Apostila_Bioquimica_Experimental

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NHT4002-13
 Bioquímica Experimental
APOSTILA DO CURSO
LABORATÓRIO
Santo André
2023
ÍNDICE
CALENDÁRIO ACADÊMICO (ANO / QUADRIMESTRE) 
CRONOGRAMA DA DISCIPLINA
SEGURANÇA E NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO
TIPO DE AVALIAÇÃO
BIBLIOGRAFIA – Para as atividades teóricas e práticas da disciplina
Prática 1 - Crescimento da levedura
Prática 2 - Lise de Células de Levedura
Prática 3 - Quantificação de Proteína
Prática 4 - Determinação da atividade enzimática de -glicosidase
Prática 5 - Estudo do pH ótimo para a atividade de -glicosidase
Prática 6 - Purificação de Proteínas – Cromatografia de troca iônica
Prática 7 – Purificação de proteínas – SDS-PAGE (parte 1)
Prática 8 – Purificação de proteínas – SDS-PAGE (parte 2)
Prática 9 – Cinética da enzima -glicosidase (parte 1).
Prática 10 - Cinética da enzima -glicosidase (parte 2).
CALENDÁRIO ACADÊMICO (ANO / QUADRIMESTRE) – 2023-1 
CRONOGRAMA - Bioquímica Experimental 
SEMANA ATIVIDADES
1 08/02 – Aula prática 1 - Crescimento da levedura
2 15/02 – Aula prática 2 - Lise de Células de Levedura
4 01/03 – Aula prática 3 - Quantificação de Proteína
5
08/03 – Aula prática 4 – Determinação da atividade enzimática de 
alfa-glicosidase (entrega do relatório 1 – Exp. 1-3)
6
15/03 – Aula prática 5 - Estudo do pH ótimo para a atividade de 
alfa-glicosidase
7
22/03 – Aula prática 6 – Purificação de Proteínas – Cromatografia de
troca iônica (entrega do relatório 2 – Exp. 4-5)
8
29/03 – Aula prática 7 - Purificação de proteínas – SDS-PAGE (parte
1)
9
05/04 – Aula prática 8 - (entrega de relatório 3 – Exp. 6) - 
Purificação de proteínas – SDS-PAGE (parte 2)
10
12/04 – Aula prática 9 - Cinética da enzima alfa-glicosidase (parte 
1).
11
19/04 - Aula prática 10 – (entrega do relatório 4 – Exp. 6-8)
Cinética da enzima alfa-glicosidase (parte 2).
12 26/04 – Entrega de relatório 5 – Exp. 9-10 .
SEGURANÇA E NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO
Leia integralmente o Guia de Segurança, Experimentos e Atividades (3ªed.) da 
disciplina de Base Experimental das Ciências Naturais. 
Segurança
 Conheça a localização dos chuveiros de emergência, extintores e
lavadores de olhos.
 Use sempre avental, mantenha os cabelos presos e use calçados
fechados, mesmo na aula reservada para o preparo da prática seguinte;
 Os óculos de segurança são obrigatórios!
 Usar a capela sempre que possível;
 Nunca pipete com a boca, não cheire, nem experimente os produtos
químicos;
 Comer e beber, apenas fora do laboratório;
 Consulte o professor cada vez que notar algo anormal ou imprevisto;
 Comunique qualquer acidente / incidente ao professor;
 Se utilizar chama, mantenha longe de qualquer reagente!
 Nunca brinque no laboratório;
 Evite o contato de qualquer substância com a pele;
 Nunca aqueça o tubo de ensaio, apontando a extremidade aberta para um
colega ou para si mesmo.
 Cuidado ao aquecer vidro em chama: o vidro quente tem exatamente a
mesma aparência do frio.
Procedimentos gerais
 Siga rigorosamente as instruções fornecidas pelo professor.
 Pesquise sempre a toxicidade dos reagentes antes das práticas.
 Nunca abra um recipiente de reagente antes de ler o rótulo.
 Evite contaminar reagentes, nunca retorne o excedente aos frascos de
origem.
 Adicione sempre ácidos à água, nunca água a ácidos.
 Não coloque nenhum material sólido dentro da pia ou nos ralos.
 Não coloque resíduos de solventes na pia ou ralo; há recipientes
apropriados para isso.
 Não atire vidro quebrado no lixo comum. Deve haver um recipiente
específico para fragmentos de vidro.
 Verifique se as conexões e ligações estão seguras antes de iniciar uma
reação.
 Ao terminar a prática, lave o material utilizado e deixe-o em ordem
TIPO DE AVALIAÇÃO – A Parte prática da disciplina será avaliada pelos 
relatórios dos experimentos.
BIBLIOGRAFIA – Para as atividades teóricas e práticas da disciplina 
Os Fundamentos teóricos e detalhes experimentais podem ser obtidos 
nas seguintes referências:
1) Voet, D.; Voet, J. Bioquímica, 3 ed., Porto Alegre: Artmed, 2006. 
2) Berg, J. M.; Tymoczko, J.L; Stryer, L. Bioquímica, 5 ed., Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2004. 
3) Lehninger, A.L.; Nelson, D.L; Cox, M.M. Princípios de bioquímica, 4 ed.,
São Paulo: Sarvier, 2006. Berg, J. M.; Tymoczko, J.L; Stryer, L.
Biochemistry, 6.ed. New Jersey: John Wiley, 2006. 
4) Voet, D.; Voet, J. Biochemistry, 3rd ed., New Jersey: John Wiley, 2004.
Informações técnicas (propriedades físicas, toxicidade, preço, 
nomenclatura)
1. CRC Handbook of Chemistry and Physics
2. Aldrich Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment
3. IUPAC Gold Book - http://goldbook.iupac.org/
Bases de Dados/Referências
1. The Web of Science (www.isiknowledge.com)
2. SciELO - Scientific Electronic Library Online (www.scielo.org)
http://www.scielo.org/
http://www.isiknowledge.com/
http://goldbook.iupac.org/
Prática 1: Crescimento da levedura
Orientações:
a) Não há entrega de pré-relatório
b) No dia seguinte é necessário ir ao laboratório retirar as leveduras da
incubadora. Os técnicos retirarão a levedura e colocarão o concentrado
de levedura na geladeira. 
Crescimento prévio da Levedura (Saccharomyces cerevisiae).
Células obtidas de Fermento de pão. 
Meio YPD: Cada grupo preparará 0,2L do meio, com 4 g de peptona/ 4 g de
glicose, que deve ser autoclavado antes do uso, por 30 min. Após o resfriamento,
misturar em ambiente estéril (em capela de fluxo laminar) o meio de
crescimento - 2 g de extrato de levedura, tampar o erlenmeyer e manter sob
agitação a 30°C por 24 hr. Após este período, deixar a levedura decantar por 1
hora e colocar na geladeira sem o sobrenadante, para o uso no próximo
experimento. 
Prática 2: Lise de Células de Levedura
Orientações:
a) PRÉ-RELATÓRIO: fluxograma completo do procedimento, seguindo as
regras de elaboração de fluxogramas.
b) RELATÓRIO, que deve ser composto do PRÉ-RELATÓRIO (em folha
separada), além de responder às seguintes questões: 1) Qual a função
do PMSF? 2) Indicar com cálculos a preparação do tampão fosfato
utilizado neste procedimento.
Objetivo: Lise de células de Leveduras (Saccharomyces cerevisiae).
Reagentes Materiais Instrumentos
Água destilada  Banho de gelo
 Pérolas de vidro 0,5
mm previamente
tratadas com ácido
sulfúrico
 Pipetadores
 Pipetas
 Provetas
 Suporte para tubos
 Tubos falcon 15 e 50
mL
 Centrífuga
 Estufa
 Freezer
 Vórtice
Células de levedura
obtidas na aula anterior
Álcool etílico
Fluoreto de -
fenilmetilsulfonila
(PMSF); 0,1 M em etanol
+ coktail inibidor de
proteases para leveduras
Hipoclorito de sódio 20
g/L
* Tampão fosfato 100 mM,
pH 7,0 com EDTA 5 mM
(tampão lise)
Procedimento: Lise celular
1- Adicione aproximadamente 2 g de células de leveduras crescidas até a fase
logarítmica tardia (peso úmido) em um tubo de centrífuga.
2- Adicione 4mL de tampão de lise.
3- Ressuspenda as células usando vórtice.
4- Adicione 40 x 10-6 L (40 L) de PMSF 10mM em etanol e 10 L de cocktail inibidor
de proteases e fosfatases para leveduras (Sigma).
5- Homogeneize usando vórtice.
6- Adicione várias pérolas de vidro a suspensão celular (~1 espátula), e feche o tubo.
7- Agite ininterruptamente a suspensão usando o vórtice por um minuto e resfrie em
gelo por um minuto. Repita este ciclo pelo menos mais quatro vezes
(processo de lise).
8- Centrifugue a suspensão de células contendo as pérolas a 850 g por dois minutos.
9- Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um tubo falcon limpo e
identificado, evitando coletar o material sedimentado (precipitado). Esta porção
é denominada Lisado. Mantenha o Lisado em banho de gelo.
10- Ressuspenda o precitado juntamente com as pérolas de vidro em 4mL de tampão
lise.
11- Repita as etapas de 4 a 9 mais duas vezes.
12- Reúna todos os lisados em um único frasco, e determineo volume de lisado obtido
com uma proveta.
13- Divida o lisado em três alíquotas de volumes idênticos e armazene em tubos
plásticos falcon, devidamente identificados como o nome do grupo. 
14- Armazene os tubos em freezer a -200C. 
Lavagem das pérolas de vidro (etapas realizadas pelos técnicos do lab.)
 Transfira as pérolas de vidro para um erlenmeyer que contém 200 ml de H2SO4 
1M por 1 hora.
 Lave 4 vezes com água Mili-Q
 Deixe secar em estufa por 12 horas, a 140°C.
Prática 3: Quantificação de Proteína.
Orientações:
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxograma completo do procedimento, seguindo as regras de
elaboração de fluxogramas.
2. Elaboração teórica do método de quantificação de proteínas
utilizado;
3. Construção da tabela da curva analítica a ser preenchida durante o
procedimento.
b) RELATÓRIO: cálculo da concentração de proteína total no lisado de
Saccharomyces cerevisiae.
Objetivo: Quantificar proteína do Lisado de Saccharomyces cerevisiae
colorimetricamente.
Reagentes Materiais Instrumentos
 Água destilada  Banho de gelo  Vórtice
 Lisado de levedura (F1)  Cubetas para leitura  Espectrofotômetro
 Albumina Bovina 0,2 g/L 
em água
 Pipetadores, pipetas, 
ponteiras
 Reagentes de BradFord:
 Ácido fosfórico 85%,
 Azul de Coomassie G
 Metanol
 Tubos de ensaio e 
suportes
 Papel de filtro
Procedimento: 
Parte 1: Curva analítica de proteína.
1 – Adicione os volumes das soluções de albumina, água, e de reagente de
Bradford destacados na Tabela 1. Homogeneíze em vórtice, e aguarde cinco
minutos.
2 – Use o branco para calibrar o instrumento de espectrofotômetro.
3 – Determine a absorbância de cada padrão analítico em 595 nm. Para tanto,
transfira o conteúdo do tubo para uma cubeta previamente lavada e seca, e leve
para o espectrofotômetro. Registre a absorbância em 595 nm, e use o espaço na
Tabela 1 para anotar os respectivos valores. Lembre-se: a cubeta deve ser
extensivamente lavada com etanol e água destilada, sendo seca para
cada leitura.
Observação 1: os tubos contendo o lisado devem sempre estar em
banho de gelo.
Não podemos prever com segurança a quantidade de proteína no lisado, e
consequentemente se a leitura estará dentro da faixa da curva analítica
construída na parte 1. Assim, primeiramente, dilua o lisado 100 vezes. Pipete
0,1mL (100L) do lisado e adicione 9,9 mL de água destilada. Importante:
Identifique cada tubo. Exemplo (L-100x diluído)
Tabela 1: Guia para fazer padrões e leitura espectrofotométrica.
Tubo Albumina
0,2 g.L-1 (L)
Água
(L)
Bradford
(mL)
A
(595 nm)
Massa de proteína
(mg)
Branco 0 100 1
1 10 90 1
2 20 80 1
3 40 60 1
4 60 40 1
5 80 20 1
Parte 2: Quantificação de Proteína no Lisado de Saccharomyces cerevisiae.
Preparação da amostra. Prepare as amostras dos lisados diluídos (L-100 x
diluído, etc) de acordo com a Tabela 2. 
Tabela 2: Diluição e leitura das amostras.
Tubo L-___ x dil.
(L)
Água
(L)
Bradford
(mL)
A (595nm) Massa de proteína
(mg)
Branco 0 100 1
1 100 0 1
2 50 50 1
3 10 90 1
Se a leitura da absorbância das amostras se encontra dentro dos limites inferior
e superior das absorbâncias dos padrões, repita o procedimento mais duas
vezes. Caso contrário, primeiro calcule uma diluição apropriada baseado nos
dados da Tabela 2, e então repita o procedimento mais duas vezes, anotando
todas as absorbâncias obtidas.
Prática 4 – Determinação da atividade
enzimática de -glicosidase.
Orientações:
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxograma completo do procedimento, seguindo as regras de
elaboração de fluxogramas.
2. Esquematização de como se calcula a atividade enzimática;
3. Estrutura do p-nitrofenil-a-glicosídeo e sua função.
b) RELATÓRIO: 1) gráfico do ensaio da atividade da enzima -glicosidase
(nmols de produto x tempo) para as diferentes diluições do lisado (pH
7,0). Utilize a curva padrão de p-nitrofenolato fornecida. 2) cálculo da
atividade enzimática de -glicosidase (U/mL) e (U/mg) do lisado no pH
7,0. Uma unidade de atividade (1U) é 1 mol de produto por minuto. 
Objetivo: Determinar a atividade enzimática de -glicosidase nos lisados de
Saccharomyces cerevisiae. 
Reagentes Materiais Instrumentos
 Água destilada  Banho de gelo  Vórtice
 Lisado de levedura (F1)  Cubetas para leitura  espectrofotômetro
 p-nitrofenil--glicosídeo 
(NPGlc) 4 mM em 
tampão fosfato 100 mM 
pH 7,0.
 Pipetadores, Pipetas, 
Ponteiras
 Tubos de ensaio e 
suportes
 Banho a 30 0C
 Tampão 
carbonato/bicarbonato 
250 mM, pH 11,0
Observação 1: Sempre mantenha os tubos contendo o lisado e a
amostra em banho de gelo.
Procedimento: 
Diluição serial do lisado. Sugestão:
1 – Transfira 0,2 mL do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo e
adicione 1,8 mL de água destilada gelada. Identifique o tubo. Exemplo: L-10x. 
2 – A partir de L-10x faça diluição 5 vezes (L-50x), e a partir de L-50x faça uma
diluição de 10 vezes (L-500x).
Determinação da atividade de -glicosidase
1 - Primeiramente, identifique os vários tubos seguindo a Tabela 1. 
2 - Novamente baseado na Tabela 1, prepare os brancos (controles) e amostras
em tubos de ensaio. 
Importante: 1) homogeneíze os lisados diluídos manualmente e com
cuidado antes de aliquotá-los. 2) sempre adicione o volume de
lisado por último.
3 - homogeneíze a solução manualmente e com cuidado, e transfira o tubo
imediatamente para o banho a 300C. O tubo deve permanecer no banho pelo
período de tempo estipulado na Tabela 1.
4 – Após o período de tempo estipulado, remova o tubo do banho e adicione 2
mL do tampão carbonato-bicarbonato pH 11,0 imediatamente. Este
procedimento deve interromper a atividade de -glicosidase. 
5 – Transferira o conteúdo do tubo para uma cubeta e faça a leitura
espectrofotométrica em 420 nm. 
6 – Complete a Tabela 1 para as duas diferentes diluições. 
Tabela 1: Guia para preparação de brancos e amostras.
Tubo V. de Lisado
(L-___x) (mL)
Água
(mL)
Volume de
NPGlc (mL)
Tempo
(min)
A
(420nm)
Branco de 
lisado
0 0,2 0,2 20
Branco de 
substrato
0,2 0,2 0 20
1 0,2 0 0,2 5
2 0,2 0 0,2 10
3 0,2 0 0,2 15
4 0,2 0 0,2 20
5 0,2 0 0,2 25
 O branco deve ser preparado uma única vez, mesmo se o volume de lisado for
diferente.
Curva padrão de p-nitrofenolato. 
Prática 5: Estudo do pH ótimo para a
atividade de -glicosidase. 
Orientações:
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxograma completo do procedimento, seguindo as regras de
elaboração de fluxogramas.
2. Pesquisar previamente qual o valor de pH ótimo para a atividade da
α-glicosidase.
b) RELATÓRIO: Com seus dados, calcule e apresente: 1) cálculo da
atividade enzimática de -glicosidase (U/mL) nos diferentes pHs. 2)
Construir a curva de pH ótimo da atividade de -glicosidase (U/mL).
Ou seja, apresentar tabela e gráfico da atividade relativa (%) de -
glicosidase (U/mL) nos diferentes pHs. A atividade relativa em
percentagem é a percentagem da atividade enzimática nos diferentes
pHs com relação a maior atividade observada. 3) Determinar o valor
de pH ótimo para a atividade de -glicosidase (U/mL). 
Objetivo: Estudar o efeito do pH na atividade enzimática de -glicosidase. 
Reagentes Materiais Instrumentos
 Água destilada  Banho de gelo  Vórtice
 Lisado de levedura (F1)  Cubetas para leitura  Espectrofotômetro
 p-nitrofenil--glicosídeo 
(NPGlc) 8 mM em água
 Pipetadores, Pipetas, 
Ponteiras
 Banho a 30 0C
 Tampão 
carbonato/bicarbonato 
250 mM, pH 11,0
 Tubos de ensaio e 
suportes
 Tampão fosfato 200 mM 
pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 
e 9,0
Observação 1: Sempre mantenha os tubos contendo o lisado e de
amostras em banho de gelo.
Procedimento:
Diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae. 
Proceder como descrito na apostila da prática 3. Prepare lisados comdiluições de 10 vezes e 100 vezes. 
É PRECISO PREPARAR CERCA DE 7 mL DE LISADO DILUÍDO
POIS SÃO UTILIZADOS 0,8 mL POR ENSAIO EM CADA pH.
Ensaio da atividade enzimática de -glicosidase em diferentes
concentrações hidrogeniônicas. 
1 – Identifique os vários tubos seguindo a Tabela 1. 
2 – Baseado na Tabela 1, prepare um conjunto de amostras para cada pH (4, 5,
6, 7, 8, e 9). Lembre-se adicione o volume de lisado por último.
Importante: 1) homogeneíze os lisados diluídos manualmente e com
cuidado antes de aliquotá-los. 2) sempre adicione o volume de
lisado por último.
3 - homogeneíze a solução manualmente e com cuidado e transfira o tubo
imediatamente para o banho a 30 0C. O tubo deve permanecer no banho pelo
período de tempo estipulado na Tabela 1.
4 – Após o período de tempo estipulado, remova o tubo do banho e adicione
imediatamente 2 mL do tampão carbonato-bicarbonato pH 11. Este
procedimento deve interromper a atividade de -glicosidase. 
5 – Transferira o conteúdo do tubo para uma cubeta e faça a leitura
espectrofotométrica em 420 nm. 
6 – complete a Tabela 1 para os diferentes pHs estudados. 
Tabela 1: Guia para preparação de amostras nos diferentes pHs.
Tubo Volume de
Lisado (mL)
Tampão Fosfato pH
_____
(mL)
Volume de
NPGlc (mL)
Tempo
(min)
A
(420nm)
0 0,2 0,2 0,0 25
1 0,2 0,1 0,1 5
2 0,2 0,1 0,1 10
3 0,2 0,1 0,1 15
4 0,2 0,1 0,1 25
Prática 6: Purificação de Proteínas –
Cromatografia de troca iônica
Orientações:
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxograma completo do procedimento, seguindo as regras de
elaboração de fluxogramas.
2. Planejar a pré-prática da aula 7.
b) RELATÓRIO: 1) Determinar a atividade enzimática de -glicosidase no
material purificado por cromatografia de troca iônica em U/mL. 2)
Baseado na determinação em U/mL e no teor de proteína da mesma
amostra, determinar a atividade enzimática específica de -glicosidase
(U/mg de proteína). 3) Calcular a recuperação e o enriquecimento da -
glicosidase após a cromatografia de troca iônica.
Objetivo – Purificar -glicosidase do lisado de Saccharomyces cerevisiae
utilizando resina de troca iônica.
Procedimento:
Parte 1 – Preparação da resina e coluna de troca iônica.
1.1 – Hidratação de DEAE-Sephadex 
(Executado por monitores e técnicos).
1. Pesar 0,5 g de DEAE-Sephadex em um béquer. 
2. Adicionar 100 mL de tampão fosfato 10 mM pH 6,8.
3. Misturar bem utilizando um bastão de vidro.
4. Decantar por 24 horas.
1.2 – Montagem da coluna de troca iônica. 
(Executado por monitores e técnicos)
1. Prenda um barril de uma seringa plástica de 20 mL (suporte para
como coluna) e acomode uma pequena porção de lã de vidro no seu
interior. Compacte bem a lã de vidro com um bastão de vidro na base
da seringa.
2. Lave extensivamente a coluna com água destilada para remover
fragmentos de lã de vidro.
3. Adapte uma válvula na saída da seringa e deixe-a fechada.
4. Homogeneíze a suspensão contendo a resina (Parte 1) com um bastão
de vidro e transfira a mesma para a seringa até a marca de 1 mL.
Deixe decantar. 
5. Repita a operação até que a resina sedimentada ocupe o interior da
seringa até a marca de 2 mL. 
(Executado pelos alunos).
6. Lave a coluna com 20 mL de tampão fosfato 10 mM (sem NaCl). 
7. Após a lavagem deixe cerca de três mm de tampão acima do topo da
coluna de resina. 
8. Observe os possíveis vazamentos na coluna. NUNCA PERMITA
QUE A COLUNA SEQUE.
Parte 2 – Preparação da amostra.
1. Descongele o lisado e transfira 1,0 mL para um tubo “eppendorf ”.
Centrifugue a 14.000 g por 3 minutos. Colete o sobrenadante com uma
pipeta automática cuidadosamente. É muito importante que apenas
o sobrenadante seja removido para evitar o entupimento da
coluna cromatográfica. 
2. Separe 0,4 mL do sobrenadante para esta prática e congele o restante
para ser utilizado na próxima prática. 
Parte 3 – Cromatografia.
3. Adicione 0,6 mL de tampão fosfato 10 mM sem NaCl na fração de
lisado. 
4. Abra a presilha cuidadosamente e permita que o tampão percole pela
coluna até aproximadamente 3 mm acima do topo da resina. Feche a
presilha. Adicione CUIDADOSAMENTE E LENTAMENTE a amostra
(etapa 3) com uma pipeta sobre a coluna. É importante que a resina
não se mova. 
5. Permita que a amostra percole pela coluna até aproximadamente 3mm
acima do topo da resina. Feche a presilha. 
6. Adicione 2 mL de tampão fosfato 10mM sem NaCl sobre a coluna
cuidadosamente e lentamente. 
7. Conecte o primeiro “eppendorf” a saída da coluna. Abra a válvula
cuidadosamente. Colete 1 mL (~20 gotas) em cada “eppendorf ” sempre
transferindo o anterior para o banho de gelo e adicionando 1mL de
tampão fosfato 10mM sem NaCl sobre a resina cuidadosamente e
lentamente. Assim, deve sempre haver 2,0 mL de tampão acima do
topo da resina. (~10 tubos)
8. Após o OITAVO EPPENDORF colete mais dois tubos sem adicionar
tampão. 
Cuidado. Feche a válvula quando o tampão estiver
aproximadamente 3mm acima do topo da resina. Não permita que a
coluna seque.
9. Adicione 2,0 mL de tampão fosfato 10 mM com NaCl 2,0 mL
(100mM)
10. Repita o procedimento do item 7 mais dezoito vezes e também o item 8
uma única vez. (~20 tubos)
Parte 4 – Identificação das frações que contém a enzima -
glicosidase. 
1. Prepare e identifique 20 tubos Falcon de 15 mL.
2. Adicione a cada tubo 0,2 mL de NPGlc. Transfira os tubos para o banho
de gelo.
3. Adicione 0,2 mL das frações coletadas na parte 3, homogeneíze bem, e
leve imediatamente todos os tubos para um banho a 300C por 10
minutos. 
4. Remova cada tubo do banho e adicione 2mL de tampão bicarbonato-
carbonato pH 11,0. Homogeneíze bem, e deixe os tubos a temperatura
ambiente.
5. Calibre o espectrofotômetro com água destilada e leia a absorbância da
solução de cada tubo em 420 nm. Identifique os tubos que contêm -
glicosidase. 
6. Reúna as frações da cromatografia correspondentes aos tubos que
contêm -glicosidase.
Pré-prática 7 - Preparação das amostras para gel SDS-
PAGE.
Serão utilizadas as frações purificadas por cromatografia de troca
iônica, que contêm -glicosidase.
Diálise das amostras 
a. Transfira o volume total de amostra indicada acima (“pool” de
frações) para um tubo Falcon (15 mL) e identifique-o (Nome/N°
do grupo).
 (Executado por monitores e técnicos).
b. Em água destilada fervente (CUIDADO) adicione o pedaço da
membrana de diálise a ser utilizado, deixando por 5-10 minutos,
trocando 2 vezes a água. No final do processo, passe a membrana
por água destilada fria, manipulando-a sempre com luvas. 
(Executado pelos alunos).
c. Usando uma presilha de plástico, lacre bem uma das extremidades
da membrana de diálise, previamente fervida. 
d. Adicione o “pool de frações purificadas” na membrana e lacre a
outra extremidade com uma presilha.
e. Coloque a membrana em um béquer com 1 L de água fria.
Mantenha sob refrigeração por pelo menos 16 horas. (Venha no
dia seguinte para retirar suas amostras e levar para concentrar).
Dosagem de proteínas. 
1. Determine o teor de proteínas nas amostras purificadas e selecionadas
nas etapas anteriores. Para tanto, repita o procedimento da prática 2(#).
Esta atividade será realizada durante o período de
polimerização do gel de acrilamida. 
Prática 7 – Purificação de proteínas –
SDS-PAGE (parte 1)
Orientações:
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxograma completo do procedimento, seguindo as regras de
elaboração de fluxogramas.
2. Determine qual o volume de amostra será utilizado nesta prática
para carregar o gel de poliacrilamida, com base na pré-prática 7.
b) RELATÓRIO: 1) Identificar a banda correspondente a -glicosidase no
gel. 2) Calcular o provável padrão molecular relativo da enzima -
glicosidase baseado nos padrões utilizadosna eletroforese em gel. 
Objetivo: Analisar a composição de proteínas do material que contém -
glicosidase separado por cromatografia de troca iônica.
Material e soluções (preparados por técnicos e monitores)
Solução 1: 
Reagentes Massa / Volume
Acrilamida 29,2 g
N’N’bis metilenoacrilamida 0,8 g
Água destilada 100 mL
Solução 2: 
Reagentes Observação
Tris 1,5 M pH 8,8. Corrigir pH com HCl
Solução 3: 
Reagentes Observação
Tris 0,5 M pH 6,8. Corrigir pH com HCl
Tampão de Amostra: 
Reagentes Massa / Volume
Água 3,55 mL
Solução C 1,25 mL
Glicerol 2,5 mL
SDS 100g/L 2,0 mL
Azul de bromofenol 5 g/L
-mercaptoetanol 0,05 mL
Tampão de Corrida: 
Reagentes Massa / Volume
Tris 3,3 g
Glicina 14,4g
SDS 1,0 g
Água 1 L
Solução de Coloração: 
Reagentes Massa / Volume
Azul de Comassie R 0,1 g
Metanol 40 mL
Ácido acético 10 mL
Água 50 mL
Solução de Descoloração: 
Reagentes Massa / Volume
Metanol 40 mL
Ácido acético 10 mL
Água 50 mL
Procedimento.
Parte 1 – Montagem e teste da placa
Monte com muito cuidado a placa (Bio Rad), conforme instruções do
Professor e, adicionando água destilada, verifique se há vazamentos. Em caso de
vazamentos, repita a operação de montagem desde o início e teste novamente.
Repita essa operação até não haver vazamentos.
Parte 2 – Prática 7 - Preparação do gel de SDS-PAGE. (realizada por
técnicos e monitores)
Gel de separação
1. Em um tubo falcon de 15 mL, adicione:
4,0 mL de água destilada, 
100 L de SDS (100 g/L), 
3,33 mL da solução 1, 
2,5 mL da solução 2, 
5 L TEMED, e
50 L de persulfato de amônio (descongelar alíquota no dia).
2. Homogeneíze rapidamente.
3. Transfira a mistura para as placas de vidro previamente montadas, utilizando
uma pipeta de Pasteur. Aguarde a polimerização por 60 minutos.
Durante o período de polimerização do gel, realizar a dosagem do
teor de proteínas nas amostras purificadas e selecionadas nas
etapas anteriores. Para tanto, repita o procedimento da prática 2.
Gel de empilhamento
1. Em um tubo falcon de 15 mL, adicione:
3,5 mL de água destilada, 
50 L de SDS (100 g/L), 
0,65 mL da solução 1, 
1,25 mL da solução3, 
5 L TEMED, e
25 L de persulfato de amônio (descongelar alíquota no dia).
2. Transfira a mistura para as placas de vidro, que contém o gel de separação já
polimerizado. 
3. Coloque o pente sobre as placas de vidro e aguarde a polimerização por 40
minutos. 
4. Acondicione e guarde as placas umedecidas – conforme instruções do
Professor e dos Técnicos – na geladeira, para a realização do Experimento 8.
Prática 8 – Purificação de proteínas –
SDS-PAGE (parte 2)
Desnaturação das proteínas nas amostras. 
1. Adicione 15 µL da amostra (já dialisada) em 2 microtubos previamente
identificados. Em outros três microtubos adicione, respectivamente, 10
µL das amostras previamente preparadas de Hemoglobina e BSA
(albumina sérica bovina), bem como da amostra (não dialisada).
2. Adicione tampão nos cinco microtubos, fazendo que o volume final seja
de 25 µL. 
3. Leve os microtubos para um banho (em 100 °C) e espere 10 minutos. 
Eletroforese.
Retire a placa da geladeira e, cuidadosamente, puxe o pente para não
danificar as camadas de gel. Coloque corretamente a placa na cuba de corrida
(Mini Protean Tetra System – BIO-RAD) e adicione o tampão de corrida.
1. Com o auxílio de micropipetadores, aplique 5 µL do padrão de peso
molecular (no primeiro poço) e 10 µL de cada amostra nas demais
canaletas do gel. (anote a sequência)
2. Complete a cuba com a solução tampão (conforme indicado pelo
professor/técnicos)
3. Conecte a cuba à fote Power-Pac Universal (BIO-RAD) e faça a
eletroforese com 130 V, por aproximadamente 50 minutos. 
4. Desligue o instrumento, retire o gel cuidadosamente e guarde-o de
acordo com as orientações do professor.
5. Na capela, coloque o gel no frasco contendo a solução de coloração e
aqueça por 10 segundos, usando um forno de micro-ondas (deixando o
gel totalmente submerso na solução). Verifique se há a necessidade de
outra etapa de coloração e, em caso positivo, aqueça novamente por 10
segundos.
6. Ainda na capela, retire cuidadosamente (com uma pipeta pasteur) toda a
solução corante e adicione a solução de descoloração, leve o frasco ao
micro-ondas e aqueça em 3 etapas de 10 segundos (verificando – em cada
etapa - se não há superaquecimento. Repita essa etapa diversas vezes, até
a descoloração total do gel.
7. Transfira cuidadosamente o gel para uma placa de Petri, lave-a com água
destilada e observe as bandas das proteínas, comparando-as. 
Fotos do gel corado em alta resolução devem ser providenciadas e
anexadas ao relatório. 
Prática 9 – Cinética da enzima -
glicosidase. Caracterização da enzima por
parâmetros cinéticos. 
Orientações:
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxograma completo do procedimento, seguindo as regras de
elaboração de fluxogramas.
b) RELATÓRIO: Construir o gráfico de Michaelis-Menten e Lineweaver-
Burk na ausência do inibidor e determine VMAX e Km. 
Objetivos – Determinar parâmetros cinéticos da -glicosidase (Km e VMax).
Caracterizar -glicosidase por padrões cinéticos. 
Reagentes Materiais Instrumentos
 Água destilada  Banho de gelo  Vórtice
 Lisado de levedura (F1)  Cubetas para leitura  Espectrofotômetro
 p-nitrofenil--glicosídeo 
(NPGlc) 1,0 mM, 2,0 mM, e 
8,0 mM em tampão fosfato 
100 mM pH 7,0.
 Pipetadores, 
Pipetas, Ponteiras
 Tubos falcon e 
suportes
 Banho a 300C
 Tampão carbonato/bicarbonato
250 mM, pH 11,0
 Tampão fosfato 100 mM pH 7,0
Procedimento.
Parte 1 – Preparação das amostras dos lisados de Saccharomyces cerevisiae.
1. Utilize a mesma diluição que foi estudada na prática 3. 
Observação 1: Caso seja impossível utilizar o procedimento de
diluição da prática 3, siga o procedimento abaixo. Note que o
volume necessário é de 5,0 mL.
2. Transfira 0,1 mL do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo e
adicione 0,9 mL de água destilada. Homogeneíze suavemente.
Identifique este tubo como L10X.
3. Transfira 0,5 mL do tubo L10X, e adicione 4,5 mL de água destilada.
Homogeneíze suavemente. Identifique este tubo como L100X.
Determinação da atividade de -glicosidase
1 - Primeiramente, identifique os vários tubos falcon (15 mL) seguindo a
Tabela 1. 
2 - Baseado novamente na Tabela 1, prepare as amostras nos tubos. 
Importante: 1) homogeneíze os lisados diluídos manualmente e com
cuidado antes de aliquotá-los. 2) sempre adicione o volume de
lisado por último.
3 - homogeneíze a solução manualmente e com cuidado, e transfira o tubo
imediatamente para o banho a 30 0C. Os tubos devem permanecer no
banho por, no mínimo, 15 minutos. (Se possível, teste periodicamente
para monitorar o andamento da reação).
4 – remova os tubos do banho e adicione 2 mL do tampão carbonato-
bicarbonato (pH 11,0) imediatamente. Este procedimento deve interromper a
atividade de -glicosidase. 
5 – Transferira o conteúdo do tubo para uma cubeta e faça a leitura
espectrofotométrica em 420nm. 
Tabela 1: Guia para preparação de brancos e das amostras.
Tubo
Tampão fosfato 100mM
pH 7,0 (mL)
NPGlc (mL) Lisado
(mL)
A
(420nm)1,0 mM 2,0 mM 8,0 mM
0 0,30 0,1
1 0,28 0,02 - - 0,1
2 0,26 0,04 - - 0,1
3 0,22 0,08 - - 0,1
4 0,18 0,12 - - 0,1
5 0,14 0,16 - - 0,1
6 0,10 0,20 - - 0,1
7 0,14 - 0,16 - 0,1
8 0,10 - 0,20 - 0,1
9 0,20 - 0,10 0,1
10 0,17 - 0,13 0,1
11 0,15 - 0,15 0,1
Prática 10 – Cinética da enzima -
glicosidase. Inibição por maltose.
Caracterização da enzima por parâmetros
cinéticos. 
Orientações:
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
 Esquematização de construção dos gráficos cinéticos;
b) RELATÓRIO: Construir o gráfico de Lineweaver-Burk na presença do
inibidor maltose e determine VMAX e Km. 
Objetivos – Determinar parâmetroscinéticos de inibição de -glicosidase por
maltose. Caracterizar -glicosidase por padrões cinéticos de inibição por
maltose. 
Reagentes Materiais Instrumentos
 Água destilada  Banho de gelo  Vórtice
 Lisado de levedura (F1)
 Maltose 0,4 M, 1,2 M, e 
1,6 M em tampão fosfato 
100 mM pH 7,0.
 p-nitrofenil--glicosídeo 
(NPGlc) 1,0 mM, 2,0 
mM, e 8,0 mM em 
tampão fosfato 100 mM 
pH 7,0.
 Tampão 
carbonato/bicarbonato 
250 mM, pH 11,0
 Tampão fosfato 100 mM 
 Cubetas para leitura
 Pipetadores, 
Pipetas, Ponteiras
 Tubos falcon e 
suportes
 Espectrofotômetro
 Banho a 300C
pH 7,0
Procedimento.
Parte 1 – Preparação das amostras dos lisados de Saccharomyces cerevisiae.
1. Utilize o mesmo procedimento de diluição utilizado na prática 9. 
Parte 2 – Cinética da reação de hidrólise do substrato na presença do inibidor
maltose. 
1 - Inicialmente, identifique os vários tubos falcon (15 mL) seguindo a Tabela 1. 
2 – Novamente, baseado na Tabela 1, prepare as amostras nos tubos. 
Importante: 1) homogeneíze os lisados diluídos manualmente e com
cuidado antes de aliquotá-los. 2) sempre adicione o volume de
lisado por último.
3 - homogeneíze a solução manualmente e com cuidado, e transfira o tubo
imediatamente para o banho, a 30 0C. Os tubos devem permanecer no
banho, pelo menos, o dobro do período de tempo usado na prática 9.
(Se possível, testar periodicamente para monitorar o andamento da reação).
4 – remova o tubo do banho e adicione 2 mL do tampão carbonato-bicarbonato
(pH 11,0) imediatamente. Este procedimento deve interromper a atividade de -
glicosidase. 
5 – Transferira o conteúdo do tubo para uma cubeta e faça a leitura
espectrofotométrica em 420 nm. 
Tabela 1: Guia para preparação do branco e das amostras.
Tubo
Tampão fosfato
100mM pH 7,0
(mL)
NPGlc (mL) Maltose (mL)
Lisado
(mL)
A
(420nm)
1,0
mM
2,0
mM
8,0 
mM
0,4 M 1,2 M 1,6 M
0 0,20 0,1 0,1
1 0,12 0,08 - - 0,1 0,1
2 - 0,2 - - 0,1 0,1
3 0,04 - 0,16 - 0,1 0,1
4 - - 0,20 - 0,1 0,1
5 0,10 - - 0,10 0,1 0,1
6 0,05 - - 0,15 0,1 0,1
7 0,12 0,08 - - 0,1 0,1
8 - 0,2 - - 0,1 0,1
9 0,04 - 0,16 - 0,1 0,1
10 - - 0,20 - 0,1 0,1
11 0,10 - - 0,10 0,1 0,1
12 0,05 - - 0,15 0,1 0,1
13 0,12 0,08 - - 0,1 0,1
14 - 0,2 - - 0,1 0,1
15 0,04 - 0,16 - 0,1 0,1
16 - - 0,20 - 0,1 0,1
17 0,10 - - 0,10 0,1 0,1
18 0,05 - - 0,15 0,1 0,1
	SEGURANÇA E NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO
	BIBLIOGRAFIA – Para as atividades teóricas e práticas da disciplina