Bioquímica Experimental

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UFABC
Bacharelado em Ciência & Tecnologia
Bioquímica Experimental
Cromatografia Líquida
- Seleção da fonte de onde pretende-se extrair a proteína
- Solubilização da proteína
- Estabilização da proteína
- Detecção da proteína
- Proteínas são purificadas por processos de fracionamento.
- Características que podem ser utilizadas nos processos de purificação:
- solubilidade, polaridade, massa molecular, presença de cargas iônicas, 
 presença de sítios de ligação para moléculas específicas.
Estratégia geral de separação/purificação de proteínas
Cromatografia Líquida
Cromatografia Líquida
Column Chromatography 
(a) Separation of a protein 
mixture 
Shown is the procedure for the performance of 
column chromatography.
(a) A mixture of proteins is added to a column 
containing a solid matrix. Solvent then 
flows into the column from a reservoir. 
Washed by solvent, different proteins 
(represented by blue and red bands) 
travel through the column at different 
rates, depending on their interaction with 
the matrix. Eluate is collected in a series 
of "fractions", a few of which are shown.
(b) The protein concentration of each fraction is 
determined by measuring the absorbance 
at 280nm. The peaks correspond to the 
elution of protein bands shown in (a). 
The fractions are then tested for the 
presence of the target protein.
(b) Detection of eluting 
protein peaks
Protein Purification Techniques
Homogenization, fractionation (ammonium 
sulfate), centrifugation, and dialysis
• Common types of column chromatography 
(HPLC):
Ion-exchange chromatography - separation 
based upon the overall charge of molecules = salt 
elution 
Gel-filtration chromatography - separation based 
upon molecular size = porous beads
Affinity chromatography - separation by specific 
binding interactions between column matrix and 
target proteins = most selective 
Cromatografia por gel filtração
Cromatografia Líquida
Cromatografia de gel-filtração
https://microbenotes.com/gel-filtration-chromatography/
Tipos de resina
Cromatografia Líquida
Cromatografia Líquida
Determinação da massa molecular da proteína por gel filtração
Cromatografia de fase reversa
https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-
biology/reversed-phase-chromatography
Cromatografia por afinidade
Cromatografia Líquida
Cromatografia de afinidade
Cromatografia Líquida
Purification of Recombinant Adenoviral Hexon Proteins for Generation of Virus-specific Antibodies & Next-generation 
Sequencing of Adenoviral Genomes, February 2016, Thesis for: MScAdvisor: Silvio Hemmi
Purificação com coluna de níquel
Cromatografia de Troca-Iônica
Cromatografia Líquida
Cromatografia de troca-iônica
https://maestrovirtuale.com/cromatografia-de-troca-ionica-procedimento-principios/
Cromatografia Líquida
Cromatografia Líquida
Cromatografia Líquida
Cromatografia Líquida
Colunas de troca-iônica
Cromatógrafo
Cromatografia Líquida
Prática 6: Purificação de Proteínas 
Cromatografia de troca iônica
- Preparação da resina e coluna de troca iônica
- Preparação da amostra
- Cromatografia
- Identificação das frações que contém a enzima -glicosidase∝
Cromatografia Líquida
Prática 6: Purificação de Proteínas 
Cromatografia de troca iônica
Cromatografia Líquida
Prática 6: Cromatografia de troca iônica
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