Bioq-aula3

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UFABC
Bacharelado em Ciência & Tecnologia
Bioquímica Experimental
Métodos Espectroscópicos de 
Análise de Proteínas
 O termo “medida fotométrica” foi definido originalmente como o ato de medir a 
intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). A maioria dos 
instrumentos tem, contudo, mecanismos para isolar uma faixa estreita de 
comprimentos de onda do espectro. Os instrumentos que usam filtros para esse 
propósito são referidos como fotômetros de filtro ou colorímetros e os que utilizam 
prismas ou grades de difração são chamados de espectrofotômetros. 
Comprimento de onda
 Comprimento de onda refere-se a distância entre dois picos da propagação da luz que ocorre na 
forma de onda, e essa distância normalmente é dada em nanômetros (nm). A radiação 
eletromagnética inclui desde a energia radiante dos comprimentos de onda curtos dos raios g 
aos comprimentos de onda longos das ondas de rádio. O termo luz é usado para descrever a 
energia dos comprimentos de onda visíveis ao olho humano e àqueles limítrofes. O olho 
humano é capaz de detectar comprimentos de onda entre 380 e 750 nm, entretanto 
espectrofotômetros são capazes de medir também comprimentos de onda mais curtos 
(ultravioleta, UV) ou mais longos (infravermelho, IV).
Métodos Espectroscópicos de Análise de Proteínas
Métodos Espectroscópicos de Análise de Proteínas
Métodos Diretos
- Absorção na região ~220 nm – ressonância da ligação peptídica. Tem interferência dos 
constituintes celulares.
- Absorção na região ~280 nm – ressonância de cadeias laterais aromáticas. Tem interferência 
de RNA e DNA principalmente.
- Proteínas com grupos prostéticos que absorvem no UV-visível – hemoglobina
Métodos Espectroscópicos de Análise de Proteínas
Métodos Indiretos
- Baseado na absorção no UV-visível de grupos exógenos complexados à proteínas:
- Biureto
- Folin-Ciocalteu
- Prata
- Bradford
Espectrofotômetro
Fig. 2. Esquema óptico simplificado de um espectrofotômetro. 
(fonte: http://www.ufpa.br/ccen/quimica/espect2.jpg)
Métodos Espectroscópicos de Análise de Proteínas
Lei de Beer
Relaciona a absorção de luz com as propriedades 
do material atravessado por essa luz.
A quantidade de luz absorvida em um dado 
comprimento de onda será diretamente 
proporcional a concentração do material.
Lei de Lambert-Beer 
 A intensidade do feixe de luz transmitido (I) será sempre menor que Io, sendo que a transmitância (T) é 
definida como uma relação entre a intensidade da luz transmitida e a intensidade da luz incidente (Lei de 
Beer).
 
 
 
 𝑇 = 𝐼1𝐼0 
 
Fig. 3. Esquema demonstrando a incidência de um feixe de luz em uma cubeta e sua transmitância. 
(fonte:http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/04/Beer_lambert.png/300px-
Beer_lambert.png) 
 
 
Absorbância
 À medida que aumentamos a concentração da substância em solução, a transmitância varia em relação 
inversa ao logaritmo da concentração. Em consequência disso, pode-se definir um novo termo, absorbância 
(A), que será diretamente proporcional à concentração. Portanto,
A =  log I/Io =  log T 
 
A = log 1/T 
Absorbância
 Dessa forma, a absorbância é direta e linearmente proporcional à concentração. Esta varia também de forma 
direta com o caminho óptico (diâmetro interno) da cubeta, ou seja, se dobrarmos o caminho óptico mantendo 
a concentração constante, teremos um valor de absorbância duas vezes maior. Essa relação é frequentemente 
referida como Lei de Lambert-Beer:
A = a.b.c
Como os valores de A são adimensionais, a unidade de a são as 
recíprocas daquelas para b e c. Quando b = 1 cm (geralmente é) e c 
é expresso em mol.L-1, a constante a pode ser chamada de 
absortividade ou coeficiente de extinção molar (ε, épsilon, unidade = 
cm-1 . L.mol-1) e é constante para dado comprimento de onda, 
temperatura, pH, solvente.
Métodos Espectroscópicos de Análise de Proteínas
A = ɛ . l . [Proteína]
A = absorbância
ɛ = Coeficiente de extinção molar ou absortividade
l = caminho optico
Diferentes concentrações da proteína
 ∝ = ɛ 
Lei de Lambert-Beer
Métodos Espectroscópicos de Análise de Proteínas
Desvantagem: Baixa sensibilidade – detecta mais de 5 mg/mL
Métodos Indiretos
Métodos Espectroscópicos de Análise de Proteínas
Métodos Indiretos
Métodos Espectroscópicos de Análise de Proteínas
Métodos Indiretos
Métodos Espectroscópicos de Análise de Proteínas
Métodos Indiretos
Métodos Espectroscópicos de Análise de Proteínas
Dosagem de proteínas no lisado de S. cerevisiae
Métodos Espectroscópicos de 
Análise de Proteínas
Espectrofotôme
tro
Métodos Espectroscópicos de 
Análise de Proteínas
Procedimento:
Parte 1: Curva analítica de proteína.
1 – Adicione os volumes das soluções de albumina, água, e de reagente de
Bradford destacados na Tabela 1. Homogeneize em vórtice, e aguarde cinco
minutos.
2 – Use o branco para calibrar o instrumento de espectrofotômetro.
3 – Determine a absorbância de cada padrão analítico em 595 nm. Para tanto,
transfira o conteúdo do tubo para uma cubeta previamente lavada e seca, e leve
para o espectrofotômetro. Registre a absorbância em 595 nm, e use o espaço na
Tabela 1 para anotar os respectivos valores. Lembre-se: a cubeta deve ser
extensivamente lavada com etanol e água destilada, sendo seca para
cada leitura.
Métodos Espectroscópicos de 
Análise de Proteínas
Métodos Espectroscópicos de Análise de Proteínas
Determinação da atividade enzimática
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	Espectrofotômetro
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	Lei de Lambert-Beer
	Absorbância
	Absorbância (2)
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