculados é diversa, podendo ser outro
meio de cultura (estoque ou de uma cultura mista) ou diretamente do ambiente,
feridas, objetos contaminados, alimentos, etc.
• A inoculação das bactérias nos diferentes meios envolve várias técnicas de
semeadura.
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Gustavo Wildes
Cultivo
Os microrganismos coletados podem ser analisados diretamente nas amostras ou 
podem precisar ser cultivados em laboratório para possibilitar análises mais precisas, 
estudos do comportamento e metabolismos, resposta a substâncias, etc.
Existem diversas técnicas de cultivo e estas variam de acordo com o tipo de 
microrganismos ou quanto ao objetivo do estudo ou análise a ser feita.
• Uso de meios de cultivo (ou meio de cultura);
• Infusões (água e solo, água e vegetais, etc.);
• Tecidos ou hospedeiros vivos;
• Substratos orgânicos;
Após definir o meio de cultivo, a incubação deve considerar:
• Temperatura
• pH
• Atmosfera (aeróbicos, anaeróbicos, etc.)
• Tempo de crescimento
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Gustavo Wildes
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Infusões
São preparações feitas com o objetivo de cultivar microrganismos, principalmente 
protozoários, através da imersão total ou parcial de raízes, folhas ou frutos, solo, etc. 
em água (sem cloro) ou solução salina. 
A água coletada diretamente de rios e lagos é aconselhada quando se pretende 
observar a microbiota local ou quando o local da coleta não é importante.
Gustavo Wildes
Meios de Cultura
Destinam-se ao cultivo de microrganismos fornecendo os principais nutrientes e 
condições indispensáveis ao seu crescimento, dentre eles, uma fonte de carbono e 
energia (geralmente um açúcar). 
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Exemplos de meios utilizados em análise microbiológica do solo:
• Meio de Bunt e Rovira (1955), para contagem de UFC de bactérias
totais;
• Meio de Martin (1950), para contagem de UFC de fungos totais;
• Meio de Schmidt e Belser (1982), contagem do NMP de bactérias nitrificantes;
• Meio de Alexander (1965), contagem do NMP de bactérias desnitrificantes;
Gustavo Wildes
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Classificação dos meios quanto ao Estado Físico
• Sólidos: contém agentes solidificantes (principalmente Agar, de 1 a 2%), onde os 
microrganismos semeados formarão colônias na superfície do meio, permitindo 
melhor observação de características macroscópicas, isolamento e transferência.
• Semi-sólidos: pouco solidificante (0,1 a 0,5%) confere consistência intermediária e 
permite cultivar microrganismos em teores variados de oxigênio, dotados de 
motilidade e também ou pode ser usado na conservação de culturas.
• Líquidos: também chamados de “caldo”, não possuem solidificantes. Utilizados para 
ativação de culturas conservadas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas, 
verificação de produção de gás, dentre outros.
Gustavo Wildes
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Classificação dos meios quanto à Composição Química
• Simples ou básicos: contendo apenas nutrientes e condições básicas. São muito 
usados como base para a formulação de outros meios personalizados, onde são 
adicionados outros nutrientes (extrato de vegetais, legumes, solo, etc.).
• Naturais ou Complexos: usa ingredientes com composição química não definida, tais 
como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubérculos, peptona de soja, etc.) 
de animais (carne, cérebro, fígado, caseína, etc.) e de microrganismos (levedura).
Classificação dos meios quanto à Finalidade
• Pré-enriquecimento: microrganismos injuriados, pós tratamento químico ou térmico.
• Enriquecimento: microrganismos em baixo número na amostra ou de crescimento lento.
• Diferenciais: possibilita diferençar microrganismos muito parecidos entre si.
• Seletivos: possuem substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos.
• Identificação: prestam-se para a realização de provas bioquímicas.
Gustavo Wildes
Técnicas Assépticas
• Para garantir que apenas os microrganismos de interesse sejam “semeados”, são utilizadas 
asTécnicas assépticas, procedimentos que evitam a contaminação de materiais, meios e culturas 
prévias:
 Fazer a desinfecção da área de trabalho e das mãos antes e depois de qualquer trabalho.
 Utilização de meios de cultivo e vidrarias previamente esterilizados.
 Manipular os materiais próximo à chama (área estéril) ou em capela de fluxo laminar.
 Esterilizar (flambar) alças de transferências antes e depois da semeadura.
 Esterilizar (flambar) as bordas dos tubos de ensaio e frascos.
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Gustavo Wildes
Técnicas de Isolamento de Microrganismos
• Coleta feita em objetos, secreções e superfícies em geral, utiliza-se um “swab” esterilizado que 
posteriormente poderá ser esfregado em uma placa com meio sólido ou agitado em um meio 
líquido estéril, dentro de um tubo.
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Gustavo Wildes
Técnicas de Isolamento de Microrganismos
• Para isolar uma colônia de uma placa ou tubo com meio sólido previamente cultivados, utiliza-
se a alça de transferência. Coleta-se um pouco da colônia de origem e faz-se uma estria na placa ou 
tubo de destino, da borda para o centro da placa (ou do fundo para a borda do tubo).
• A estria pode ser realizada em movimentos de zigue-zague ou em linha reta ou ainda, podem 
ser feitas estrias simples ou múltiplas, dependendo da quantidade de microrganismos da amostra.
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Gustavo Wildes
Técnicas de Quantificação
• Isolamento de microrganismos presentes em alimentos, solo, água, etc. pode ser feito através 
de diluições prévias do material e posterior inoculação em placas ou tubos com pipetas estéreis.
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Gustavo Wildes
• O espalhamento em placas pode diferenciar microrganismos aeróbicos de anaeróbicos.
 Spread-Plate (superfície): os microrganismos são pipetados sobre um meio sólido e 
espalhados com auxílio de uma alça de Drigalski (esterilizada).
 Pour-Plate (profundidade): para microrganismos anaeróbicos, onde o Agar deverá ser 
colocado ainda líquido, à temperatura de 45-50°C sobre o inóculo.
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Técnicas de Quantificação
Gustavo Wildes
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
• Turbidez de meios líquidos
• Carbono da biomassa microbiana
• Atividade respiratória microbiana (carbono do CO2 liberado)
• Atividade nitrificante 
• Atividade solubilizadora de fosfato 
• Atividade enzimática da urease
• Atividade enzimática da fosfatase ácida
• Atividade enzimática da desidrogenase. 
Métodos Indiretos de Quantificação
Gustavo Wildes
Identificação de Microrganismos
Características morfotintoriais:
• As colorações simples tornam possível a visualização das bactérias ao microscópio.
• Colorações diferenciais tornam possível distinguir entre organismos de morfologia similar.
A coloração diferencial mais conhecida e utilizada, desenvolvida por Christian Gram (1884),
permite a divisão das bactérias em dois grandes grupos de acordo com a composição de sua
parede celular: Gram Positivos (retém a cor roxa) e Gram negativos (retém a cor rosa).
A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das bactérias é
uma etapa inicial e de grande importância, no entanto, a Identificação completa de uma bactéria
sempre necessitará de outros dados fisiológicos e/ou genéticos da mesma:
• Provas bioquímicas: Catalase, Oxidase, Coagulase, hemólise, fermentações, etc.
• Provas imunoquímicas: reação antigênica (Ex: Estreptococos beta hemolíticos)
• Motilidade (movimento)
• Aerobiose: aeróbicos estritos, microaerófilos, anaeróbios, etc.
TÉCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
Gustavo Wildes
Objetivos: tornar o aluno capaz de preparar um meio de cultivo comercial ou supervisionar o preparo 
do mesmo, identificando e prevendo causas de falhas no processo.
Materiais: Placas ou Tubos de ensaio, Meio de cultivo comercial, Água destilada, Proveta graduada 
(100mL), Erlenmeyer (100mL), Balança de precisão, Espátula, Papel alumínio (5x5cm), Papel Kraft 
(5x5cm), Barbante (20 cm), Autoclave, Bico de Bunsen, Isqueiro, Marcador permanente, Luvas térmicas.
Procedimentos: 
1. Calcular a quantidade de água de acordo com o número de placas/tubos a serem preparados:
• 20 ml por placa de 10 cm, 4 ml por tubo de 1,5 x 15 cm ou 6 ml por tubo de 1,8 x 18 cm.
2. Medir a água em uma proveta e transferir para um frasco erlenmeyer.
3. Verificar no rótulo do meio a quantidade ideal para 1 litro e recalcular (“regra de três”).
4. Pesar em balança com precisão de no mínimo 0,1g e adicionar ao frasco Erlemeyer.
5. Homogeneizar em movimentos circulares e tampar com papel alumínio, papel Kraft e barbante.
6. Esterilizar o meio em autoclave a 121°C por 15 minutos.
7. Esfriar a uma temperatura entre 45º e 50º C e distribuir o Agar nas placas nesta temperatura.
• Obs.: no preparo de meio em tubos, estes são distribuídos antes de irem à autoclave.
8. Identificar (na tampa, quando em placas) com o nome do meio e a data de preparo.
9. Deixar as placas/tubos esfriarem a temperatura ambiente por 24 horas.
10.Armazenar os meios a uma temperatura entre 2º e 8°C.
• Obs.: Placas devem ser armazenadas em posição invertida (tampa em baixo e fundo em cima).
ATIVIDADES PRÁTICAS
Preparo de Meios de Cultivo
Gustavo Wildes
Objetivos: preparar uma ão de vegetais e/ou solo para posterior 
observação de protozoários vivos em microscópio óptico.
Materiais:
• Becker (500 mL)
• Gaze ou pano fino com diâmetro superior ao do Becker.
• 300 mL de Água (mineral, filtrada ou solução salina).
• Amostras: Vegetais diversos (preferência com raiz e solo), água de aquário, 
lago ou rio.
Procedimentos: 
1. Mergulhe as amostras de vegetais e solo na água/salina dentro do Becker.
2. Identifique e cubra o béquer com a gaze para evitar a presença de moscas no 
interior.
3. Mantenha
em temperatura ambiente (18 a 21°C), sem incidência direta de luz 
solar por 7 dias.
ATIVIDADES PRÁTICAS
Preparo de Infusão de vegetais e solo
Gustavo Wildes
Objetivos: inocular microrganismos em meios sólidos em posição inclinada para confecção de 
cultura estoque ou análises microbiológicas.
Materiais:
• Culturas prévias: Tubo de ensaio (meio líquido) ou placa de petri (meio sólido).
• Bico de Bunsen.
• Fósforos ou Isqueiro.
• Alça de transferência (níquel cromo ou platina).
• Placa com meio de cultura EMB (Eosina Azul de Metileno) estéril.
• Estufa microbiológica.
Procedimentos: 
1. Esterilizar a alça de transferência com a mão direita e esperar que esfrie próximo à chama.
2. Abrir o tubo ou placa de origem próximo da chama com a mão esquerda (pessoas destras).
3. Coletar um pouco do meio líquido (uma alçada apenas).
4. Fechar o tubo ainda próxima à chama e colocá-lo de volta na estante.
5. Com a mão esquerda, abra a placa de destino próximo a chama.
6. Faça estrias que ocupem ¼ da placa, no sentido borda  centro.
ATIVIDADES PRÁTICAS
Inoculação em Meios Sólidos em Placas
Gustavo Wildes
ATIVIDADE DE REVISÃO
1. Cite 3 EPI’s que você julga indispensáveis às práticas de microbiologia e explique o 
porque.
2. Em microbiologia, o que significa o termo "inoculação"?
3. Quais as maneiras de se cultivar microrganismos em laboratório?
4. Como podem ser classificados os meios de cultivo?
5. Por que devem ser realizadas as Técnicas assépticas?
6. Qual a importância das Técnicas de isolamento?
7. Quais as principais maneiras para se isolar espécies de maior interesse?
8. Qual a importância das colorações em microbiologia?
9. Como é feita, de maneira geral, a Identificação de microrganismos?
10. O que a coloração diferencial de GRAM permite visualizar e diferenciar?
Gustavo Wildes