Cromatografia: Técnica de Separação

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CROMATOGRAFIA: Técnica de separação baseada na distribuição dos componentes de uma 
mistura entre um fluído (fase móvel ou eluente) e um adsorvente (fase estacionária = sólido ou 
líquido depositado em um sólido inerte empacotado em uma coluna ou espalhado por uma 
superfície). 
• Formação de bandas de cores diferentes nas colunas devido à absorção diferencial dos 
pigmentos corados: percolam com velocidades diferentes e emergem separadamente da 
coluna 
1. PRINCIPAIS TÉCNICAS: 
1.1. Modo de separação: cromatografia de adsorção, de partição, de troca iônica, de 
exclusão molecular, de permeação em gel e de afinidade. 
1.2. Cromatografia Líquida: técnica para a separação dos componentes de soluções líquidas 
para fins analíticos. 
• A amostra é injetada com uma microsseringa, e é homogeneamente distribuída no 
topo da coluna. A fase móvel transportando a amostra é forçada a percolar através da 
coluna por uma ação externa, que pode ser: uma simples força da gravidade 
(cromatografia de baixa pressão) ou uma força intensa gerada por bombas (de alta 
pressão) HPLC; que supera a resistência da coluna ao escoamento da fase móvel. Na 
percolação, os componentes migram com velocidades diferentes, sendo identificados 
na saída da coluna, num detector que registra a composição da amostra analisada. 
• Os principais detectores são: UV, de fluorescência, o de índice de refração, 
eletroquímico e de massas. 
• Cromatografia de fase normal: fase estacionária mais polar que a fase móvel. 
• Cromatografia de fase reversa: fase estacionária menos polar que a fase móvel. 
• Os adsorventes mais usados na de fase normal são a sílica e a alumina e na reversa são 
substâncias polares quimicamente ligadas (sílica + longa Cad. Car.). Os eluentes: 
metanol, água, e acetonitrila. 
• O modo de operação mais usado é a cromat. de eluição: eluente flui pela coluna e a 
amostra é injetada no eluente. Os componentes dela se deslocam pela coluna com 
diferentes velocidades, segundo o grau de afinidade com o solvente, e são separados 
na saída da coluna, identificados como uma sucessão de picos no cromatograma. 
1.3 Cromatografia Planar: 
• EM PAPEL: separação dos componentes de uma mistura e realização da análise quanli 
em função dos fatores de retenção e cores. Técnica simples, requer poucos 
instrumentos, porém maiores restrições para a sua utilização em termos analíticos. 
*Substâncias polares interagem mais com solventes polares e vice-versa. Variando a 
polaridade do solvente, separam-se os componentes da amostra. 
• EM CAMADA DELGADA: (CCD) separação pela diferença de afinidade dos componentes 
de uma mistura pela fase estacionária. Método simples, rápido, visual e econômico, 
muito escolhido para o acompanhamento de reações orgânicas e para a purificação e 
identificação de frações coletadas em cromat. líquida. 
* O fator de retenção (Rf) é um parâmetro muito importante; razão entre a distância 
percorrida pela substância e distância percorrida pela fase móvel. 
*Sílica gel é a fase estacionária. E a escolha da móvel não é simples pois as mais usadas 
são muito polares (não devem ser utilizados solventes pouco polares pois não 
removeriam os compostos do ponto de aplicação e nem muito polar pois são capazes 
de arrastar todos até o topo da placa) por isso se faz a mistura. 
*Os compostos org. são incolores, para a análise, se faz um processo de revelação: 
placas com fase estac. fluorescentes, composto analisado é fluorescente ou o iodo é 
colocado na placa, pois ao se complexar, apresenta pontos marrons. 
 
 
CROMATOGRAFIA GASOSA: 
1. O QUE É? 
• Separação de substâncias voláteis e termicamente estáveis arrastadas por um gás 
através de uma fase estacionária (sólido adsorvente ou líquido pouco volátil que distribui os 
componentes entre as 2 fases através de processos como adsorção, diferenças de 
solubilidades e volatilidade. A fase móvel (gás de arraste) transporta a amostra da coluna até o 
detector, onde os componentes são separados e detectados. Mais usados: H2, N2, He, Argônio. 
• A amostra é vaporizada e introduzida num fluxo de gás adequado (gás de arraste). O 
fluxo passa por um tubo com a fase estacionária (coluna cromatográfica), onde a mistura é 
separada. 
2. CROMATOGRAMA: 
• Registro gráfico da análise. 
• Indica: * Tempo de retenção e área do pico; 
 * Concentração de cada componente da amostra; 
 * Aumentando a concentração dos componentes, aumenta proporcionalmente 
a área do pico do componente; 
 * Informações importantes sobre o desempenho da separação; 
• Tempo de retenção= tempo transcorrido desde a injeção até o máximo do pico obtido. 
3. TEMPERATURA DO FORNO (COLUNA): 
• Análise isotérmica: temperatura constante do forno do início ao final da análise (picos 
mais juntos – difícil de identificar) 
• Programação de temperatura: temperatura é alterada durante a análise (picos mais 
separados – melhor visualização). TI: bem inferior ao PE do mais volátil / TF: próxima 
ao PE do mais volátil. 
4. EFICIÊNCIA = CAPACIDADE DE ELUIÇÃO COM O MÍNIMO DE DISPERÇÃO DO ANALITO. 
5. EFEITOS DE ALARGAMENTO DOS PICOS = SEPARAÇÃO DEFICINTE COM RETENÇÕES 
PRÓXIMAS E OS PICOS MAIS LARGOS E MENOS INTENSOS GERAM MENOR DETECTABILIDADE. 
6. GÁS DE ARRASTE: 
• Parâmetros para a seleção: Não interagir com a fase estacionária nem com a amostra 
 Adequado ao detector 
 Custo acessível e estar disponível no mercado 
 Pureza 
7. SISTEMAS DE INJEÇÃO DE AMOSTRAS: 
• Parte do cromatógrafo onde a amostra é introduzida. 
• Vaporiza a amostra 
• Mistura vapor com a fase móvel 
• Transfere o vapor para dentro da coluna. 
• A temperatura do injetor deve ser: Suficiente para vaporizar rapidamente a amostra. 
 Não deve decompor, contaminar, nem perder a amostra. 
 30 a 50ºC acima do PE do composto menos volátil. 
• Formas simples: Câmara de aquecimento, Injetor liner/glass insert e linhas de fluxo de 
gás. 
• A forma de injeção é muito importante e existem diversos modelos de acordo com as 
características das operações, como: quantidade de amostra, diâmetro da coluna, 
espessura da fase líquida da coluna, concentração e estabilidade térmica. 
 
 
 
7.1. MODOS DE INJEÇÃO: 
• Injeção Split: Proporciona a vaporização instantânea da amostra. Vantagem: previne a 
introdução de compostos não voláteis da amostra e pico com bom formato. Desvantagem: 
discrimina os compostos com alto ponto de ebulição e termicamente estáveis e não serve 
para uma análise quanti. Utilizado para amostras com concentrações elevadas, e a injeção é 
feita a quente. Alguns efeitos indesejáveis são minimizados pelo liner: maior eficiência na 
transferência de calor para amostra, mistura total da amostra com gás de arraste, 
material não volátil não alcança a coluna. 
• Injeção Splitless: Recomendada para amostras muito diluídas, semi-voláteis e análises 
de traços (compostos a nível traço). A amostra é vaporizada no injetor e arrastada para a 
coluna. PE do solvente deve ser menor do que o PE dos componentes da amostra. 
• Injeção on-column: Injeção a frio, boa para compostos termicamente instáveis. A 
amostra é introduzida como líquido diretamente na cabeça da coluna. Não há 
discriminação dos componentes com alto PE, minimiza decomposição (perda) dos 
compostos instáveis e a rápida contaminação da coluna por compostos não voláteis. 
Melhor para amostras limpas e diluídas. 
• Glass Insert: se usa para eliminar contato da amostra com metal e aquecer 
uniformemente para melhorar vaporização da amostra. 
• Injeção com válvula de amostragem/loop: utilizada no controle de processos, onde 
amostras gasosas ou líquidas fluem continuamente por uma aspiral. As vezes é necessário 
concentrar a amostra. 
8. DETECTORES: 
Sua função é acusar a presença e medir a quantidade de componentes no efluente da 
coluna. Algumas características são importantes na seleção do tipo de detector, escolhe-se 
quemelhor atende ao tipo de análise: Sensibilidade, Seletividade, Ruído, Quantidade 
mínima detectável, Faixa linear, etc. Podem ser destrutivos ou não, específicos, universais, 
seletivos. 
A escolha é em função de: tipos de amostra (famílias químicas), faixa de concentração, 
analise quali ou quanti ou ambas, custo, destrutivo ou não. 
8.1. TIPOS DE DETECTORES: 
• DETECTOR DE IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC ou FID): formação de íons quando um 
composto é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio (ar sintético). 
*Gás de arraste: He, H2 ou N2. 
*Destrutivo, seletivo, altamente sensível e excelente estabilidade. 
*Heteroátomos diminui sua resposta. 
*Principal indicação: hidrocarbonetos. 
*Análises de álcool e ésteres, monômeros, combustíveis. 
*Não detecta CO, CO2, O2, N2, H2O. 
• DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT): variação da condutividade térmica do 
gás de arraste. O corpo quente perde calor a uma velocidade que depende da 
composição dos gases que o circundam. A velocidade de perda pode ser usada como 
medida da composição do gás. 
*Detectores de resposta universal, sensíveis (não tanto quanto o FID) a concentração e 
estáveis. 
* Gás de arraste: H2 ou He (alta condutividade térmica). 
*Mais fácil de estragar do que o FID. 
*Detecta CO, CO2, O2, N2, H2O 
• DETECTOR DE CAPTURA DE ELÉ TRONS (ECD): 
*Seletivo, não destrutivo e estável e sensível. 
*Responde bem a substâncias com átomos eletronegativos: halogenados, oxigenados 
e organoclorados. 
*Fácil de estragar. 
*Gás de arraste: N2. 
* H2O e O2 afetam a sensibilidade (é facilmente contaminado). 
• DETECTOR SELETIVO DE MASSAS (MS): os picos eluídos da coluna passam por 
bombardeamento de elétrons que acarreta na fragmentação em íons. Os íons 
formados são separados e detectados no espectro de massas. 
*Destrutivo, universal, alto preço, sensível. 
*Excelente para análises qualitativas 
*Fornece informações sobre a estrutura da substância (espectro de massas). 
*Limitações: só analisa amostras com massa maior de 12 u.m.a. 
• Detector Termiônico (NPD): o gás de arraste é o nitrogênio e o hélio. Estabilidade 
regular e é destrutivo. Detecta composto com P ou N na estrutura. 
• Detector de Fotoionização (PID): Específico para compostos ionizados por UV. 
Estabilidade razoável e não destrutivo. 
9. COLUNAS: nela ocorre o processo de separação dos componentes da amostra, sendo 
composta por 3 partes: tubo cilíndrico, suporte sólido e fase estacionária. 
Critérios de escolha: Quais são as substâncias que serão separadas; temperatura de trabalho 
(até por causa da fase estacionária, já que há amostras com PF muito alto); polaridade; grau de 
resolução e eficiência desejados; custo; tipo de análise; precisa separar isômeros?. Regra: 
coluna mais parecida com a polaridade da maioria dos componentes da amostra. 
9.1 TIPOS DE COLUNAS: 
• Colunas empacotadas (vidro): A coluna é recheada com um sólido podendo ter uma 
grande superfície adsorvente (com ou sem líquido dentro) – cromatografia de 
adsorção; ou o sólido pode ter uma fina camada líquida – cromatografia de partição. O 
processo é mais demorado, pois o gás de arraste deve passar por todo o recheio e 
atravessar. 
• Colunas capilares (tubular aberta): o diâmetro é muito pequeno, assim pouca amostra 
precisa ser injetada e a analise é mais rápida. Em geral as fases estacionárias são 
polímeros líquidos suportados nas paredes internas. Algumas possuem uma fase 
quimicamente ligada ao tubo, sendo mais resistente. Podem ser classificadas de 
acordo com a fixação da fase estacionária: 
* SCOT: fase líquida suportada em partículas finas de um sólido inerte, maior diâmetro 
pelo tamanho das partículas dos suportes sólidos revestidos pela fase líquida, maior 
capacidade de amostra, compostos voláteis. 
* WCOT: fase líquida suportada nas paredes internas, menos diâmetro. 
* FQL: fase estacionária ligada (lig. covalente) ás paredes internas de sílica fundida. 
Permite altas temperaturas sem provocar a sangria, dura mais. 
*PLOT: para cromatografia gás-sólido. 
• Cromatografia de adsorção (gás-sólido): o mecanismo de interação, soluto/fase 
estacionária, envolve adsorção na superfície do sólido poroso. É indicada para gases de baixo 
peso molecular. 
 *Peneira molecular: Separação de He, O2, CH4, N2 e CO. 
* Sílica gel: Ar, H2, CO, CH4 e outros hidrocarbonetos. 
*Carbopack (grafitizado): superfície apolar, separa por diferença geométrica e 
polaridade. 
*Porapak Q: melhor fase para separar água. 
• Cromatografia de partição ou gá-líquido: o mecanismo de interação envolve a 
partição da amostra entre o gás (fase móvel) e o líquido (fase estacionária). A fase 
líquida deve estar suportada ou nas paredes ou em um sólido poroso e inerte. Fase 
líquida: elevado PE, baixa viscosidade, solubilização diferenciada da amostra. Suporte 
sólido: grande superfície específica, inércia química, estabilidade térmica, não absorver 
a amostra, resistência mecânica e partículas uniformes. Quando não se sabe o que 
tem na amostra, escolha a coluna com baixa polaridade. 
*Sempre obter informações sobre a amostra: componentes prováveis, faixa de 
ebulição, polaridades e estrutura química. SEMELHANTE DISSOLVE SEMELHANTE: 
quanto mais semelhança entre a fase líquida e a amostra, mais simples a separação e 
maior a eficiência. 
 
10. RESOLUÇÃO E EFICIÊNCIA: 
a) Resolução (R): expressa o quanto 2 picos estão separados. 
 
 R= 1 = 90% de separação 
 R= 1,3/1,5 = separação OK 
 R= 5 = MUITO separado 
 Aumentando a temperatura, diminui o R. 
 Tr= tempo de retenção 
 Wb= largura do pico da linha base 
b) Eficiência (pratos teóricos): capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito. 
O poder de separação de uma coluna dependerá das trocas entre a amostra e a fase líquida. 
Quanto mais etapas de equilíbrio, melhor a separação. Coluna eficiente tem um número alto 
de pratos teóricos (N). 
 
N= 16 . (tr/Wb)2 ou HETP = altura equivalente de prato teórico (H) 
 H= L/N, sendo L= comprimento da coluna em cm 
 Quanto menor H, melhor! 
11. ANÁLISE QUALITATIVA: junto com outras técnicas, a cromatografia gasosa identifica muito 
bem os componentes da amostra. FATORES QUE DEVEM SER CONSIDERADOS ANTES DA 
ANÁLISE: origem da amostra, composição, pH, curva de destilação, solubilidade, 
polaridade. 
• Como identificar as substâncias separadas na coluna e listadas no cromatograma? 
 *Usando detector de massas; 
 *Comparando tempos de retenção de padrões (ou misturas de padrões) com os obtidos nos 
analitos em questão. DEVEM ser usadas as mesmas condições de análise: temperatura (forno, 
injetor e detector), vazões dos gases, volume de amostra e coluna. 
 *Co-injeção de padrões: amostra+ alíquota de padrão (que suspeita-se ser a substância em 
questão) = nova injeção. Caso a área tenha aumentado se trata da substancia testada, se 
apareceu outro pico, não se trata. 
 
RAMPA DE TEMPERATURA ou taxa de programação de temperatura: 
 
 
 
 tr 
 Wb1 Wb2 
R= tr/ média da 
largura dos picos 
 
M= (Wb1+Wb2)/2 
40°C 
3min 
70°C 
X°C/min 
 
12. PREPARO DE AMOSTRAS: em CG as amostras devem ser voláteis e termicamente estáveis. 
O principal objetivo dos métodos de preparação é transferir os analitos com interesse da 
matriz original, numa forma mais adequada para introduzir no cromatógrafo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AMOSTRAGEM MATRIZ PREPARO DE AMOSTRAS ANÁLISE VIA CG 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13. ANÁLISE QUANTITATIVA: baseada em estabelecer o valor da área da banda 
cromatográfica, a banda é um pico que idealmente deve ter formato gaussiano. Este é o 
parâmetro quantitativo. 
• Normalização: assume que todos os picos foram eluídos e detectados, e que o detector 
apresenta a mesma resposta para todos os picos. 
• Normalização com áreas corrigidas (com fator de resposta):melhor que a normalização 
simples, mas ainda assume que todos os picos eluiram da coluna 
• Padronização externa: melhor do que os anteriores, mas requer o uso de padrões de alta 
pureza e controle exato de volume injetado. 
• Padronização Interna: o padrão interno é um composto que se adiciona á amostra, sendo 
que ele não está presente na amostra, inerte frente á amostra e ao solvente, não vai 
interferir na análise, possui alta pureza, é adicionado em concentrações similares ao 
composto de interesse, tempo de retenção próximo ao do analito, área do pico também 
similar, ser pesado de forma exata (atuará como referencia) é da mesma “família” do 
analito ser bem resolvido em relação aos outros picos. Ex: determinação de benzeno em 
efluente (PI = tolueno); determinando etanol no sangue (PI= isopropanol). 
 
Amostras gasosas são coletadas 
em cilindros de inox e as líquidas 
em frascos de vidro ou plástico. 
Voláteis: uma boa tampa e frasco 
de vidro. 
Saber a procedência, separação 
de fases, presença de catalisador, 
turva (água ou etc). 
Amostra bruta. 
Podem ser 
gasosas, 
líquidas ou 
sólidas. 
Limpeza/filtração e pesagem 
Neutralização (catalisador ou ácidos) 
Secagem 
Derivatização (transforma- composto muito 
polar, o produto em derivado de acordo com o 
que se tem no lab. Daí se analisa o derivado) 
Extração (técnicas de enriquecimento): LLE 
(líquido-líquido, consome muito solvente, é 
menos eficiente, usada para compostos 
orgânicos semi-voláteis), Soxhlet (muita perda, 
muito solvente, demorado e eficiente, 
compostos organicos semi-voláteis de matrizes 
sólidas ), Arraste de vapor (rota-vapor, não usa 
solvente orgânico, sem resíduo), Headspace 
(quando a matriz é sólida, pastosa, produto 
natural de solo, amostra bem triturada). 
 Pré-concentração: 
concentrações muito 
baixas. 
SPE – extração em fase 
sólida 
SPME – microextração em 
fase sólida