TUDO SOBRE CROMATOGRAFIA (1)

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TUDO SOBRE CROMATOGRAFIA
QUESTAO: A cromatografia é um método físico-químico de separação e está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis: a fase móvel e a fase estacionária. Entre os vários tipos de cromatografia, destacam-se a cromatografia em camada delgada (CCD), a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e a cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR).
Sobre os tipos de cromatografia, assinale a alternativa INCORRETA.
AA cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de adsorção líquido-sólido em que a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária.
BNa cromatografia líquida clássica (CL), as fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e as fases estacionárias líquidas, por partição.
CAs separações em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) só acontecem por adsorção devido ao fato da fase móvel ser mais polar que a fase estacionária.
DO mecanismo de separação da cromatografia gasosa está baseado na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida.
1. Em uma separação cromatográfica, a qualidade da fase móvel pode refletir diretamente na eficiência da separação de substâncias e também na preservação dos equipamentos, principalmente da coluna cromatográfica. Explique as principais características que a fase móvel deve possuir em análises de cromatografia líquida e na cromatografia gasosa.
R: Na cromatografia líquida a fase móvel é um líquido, eluente, que possui uma polaridade maior quando em fase reversa e menor quando em fase normal, devendo ter uma força de eluição capaz de quebrar as interações entre a fase estacionária e a amostra, esta última deve possuir uma polaridade mais próxima a da fase móvel. No caso, da CLAE é mais usada a fase reversa e as suas principais características são, água altamente purificada, ser miscível, solventes em grau HPLC, baixa viscosidade, não decompor ou dissolver a fase estacionária.
Na cromatografia gasosa, a fase móvel é também chamada de gás de arraste, deve ser inerte, não interagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento; pura e deve ser isenta de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
QUESTÃO: A pereirina é um alcalóide extraído das cascas da Geissospermum vellosii Allemão, uma espécie de planta brasileira da família Apocynaceae, conhecida popularmente como Pau-pereira. Constatou-se que a glória desta descoberta é do farmacêutico brasileiro Ezequiel Corrêa dos Santos e, desta maneira, a pereirina é o primeiro alcaloide isolado no Brasil. Entretanto, alguns estudos desenvolvidos na Alemanha, em 1877, por Hesse, descrevem a pereirina como sendo um pó amorfo cinza claro com ponto de fusão 124 °C e fórmula molecular: C19H24N2O (Hesse, 1877). Diante dessa descoberta e dos conhecimentos obtidos na disciplina Fitoquímica, descreva em termos gerais quais as prováveis etapas percorridas pelo farmacêutico Ezequiel Corrêa dos Santos para isolar e elucidar a estrutura química da pereirinha.
R: De maneira geral, no processo de descoberta de substâncias é necessário primeiramente um estudo etnobotânico a fim de conhecer o uso da planta na medicina popular, além de verificar como se dava a sua distribuição geográfica. Após isso realiza-se etapas relativas à coleta e processamento do material e nesse meio tempo seria necessário também fazer um levantamento bibliográfico sobre os estudos que porventura já foram realizados com a planta em questão. Após o processamento da amostra obtém-se o extrato bruto. A partir daí é possível tomar caminhos diferentes, tendo em vista que há a possibilidade de submeter o extrato bruto diretamente a ensaios biológicos ou mesmo partir para os ensaios fitoquímicos de identificação e quantificação. O primeiro ensaio fitoquímico comumente realizado é o screening fitoquímico do extrato bruto que envolve a quantificação de compostos como taninos totais, flavonóides totais, saponinas, entre outros. Em seguida, com base nos dados obtidos no screening fitoquímico, parte-se para um planejamento a fim de identificar moléculas, procedimento que ocorre por meio de comparação com a literatura científica. Ou mesmo a elucidação que diz respeito à descoberta de novas moléculas nunca antes isoladas. Para isso podem ser utilizadas técnicas como: Cromatografia líquida de alta eficiência, Ressonância magnética nuclear, além de outras técnicas complementares que podem auxiliar nesse percurso, como a espectroscopia no infravermelho e a ultravioleta.
1. Em uma separação cromatográfica, a qualidade da fase móvel pode refletir diretamente na eficiência da separação de substâncias e também na preservação dos equipamentos, principalmente da coluna cromatográfica. Explique as principais características que a fase móvel deve possuir em análises de cromatografia líquida e na cromatografia gasosa.
Na cromatografia líquida a fase móvel é um líquido, eluente, que possui uma polaridade maior quando em fase reversa e menor quando em fase normal, devendo ter uma força de eluição capaz de quebrar as interações entre a fase estacionária e a amostra, esta última deve possuir uma polaridade mais próxima a da fase móvel. No caso, da CLAE é mais usada a fase reversa e as suas principais características são, água altamente purificada, ser miscível, solventes em grau HPLC, baixa viscosidade, não decompor ou dissolver a fase estacionária.
Na cromatografia gasosa, a fase móvel é também chamada de gás de arraste, deve ser inerte, não interagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento; pura e deve ser isenta de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
ou 
Cromatografia líquida em fase estacionária normal, a fase móvel deve ser apolar e em fase estacionária reversa, a fase móvel deve ser polar.
 
Cromatografia gasosa a fase móvel não interage com a amostra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como gás de arraste. Deve ser inerte isto é não reagir com a amostra , fase estacionária ou superfícies do instrumento e ser pura ou seja isenta de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
2. 1. No controle de qualidade de matérias-primas vegetais, uma análise cromatográfica por CCD pode ser uma técnica bem simples e rápida para detectar impurezas. Através da observação da imagem abaixo, diga quais substâncias pertencem a cada mancha na cromatoplaca e justifique a diferença do fator de retenção (Rf) entre elas (cromatoplacas de sílica gel usando hexano:acetato de etila:ácido acético 1:1:0,1 v/v/v)
A substância 1 é a mancha A, por possuir a estrutura química mais apolar esta substância tem o maior Rf, que é a relação da distância percorrida pela mancha e a distância percorrida pelo solvente. A substância 3 é a mancha C, pela presença de vários grupamentos de hidroxilas que traz uma característica mais polar à substância e por essa razão possui o menor valor de Rf. Por fim, a substância 2 representa a mancha B, pois em relação às outras duas substâncias possui uma polaridade intermediária e com isso o seu Rf também é intermediário.
OU 
Tomando como base a representação da molécula da substância 1, pode-se dizer que esta é a substância A, uma vez que sua estrutura química possui característica apolar, o que faria a substância percorrer uma distância menor na placa e por tanto ter um valor de Rf mais elevado. A mancha C muito provavelmente representa a substância 3, pois dentre as 3 substâncias essa é a que apresenta maior quantidade de grupamentos polares em sua estrutura, o que faz com que a substância percorra uma maior distância na placa, devido sua afinidade pelo solvente, sendo assim, tendo um fato de retenção bem menor. A substância 2 por sua vez, apresenta-se com polaridade intermediária e tem seu fator de retenção também intermediário, por tanto é bem provável que esta substância seja a mancha B
O parâmetro mais importante a ser considerado emCCD é o fator de retenção (Rf), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel. Os
valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6. → O fator de retenção pode auxiliar na identificação de substâncias em uma mistura
Rf= Distância percorrida pela mancha / distancia percorrida pelo solvente
3. Em uma análise por CLAE, uma mistura dos seguintes flavonoides foram eluídos em uma coluna de fase reversa:
PERGUNTA: Aponte a ordem na qual esses compostos foram elucidos e comente o motivo de terem tempos de retenção diferentes.
R: Quercetina, Canferol e Apigenina. Por ser utilizado em fase reversa os compostos mais polares saem primeiro e tem o menor tempo de retenção, com isso, pela quercetina possuir uma maior quantidade de grupamentos hidroxilas possui também uma característica mais polar, sendo assim, entre os 3 compostos a tem o menor tempo de retenção, em seguida vem o Canferol por possuir a segunda maior quantidade de grupamentos hidroxilas e por fim Apigenina com a menor quantidade de hidroxilas tendo assim um caráter menos polar em relação aos outros dois compostos e com isso tendo o maior tempo de retenção;
 CROMATOGRAFIA 
Método físico-químico de separação. que se baseia na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido diferentes interações, entre duas fases
imiscíveis,a fase móvel e a fase estacionária.
TIPOS:
A cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia LÍQUIDA planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se à cromatografia em papel (CP), à cromatografia por centrifugação (Chromatotron) e à cromatografia em camada delgada (CCD),
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA PLANAR
*líquido-líquido: partição
-cromatografia em papel:
Suporte: papel onde fica retida a fase estacionária, nesse caso a fase estacionária desse tipo de cromatografia será a celulose do papel. 
Fase móvel: líquido que flui no papel arrastando os metabólitos.
- A separação ocorre por diferença de solubilidade 
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Adsorção líquido-sólido - fase estacionária sólida e fase móvel liquida
Fase estacionaria - sílica (SiO2), alúmina (Al2O3)
Fase móvel - solventes polares, apolares e também mistura de solventes (ex. hexano, diclorometano, clorofórmio, acetato de etila, metanol, etc.)
A CCD consiste na separação dos componentes de uma mistura através da diferença de migração sobre uma camada delgada de adsorvente preso em uma superfície plana. 
FATORES QUE AFETAM A REPRODUTIBILIDADE EM UMA CCD ( CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA)
-características da mancha;
-A mancha deve ser comparada, redonda ou oval.
*As causas das manchas assimétricas devem ser:
-Insolubilidade na fase movel 
-Adsorção forte na fase estacionaria 
-Aplicação de quantidade muito grande da amostra 
→ Cuba cromatográfica
A cuba é o local onde se posiciona a placa
-O nivel de solvente precisa estar abaixo dos pontos de aplicação
-A cuba precisa ser fechada após cada eluição/mudança de solvente
→ Escolhas dos solvente
-Deve-se utilizar no início um solvente apolar.
-A migração das manchas da mistura devem acompanhar uma troca de solvente
*Solventes orgânicos na ordem crescente de polaridade. 
ex: hexano> hexano 1:1 diclorometano > diclorometano 1:1 acetato de etila > metanol
OUTROS FATORES QUE AFETAM A REPRODUTIBILIDADE EM CROMATOGRADIA EM CAMADA DELGADA
-Vedação da cuba
-Dimensoes da cuba
-Impureza do solvente
-Tecnica de aplicação
-Contaminação da amostra
CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA ANALÍTICA ( CCDA)
-podem ser obtidas já prontas ou produzidas no próprio laboratório utilizando placas de vidro. 
-placas pré-fabricadas possuem custo mais elevado mas são mais uniformes, apresentando um melhor resultado. Geralmente em tamanhos 20x20cm e com espessura de sílica entre 0,1 e 0,2mm; 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA CENTRÍGUGA 
-centro para bordas 
-movimento circular
-força centrígura
-Rapidas separações 
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Cromatofrafia líquido-solido de fase normal (adsorção) -processo mais utilizado ! 
*Fase estacionária sólida. Ex: sílica
*Fase estacionária polar
-separa moléculas mais apolares.
 
Se as moléculas tiverem algum dos grupamentos químicos abaixo, isso vai proporcionar uma maior interação e mais forte com a sílica. 
-Co2H > -OH > - NH2
-SH > - CHO > - C=O>
-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-
CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-SÓLIDO (Adsorção):
-Interações diferenciais dos componentes da mistura com a fase estacionária 
Função do eluente: Conduzir a amostra pela coluna. 
FASE MÓVEL:
são três os tipos de cromatografia: 
→ cromatografia gasosa;
 → cromatografia liquida;
→ cromatografia supercrítica (CSC), usando-se na última um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crítica.
A cromatografia líquida apresenta uma importante subdivisão:
→ cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela força da gravidade;
→ Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE): utilizam fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para a eluição da fase móvel. 
A CLAE: foi inicialmente denominada cromatografia líquida de alta pressão, mas sua
atual designação mostra-se mais adequada.
APLICABILIDADE da CLAE
Quais misturas podem ser separadas por CLAE? 
Para uma substância qualquer poder ser “arrastada’’ por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido. 
↓
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000. (diversidade muito grande de composto químicos).
De forma geral: CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na fase móvel. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica. (Fator limitante para cromatografia gasosa)
DE Cromatografia líquida para CLAE: 
-Aumento da superfície da fase estacionária (maior interação, e assim melhores separações cromatográficas)
(Empacotamento melhor, partículas da sílica menor)
- Fase estacionária mais homogênea (menos dispersão); 
Reduzir tempo de análise:
-Maior força de eluição (uso de bomba) 
POR QUE UTILIZAR O CLAE:
Curto tempo de análise;
Alta resolução;
Boa análise quantitativa por tempo de retenção, espectros de absorbância (detector PDA) e espectros de massa (EM). e qualitativa;
Boa repetibilidade; 
Versatilidade: compostos orgânicos e inorgânicos, baixa e alta massa molecular.
-Automação
-Vitaminas, Lípidos, aminoácidos, pesticidas, antioxidantes, polímeros, tintas, drogas de abuso, surfactantes, fármacos, proteínas, bactericidas, produtos naturais, açúcares. (Alta versatilidade)
PRINCIPAIS TIPOS DE ADSORVENTES
Sílica - fase normal - caráter polar : ideal para separar componentes apolares
· A sílica é uma das fases estacionárias mais utilizadas na cromatografia; 
fases móveis mais utilizados: água, metanol, acetonitrila, THF, soluções tampão. (Solventes Polares)
· Baixo custo de fabricação; 
· Tamanho de partículas e custos variados;
· Contém grupos dianóis (-SiOH); (grupos responsáveis pela interação com as amostras quimicas)
· Ideal para a separação de compostos apolares ( porque as substâncias polares interagem fortemente com a sílica que a fase móvel não terá força de eluição para quebrar as interações → interações irreversíveis
· 
· PRINCIPAIS TIPOS DE ADSORVENTES 
Muito usado para a separação de moléculas dissolvidas em solventes orgânicos apolares:
· Hexano
· Clorofórmio
· Diclorometano
· Acetato de etila
(metanol dissolve a sílica )
· 
DESVANTAGENS DA SÍLICA DE FASE NORMAL
· Altamente higroscópica (absorve umidade do ar) 
· Adsorção irreversível com água e outras substâncias polares
· 
Tipos de cromatografia: 
Fase normal (sílica normal, utilizada mais na cromatografia líquida, coluna aberta, sem ser sistema de bomba). 
CLAE fase reversa (Fase móvel: líquida, fase estacionária: sólida - sílica modificada. Ex: C-18, C-8.).
Troca iônica.
Exclusão por tamanho (fase fixa, não tem interação molecular, peneiramento de moléculas, por tamanhos diferentes vão eluir).
Característicasda fase móvel: 
· Água deve ser altamente purificada (a água é a principal fonte de contaminação em fase reversa) método para purificar água: osmose reversa e destilador. 
· Certificar que é totalmente miscível.
· Solventes grau HPLC.
· Desgaseificar toda a fase móvel. (Retirar as bolhas do solvente)
· Solução tampão preparada no momento do uso (com o tempo pode ocorrer crescimento de microorganismos).
 No caso de fases móveis gasosas, separações podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A diferença entre os
dois tipos está na coluna.
→ Enquanto na CGAR são utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionária é um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior diâmetro empacotadas com a fase estacionária.
3. Classificação pela fase estacionária utilizada
Quanto à fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente ligadas.
· FASES ESTACIONÁRIAS
· sílica (Sio2) → necessita de ativação de 30 a 60 min de 105 a 110ªC → para diminuir a quantidade de água que está impregnado no dióxido de silício, com isso os grupos silanóis estarão disponíveis para fazer interação entre a sílica e as amostras quimicas.
· Alúmina (Al2O3)→ isolamento de alcaloides.
· Celulose (são mais utilizados para compostos que têm anéis aromáticos). 
· Poliamida 
· 
No caso da fase estacionária ser constituída por um líquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele.
Suportes modificados são considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferem dos outros dois em seus mecanismos de separação.
4. Classificação pelo modo de separação
Por este critério, separações cromatográficas se devem à adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou misturas desses mecanismos.
Cromatografia planar → *líquido-líquido: partição
→ A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição líquido–líquido, estando um deles fixado a um suporte sólido. Baseia-se na diferença de solubilidade das substâncias em questão entre duas fases imiscíveis, sendo geralmente a água um dos líquidos.
→ O solvente é saturado em água e a partição se dá devido à presença de água em celulose (papel de filtro). Este método, embora menos eficiente que a CCD , é muito útil para a separação de compostos polares, sendo largamente usado em bioquímica.
A cromatografia em camada delgada (CCD) → técnica de adsorção líquido–sólido // fase estacionária sólida e fase móvel liquida. Nesse caso, a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária.
Fase estacionaria - sílica (SiO2), alúmina (Al2O3)
Fase móvel - solventes polares, apolares e também mistura de solventes (ex. hexano, diclorometano, clorofórmio, acetato de etila, metanol, etc.)
→ Por ser um método simples,rápido, visual e econômico, a CCD é a técnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de reações orgânicas, sendo também muito utilizada para a purificação de substâncias e para a identificação de frações coletadas em cromatografia líquida clássica.
VANTAGENS EM CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
· Técnica relativamente rápida
· Baixo custo
· Fácil compreensão e execução
· -Pode ter aplicação analitica ou preparativa 
· Versatilidade 
DESVANTAGENS DA CCD
· técnica de dificil reprodutibilidade 
· Dificil estabelecer o Rf exato das substancias 
· Pode haver perdas significativas de amostra 
→ O parâmetro mais importante a ser considerado em CCD é o fator de retenção (Rf
), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel. 
Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6.
→ A CCD pode ser usada tanto na escala analítica quanto na preparativa. Normalmente
as placas utilizadas são de vidro, com espessura de 3 a 4 mm. Placas analíticas usualmente têm 10 cm x 2,5 cm e preparativas 20 cm x 20 cm.
FATOR DE RETENÇÃO (RF)
-em condições experimentais bem definidas, uma substancia percorre sempre uma distancia fixa em relação a distancia percorrida pelo solvente.
-esta informação pode auxiliar na identificação de substancias em uma mistura
Rf= Distancia percorrida pela mancha / distancia percorrida pelo solvente
→ A sílica gel é a fase estacionária mais utilizada, sendo seguida pela alumina, pela terra diatomácea e pela celulose. Para a preparação das placas, faz-se uma suspensão do adsorvente em água, sendo a mesma depositada sobre a placa manualmente ou
com o auxílio de um espalhador. Após
a deposição, deixa-se a placa secar ao
ar. A etapa final da preparação da placa
é sua ativação. A sílica, por exemplo,
é ativada a 105-110 °C por 30 a 60
minutos. A espessura da camada de
sílica a ser depositada é de 0,25 mm
para placas analíticas e de 1,0 mm para placas preparativas. Na prepara-
ção de placas preparativas, costuma-
 se adicionar sulfato de cálcio para melhorar a adesão à placa de vidro.
No mercado existem placas analíticas
e preparativas pré-fabricadas, as quais
apresentam a fase estacionária deposi-
tada sobre uma lâmina de material
plástico ou de alumínio, sendo estas
de maior eficiência.
→ A escolha da fase móvel, que geralmente é constituída por um ou
mais solventes, não é tarefa simples. 
→ As fases estacionárias mais usadas são extremamente polares, não devem ser
utilizados solventes pouco polares, porque não removeriam os compostos do
ponto de aplicação, nem solventes muito polares, capazes de arrastar os
componentes da amostra até o topo da placa. Em vista disso, melhores resultados são obtidos com misturas de solventes, de modo a se obter uma polaridade média em relação à polaridade dos componentes da amostra.
· PRINCIPAIS TIPOS DE ADSORVENTES 
Muito usado para a separação de moléculas dissolvidas em solventes orgânicos apolares:
· Hexano
· Clorofórmio
· Diclorometano
· Acetato de etila
(metanol dissolve a sílica )
DESVANTAGENS DA SÍLICA DE FASE NORMAL
· Altamente higroscópica (absorve umidade do ar) 
· Adsorção irreversível com água e outras substâncias polares
· FASE MÓVEL POLAR
· água
· Metanol
· Acetonitrila
· Acidificada
· Tampão
A sílica de fase reversa é muito utilizada na coluna cromatográfica de um HPLC.
→ silica de fase reversa - apolar → muito utilizada na CLAE !!! Devido às características de substâncias polares serem mais difícil de se separar → é indicado utilizar a sílica de fase reversa;
-Sílica modificada com cadeia carbônica ligada aos grupos silanóis; 
-Baixa interação com moléculas polares; 
 
-Utilizado para separação de compostos polares (CLAE);
-C18 , C8 , C4 
· Cromatografia em coluna: Cromatografia líquido-sólido
→ Cromatografia líquida clássica: utilizada para isolamento de produtos naturais e
purificação de produtos de reações químicas. 
→ As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionária líquida.
→ Fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases estacionárias líquidas por partição. 
→ A escolha do eluente: Se,por exemplo, a amostra é constituída por duas substâncias, uma apolar e outra polar, utiliza-se primeiramente um eluente apolar e em seguida um
eluente polar.
→ Função do eluente: Conduzir a amostra pela coluna. 
→ (SEPHADEX lH-20) → UTILIZADO EM FASES MÓVEIS POLARES chamada de fase fixa ! ( O sephadex serve como uma peneira e as moléculas maiores vão descer primeiro, porque elas não entram dentro do polímero. Já as moléculas menores vão descer depois, pois elas penetram dentro do polímero e fazem o caminho mais longo pra sair da coluna cromatográfica. 
-Utiliza-se solventes de polaridade maior: POLAR : metanol, acetona. ) 
Sephadex (ADSORVENTE) - Separação por tamanho da molécula → solvente mais utilizado: metanol ou outros solventes polares. Também utiliza outras misturas como o acido-metanol-cloroformio 1pra1.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM COLUNA
-o processo cromatográfico acontece de formamanual
-Preparação da coluna e coleta das frações feitas pelo operador 
-cuidados
TAMANHO DA COLUNA
-colunas de tamanhos variáveis
-Adsorvente ocupando ⅓ do tamanho total 
PREPARAÇÃO DA COLUNA
-Algumas colunas ja possuem filtro embutido
-Fechamento com algodão 
PREPARANDO A COLUNA: 
empacotamento da sílica
1. Empacotamento a seco 
2. Empacotamento com solvente (método de pasta) 
 Efeitos de múltiplos caminhos 
-Irregularidade da sílica no empacotamento
-Caminho irregular dos componentes
· Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
→ uso de bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel, devido a sua baixa permeabilidade.
→ As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e
estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.
→ A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado.
→ O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de indíce de refração, e eletroquímicos, entre outros.
APLICABILIDADE da CLAE
Quais misturas podem ser separadas por CLAE? 
Para uma substância qualquer poder ser “arrastada’’ por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido. 
↓
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000. (diversidade muito grande de composto químicos).
De forma geral: CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na fase móvel. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica. (Fator limitante para cromatografia gasosa)
DE Cromatografia líquida para CLAE: 
-Aumento da superfície da fase estacionária (maior interação, e assim melhores separações cromatográficas) (Empacotamento melhor, partículas da sílica menor)
- Fase estacionária mais homogênea (menos dispersão); 
Reduzir tempo de análise:
-Maior força de eluição (uso de bomba) 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
fases móveis mais utilizados no CLAE: : água, metanol, acetonitrila, THF, soluções tampão. (Solventes Polares)
Tipos de cromatografia: 
Fase normal (sílica normal, utilizada mais na cromatografia líquida, coluna aberta, sem ser sistema de bomba). CLAE fase reversa (Fase móvel: líquida, fase
→ As separações em CLAE podem se dar por adsorção, partição ou ambos.
O suporte mais comumente utilizado é a sílica. 
→ O uso de fases estacionárias líquidas adsorvidas a um suporte não tem grande aplicação devido à perda de fase estacionária, mas o uso de suportes modificados, os quais foram
desenvolvidos como conseqüência do problema acima, possibilita a produção de uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas são chamadas de quimicamente ligadas.
→ Na cromatografia em fase normal, a fase estacionária é mais polar que a
fase móvel, e em fase reversa, a fase móvel é mais polar.
→ Separações analíticas são predominantemente realizadas em fase reversa, sendo a fase C18 (octadecil-sílica) a mais usada, ao passo que são preferidas fases que atuem no modo normal para fins preparativos, em vista de que separações no modo reverso utilizam fases móveis aquosas.
As interações na C18 são mais fortes com componentes de menor polaridade em relação aos componentes com maior polaridade. 
Características da fase móvel: 
· Água deve ser altamente purificada (a água é a principal fonte de contaminação em fase reversa) método para purificar água: osmose reversa e destilador. 
· Certificar que é totalmente miscível.
· Solventes grau HPLC.
· Desgaseificar toda a fase móvel. (Retirar as bolhas do solvente)
· Solução tampão preparada no momento do uso (com o tempo pode ocorrer crescimento de microorganismos).
CLAE
Vantagens: Menor tempo de Análise; Alta resolução; Resultados quantitativos; Boa sensibilidade; Reprodutibilidade; Versatilidade; Automação.
Desvantagens: Equipamento de alto custo; Operação de alto custo; Exige uso de solventes de alta pureza; Necessidade de operador experiente; Ausência de detector universal.
CLAE (Ou HPLC) X CLUE(Ou UHPLC) UHPLC obedece aos mesmos princípios de separação do HPLC. >Porém UHPLC apresenta: Melhor resolução e detectabilidade; menor tempo de análises e aumento significativo da pressão cromatográfica.
→ estacionárias quirais ( fases quimicamente ligadas), possibilitam a separação direta de enantiômeros. Para tanto, é necessária a presença de um seletor quiral como parte integrante da fase estacionária.
· Cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR)
→ o mecanismo de separação da cromatografia gasosa e se baseia na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida. A utilização de fases estacionárias sólidas, as quais levariam à separação por adsorção, apresenta poucas aplicações.
→ possuir um alto poder de resolução, é muito atrativa devido à possibilidade de detecção em escala de nano a picogramas (10–9-10-12 g). A grande limitação deste método é a necessidade de que a amostra seja volátil ou estável termicamente, embora amostras não voláteis ou instáveis possam ser derivadas quimicamente.
→ A diferença entre CG e CGAR está na coluna. Colunas de CGAR são maiores em
comprimento, menores em diâmetro, possuem a fase líquida como um filme aplicado diretamente às paredes do tubo da coluna e são mais eficientes.
→ Os gases utilizados como fase móvel devem ter alta pureza e ser inertes em relação à fase estacionária. Hidrogênio, nitrogênio e hélio são os mais usados.
→ A temperatura é um fator extremamente importante, grande parte das análises por cromatografia gasosa é feita com programação de temperatura, obtendo-se melhor separação com picos mais simétricos em menor tempo.
→ As fases estacionárias podem ser polares, apolares ou quirais. 
-Fases polares são baseadas em polietileno glicol puro ou modificado 
-Fases apolares : metilsiloxano puro ou modificado.
- Fases quirais : ciclodextrinas.
Duas fases estacionarias comuns usadas em cromatografia em coluna: SÍLICA E ALUMINA; 
QUAIS FASES MOVEIS PODEM SER USADAS? Compostos orgânicos como: eter de petróleo, clorofórmio, etanol e hexano.
PRINCIPAL PRÉ-REQUISITO DE UMA AMOSTRA PARA UMA ANÁLISE EM CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ( CLAE) ? A amostra deve ser solúvel em fase móvel. 
CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL → fase estacionária mais polar que a fase móvel;
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA: fase estacionária menos polar que a fase móvel. 
PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DA FASE MÓVEL EM CLAE? devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos sendo filtradas e gaseificadas antes do uso, devem dissolver a amostra sem interação química entre ambas, apresentar polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra.
DIFERENÇA DE ELUIÇÃO ISOCRÁTICA E GRADIENTE DE SOLVENTE EM UMA ANÁLISE DE CLAE : 
Eluição isocrática→ A composição da fase móvel ocorre com uma eluição de um único solvente ou com uma mistura de solventes de composição constante. 
Eluição por gradiente de solvente: a composição da fase móvel é variada durante a eluição, a fase móvel é formada por 2 ou mais solventes onde a razão entre estes é variada durante o processo de eluição. 
PORQUE A CROMATOGRAFIA GASOSA É UMA DAS TÉCNICAS ANALITICAS + UTILIZADAS E QUAL A PRINCIPAL LIMITAÇÃO?
Apresenta alto poder de resolução, sendo possível realizar a análise e muitos componentes de uma única amostra, inclusive a partir de pequenas quantidades de amostra; pode também ser usada como técnica de identificação, em alguns casos. Utilização limitada a separação e análise de misturas cujos constituintes sejam substâncias voláteis e estáveis termicamente. 
EM CROMATOGRAFIA GASOSA, QUAL A FUNÇÃO DO GÁS DE ARRASTE E QUAIS AS CARACTERÍSTICAS DESSE GÁS PARA UMA SEPARAÇÃO ADEQUADA;
O Gas de arraste é utilizado para transportar a amostra através da coluna de cromatografia gasosa. Paraseparação adequada o gás não deve interagir com a fase estacionária nem com a amostra, deve estar adequado ao detector, ter custo acessível e estar disponível no mercado, ter pureza.
CARACTERÍSTICAS DAS AMOSTRAS UTILIZADAS EM CROMATOGRAFIA GASOSA E COMO OCORRE A SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA EM UM CROMATÓGRAFO A GAS: 
EM UMA ANÁLISE DE UMA AMOSTRA FOI OBS A PRESENÇA DE CINCO PICOS, COMO PODEMOS OBS NO CROMATOGRAMA ABAIXO: 
eXPLIQUE COMO O AJUSTE DA TEMPERATURA DO FORNO PODE MELHORAR A SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA: 
CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE). FALE DOS COMPONENTES E OS PRINCIPAIS CUIDADOS QUE O ANALISTA DEVE TER PARA PRESERVAR A VIDA ÚTIL DESTE EQUIPAMENTO
PRINCIPAIS TIPOS DE ADSORVENTES
Sílica - fase normal - caráter polar : ideal para separar componentes apolares
· A sílica é uma das fases estacionárias mais utilizadas na cromatografia; 
SÍLICA DE FASE REVERSA - APOLAR 
-Sílica modificada com cadeia carbônica ligada aos grupos silanóis; 
-Baixa interação com moléculas polares; 
 
-Utilizado para separação de compostos polares (CLAE);
-C18 , C8 , C4 
QUESTÃO; a cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de cromatografia usada para separar misturas sobre uma placa de vidro, plástico ou folha de alumínio, revestida com uma fina camada de material adsorvente, geralmente sílica-gel, óxido de alumínio ou celulose, chamada fase estacionária. Depois que a amostra é aplicada sobre a placa, um solvente ou mistura de solventes (chamada de fase móvel) é permeado pela placa através de ação capilar. os diferentes componentes da mistura percorrem a placa de CCD de maneira diferentes, sendo possível a separação e possível identificação por meio do cálculo do rf, que é a razão entre a distância percorrida por cada mancha e a distância percorrida pelo eluente.
R: b amostra desconhecida é constituída de, pelo menos, 4 substâncias
QUESTÃO: A respeito da análise cromatográfica, é INCORRETO afirmar que:
R: Ba maior espessura de fase estacionária líquida, em uma coluna capilar, resulta em maior eficiência de separação, por intensificar os fenômenos de partição