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Disciplina: Microbiologia e Imunologia Aula 4: Metabolismo e controle do crescimento microbiano Apresentação Todo ser vivo depende de reações bioquímicas complexas para se desenvolver. Nesta aula, você reconhecerá que muitas reações de síntese e produção de moléculas de ATP encontradas em células procarióticas estão adaptadas a micro-organismos eucarióticos e organismos pluricelulares. Por isso, conhecer os fatores e as condições de crescimento auxilia no cultivo de células no laboratório e no conhecimento das nossas próprias células. A biotecnologia pode ser considerada a aplicação direta desses conhecimentos. Objetivos De�nir reações catabólicas e anabólicas nos micro-organismos; Reconhecer as vias para obtenção de energia em bactérias; Classi�car as condições para o crescimento de micro-organismos. Metabolismo: quebras e sínteses Todo organismo precisa colocar em ação um número x de reações para se manter vivo. São reações para retirar energia de algum nutriente, repor algum componente consumido e estocar algum composto energético. São muitas - e todas elas, importantes. Não existe desperdício nos sistemas biológicos. Por isso, muitas dessas reações estão conectadas com outras vias de reação para fornecer mais de uma ação para a célula. O conjunto dessas reações é denominado metabolismo. Uma reação que gera a quebra de uma molécula maior, como, por exemplo, um polissacarídeo, automaticamente vai estar acoplada com uma reação de construção de alguma estrutura. Em bioquímica, há as reações de: 1 Quebra Catabólicas ou degradativas .1 2 Síntese Anabólicas ou biossintéticas. O metabolismo ideal existe quando as reações de quebra estão em equilíbrio com as reações anabólicas. Nas reações que envolvem a quebra de ligações químicas, ocorre a liberação da energia. Mas como ela pode ser consumida pela célula? Se uma ligação química é rompida, essa energia condicionada não sai simplesmente como um gás. Uma possibilidade seria transferir a energia para uma reação de síntese, correto? Para isso, é preciso que exista um elo entre essas duas condições. A resposta está na molécula de ATP: trifosfato de adenosina. http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula4.html Fonte: Shutterstock Molécula de ATP: trifosfato de adenosina No metabolismo energético da célula, a molécula de ATP libera o último fosfato inorgânico, transformando-se em ADP e Pi, o fosfato inorgânico. Não existe estoque de ATP porque o processo é extremamente dinâmico: a todo momento, uma molécula de ADP está se ligando a um Pi para reter (ou quebrar) uma ligação altamente energética. Dica Lembre-se das reações que precisam de uma entrada de energia: as endergônicas. São elas que utilizam o ATP, rompendo essa última ligação covalente para fornecer a energia de ligação para a síntese de alguma molécula. Síntese e clivagem da molécula de ATP. | Fonte: Shutterstock O ATP pode ser formado de duas maneiras: 1. Fosfato é retirado de um substrato e se liga a um ADP : processo conhecido como fosforilação em nível de substrato; 2. Com o auxílio de uma enzima ATPase : cujo rendimento de moléculas de ATP é bem superior.2 Glicólise A melhor forma de compreender o conceito de catabolismo é explorar uma de suas principais vias metabólicas: a glicólise 3 A glicólise é o carboidrato que a maioria dos micro-organismos utiliza como fonte primária para obtenção de energia – em seguida, vêm os lipídeos e as proteínas. Para produzir energia, os micro-organismos utilizam dois processos: 1. Fermentação; 2. Respiração celular (ou, simplesmente, respiração). http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula4.html http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula4.html Ambos começam a partir do mesmo ponto: glicólise. Trata-se de uma via metabólica com várias reações que transformam um carboidrato de seis carbonos em duas moléculas de três carbonos, o ácido pirúvico. Nas onze reações que levam à formação de ácido pirúvico, são produzidas duas moléculas de: 1. ATP (através de fosforilações em nível de substratos); 2. NADH. A glicólise consiste de dois passos básicos: Clique nos botões para ver as informações. Duas moléculas de ATP são utilizadas para que a glicose se reestruture e se transforme em gliceraldeído 3-fosfato (GP) e diidroxiacetona-fosfato (DHAP). A DHAP é convertida em gliceraldeído 3-fosfato. São as etapas 1 a 5. Fase preparatória Há a oxidação dessas moléculas em duas moléculas de ácido pirúvico com ganho �nal de duas moléculas de ATP. Fase de recuperação de energia Visão geral das reações da glicólise. | Fonte: Shutterstok Se o micro-organismo é aeróbio, o ácido pirúvico será guiado para reações que transferem elétrons até o oxigênio. Se o micro-organismo é anaeróbio, no lugar do oxigênio entra outra molécula, como, por exemplo, o íon nitrato (NO ) no gênero Pseudomonas .3- 4 Ciclo de Krebs A etapa seguinte à da glicólise é o ciclo do ácido cítrico ou ciclo de Krebs. Nele, o ácido pirúvico reage com a coenzima A (CoA), perdendo 1C e formando acetil-CoA. O oxaloacetato, um composto renovável do ciclo de Krebs, reage com o acetil-CoA, formando o ácido cítrico e liberando a coenzima A, que será utilizada novamente. São 10 reações que recuperam ao �nal o oxaloacetato, gerando, a cada entrada de molécula de ácido cítrico, a liberação de: http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula4.html 1 Quatro moléculas de CO2 para o ambiente. 2 Seis moléculas de NADH. 3 Duas moléculas de FADH2. 4 Duas moléculas de ATP (geradas em nível de substrato). O ciclo de Krebs, na verdade, é uma encruzilhada metabólica que gera produtos utilizados pela bactéria para os mais variados �ns. E uma das funções mais importante dessa etapa é a saída das coenzimas reduzidas NADH e FADH para entregar esses elétrons a um sistema de moléculas carreadoras. 2 Veja a sequência das reações do ciclo de Krebs na �gura a seguir e con�rme se o mais importante é mesmo a geração de energia pelo ATP. Parece que não. Há dez reações e produção de duas moléculas de ATP. Visão geral do ciclo do ácido cítrico ou ciclo de Krebs. | Fonte: Shutterstock Na �gura, repare que as enzimas desidrogenases trabalham com as coenzimas NAD+ e FAD+, tornando-as reduzidas. As moléculas carreadoras de elétrons podem até ser diferentes entre os procariotos, mas ao �nal sempre vai existir uma enzima ATPase. Como já foi comentado neste curso, a ATPase é um dos ganhos evolutivos mais conservados entre os seres vivos: tamanha é a sua importância que nós e as bactérias aeróbias compartilhamos o mesmo processo em relação a ela. Quando os H alcançam essa enzima, ela torna-se ativada, fazendo a ligação entre ADP e Pi. É a fosforilação oxidativa, pois a formação de ATP está acoplada às reações de oxidação. A con�guração dessa enzima é tão especial que permite que os H passem pelo seu interior, mudando a sua con�guração inativa para ativa. São produzidas 38 moléculas de ATP por hexose. + + Micro-organismos anaeróbios Não existem todas as reações do ciclo de Krebs porque eles não possuem todos os aceptores dos aeróbios. Isso faz com que esses micro-organismos produzam menos energia, o que explica seu crescimento ser mais lento que o dos aeróbios. Organismos fermentadores Não há o ciclo de Krebs nem a cadeia de transporte de elétrons. Grande parte da energia �ca na estrutura da molécula �nal (álcool ou lactato), gerando somente uma ou duas moléculas de ATP. Fermentação lática Os gêneros Streptococcus e Lactobacillus realizam a fermentação lática, utilizando NADH para reduzir duas moléculas de ácido pirúvico a duas de ácido lático. Como só produzem ácido lático, eles são denominados homoláticos. São esses micro- organismos que deterioram os alimentos, mas eles também geram o iogurte a partir do leite e outros alimentos comercializados pela indústria alimentícia. Fermentação alcoólica Já a produz duas moléculas de acetaldeído e duas de CO2 do ácido pirúvico. O acetaldeído vai dar origem ao etanol. Dois exemplos: a levedura Saccharomycescervisae, que serve para a produção de álcool e bebidas, e o CO2, para o crescimento do pão. Segundo bons padeiros italianos, a lievitazione (fermentação do pão) deve levar no mínimo oito horas. Repare como a massa dobra de tamanho, �cando bem fofa e volumosa. A fermentação, há muito tempo, é estudada e controlada. Exemplos: seleção de uvas, tempo de fermentação dos vinhos e extrato de malte para as cervejas.5 http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula4.html Fonte: Shutterstock Características dos Micro-organismos Micro-organismos são classi�cados de acordo com: 1) Fonte de energia: 1 Fototró�cos Fonte primária de energia é a luz. 2 Quimiotró�cos Utilizam compostos orgânicos e inorgânicos que serão reduzidos. 2) Fonte de carbono: Clique nos botões para ver as informações. Termo signi�ca alimentação própria. São todos aqueles que utilizam CO . Autotró�cos 2 Dependem de outros seres para obter carbono. São todos os animais, a maioria dos fungos, os protozoários e as bactérias. A maioria é patogênica para o homem. Heterotró�cos ou organotró�cos A combinação dessas duas classi�cações (fonte de energia e fonte de carbono) dá origem a quatro seres vivos: Fotoautotró�cos Fotoheterotró�cos Quimioautotró�cos Quimioheterotró�cos 3) Temperatura Fator determinante para o crescimento de micro-organismos, e todos possuem uma temperatura mínima, ótima e máxima. Temperatura mínima que funciona como barreira: abaixo dela, não é possível ele se dividir. Já a temperatura máxima acabaria desnaturando suas proteínas, levando o micro-organismo à morte. Fonte: Shutterstock. HÁ EXCEÇÕES Existem micro-organismos adaptados para viver em ambientes que a maioria dos seres vivos não suportaria. São os micro- organismos extremó�los. Eles vivem, por exemplo, em zonas vulcânicas ou hidrotermais marinhas do planeta. Vamos conhece-los? Vamos ver a classi�cação dos micro-organismo de acordo com a taxa de PH? Temperaturas baixas Psicró�los : crescem a 4 °C ; Psicrotolerantes: podem crescer em temperaturas de 0 °C. 6 Comentário Ambos podem crescer em ambientes refrigerados sendo responsáveis pela deterioração da carne, frango e peixe. Temperaturas mais elevadas Mesó�los: crescem entre 25 e 40 °C . Estão os microrganismos mais comuns; Termó�los: são os que habitam o solo e águas termais com temperatura ótima entre 50 e 60 °C. Termó�los extremos, ou hipertermó�los: temperatura ainda mais elevada, próxima a 80ºC, como as arquibactérias. Habitam as águas quentes ricas em enxofre perto do vulcão. 7 Parque Nacional de Yellowstone | Fonte: Wikipedia <https://pt.wikipedia.org/wiki/Parque_Nacional_de_Yellowstone> Isolada de um gêiser no parque nacional Yellowstone, nos Estados Unidos, a bactéria Thermus aquaticus revolucionou a biotecnologia, fornecendo a enzima polimerase, que não desnatura nas etapas da técnica chamada de reação em cadeia da polimerase (PCR). 4) PH O pH é uma escala logarítmica da concentração de H+ livres. Seu excesso interfere na estrutura das proteínas, desnaturando-as . Por isso, ele é um fator químico importante de ser observado nos meios de cultivo para células eucarióticas e procarióticas.8 A maioria dos micro-organismos cresce em ambientes numa faixa de pH que varia entre 6,5 e 7,5. http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula4.html http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula4.html https://pt.wikipedia.org/wiki/Parque_Nacional_de_Yellowstone http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0070/aula4.html Clique nos botões para ver as informações. Crescem em de pH abaixo de 6. Fungos são mais tolerantes que as bactérias. Acidó�los São conhecidos pela resistência a ambientes extremos para a maioria dos micro-organismos. aparecem em vários gêneros Archaea. Acidó�los obrigatórios Localizados localizados em regiões de vulcões ácidos e mantém seu pH intracelular em 4,5. Temos como exemplo o Picrophilus oshimae. Acidó�los extremos Mantem a faixa de pH entre 6 e 8; Neutró�los A indústria utiliza as lipases e proteases produzidas por eles para sabão em pó. Já deve estar reconhecendo na prateleira do supermercado aquela marca pioneira nesse uso, não é? Alcalinó�los Outras formas de crescimento - Sal Haló�los são micro-organismos que crescem bem na água do mar, rica em cloreto de sódio. Eles dividem-se em: Haló�los moderados (concentração de NaCl varia entre 7 a 15%); Haló�los discretos (1 a 6 % de NaCl); Haló�los extremos (concentração de 15 a 30%); Atenção Existem também os halotolerantes, micro-organismos que podem viver com certa redução de moléculas de água. - Açúcar Micro-organismos que vivem em ambientes ricos em açúcar são chamados de osmó�los. - Ambiente seco Organismos xeró�los são aqueles que vivem em ambientes extremamente secos por falta de água. - Oxigênio Já sabemos que alguns utilizam o oxigênio como aceptor �nal na respiração celular para a produção de ATP, enquanto outros micro-organismos preferem outro tipo de aceptor �nal. Na realidade, esta classi�cação (utilizar ou não o oxigênio) seria muito simples frente à enorme diversidade de organismos no nosso planeta. Por isso mesmo, existe uma escala de utilização de oxigênio que divide os micro-organismos em: Microaeró�lo (sobrevive com pouco oxigênio); Aeróbio facultativo (fermenta sem oxigênio. Exemplos: Escherichia coli e leveduras); Tolerante. Atenção Os micro-organismos chamados de aeróbios crescem em ambiente com grande tensão de oxigênio, algo em torno de 21%. No entanto, como o oxigênio é pouco solúvel, alguns micro-organismos se adaptaram para fazer a fermentação quando o oxigênio não estiver disponível. Por outro lado, os anaeróbios obrigatórios não crescem se o oxigênio estiver presente, pois ele é considerado toxico. É o caso dos gêneros Clostridium e Botulinum, formadores de endósporos. A capacidade de sobreviver na presença de oxigênio depende da presença de algumas enzimas que processam os radicais superóxidos (O2-) ou ânions superóxidos do metabolismo do oxigênio. Do ponto de vista evolutivo, a presença das enzimas superóxido dismutase e catalase garantiu a sobrevivência de todos os seres vivos aeróbios no nosso planeta. Veja as reações a seguir: Repare que o oxigênio molecular reage com elétrons, produzindo o ânion superóxido (O ). A presença do elétron não pareado é tóxico porque ele é capaz de interagir com elétrons de outro elemento químico, alterando proteínas e outros alvos celulares. Assim, a ação da enzima superóxido dismutase devolve o oxigênio molecular, embora também produza o peróxido de hidrogênio. Além disso, a enzima catalase transforma H O em produtos que serão aproveitados pela bactéria. - 2 2 2 Exemplo O teste da catalase é um teste bioquímico muito comum no laboratório de bacteriologia. Mesmo sem conhecê-lo, você já deve ter observado surgirem bolhas na pele com feridas ao aplicarmos água oxigenada no local. Essas bolhas são do oxigênio liberado pela ação da catalase. Portanto, micro-organismos anaeróbios obrigatórios não possuem esse sistema detox, enquanto anaeróbios aerotolerantes possuem a enzima superóxido dismutase. Fonte: Shutterstock Macronutrientes para o crescimento dos micro-organismos Para crescer os microrganismos necessitam em primeiro lugar de quantidades de água e macronutrientes. O carbono é considerado um dos macronutrientes mais importante. Sendo utilizado para a síntese de proteínas, açúcares e lipídeos. Além do carbono, os micro-organismos utilizam o nitrogênio para a síntese de DNA e RNA, aminoácidos e todos os nucleotídeos, ATP, GTP, UTP e CTP. Esse macronutriente é recuperado da atmosfera pelos microrganismos presentes no solo, os chamados �xadores de nitrogênio associados a raízes de plantas. O fósforo também é necessário para a síntese de ácidos nucléicos, bases nitrogenadas e nucleosídeos. E o enxofre é utilizado para os aminoácidos cisteína e metionina. Outras exigências para o crescimento são os elementos traço como ferro, zinco, manganês, magnésio, cobalto,cloro, sódio e cobre que atuam como coenzimas e cofatores igualmente em todos os seres vivos e são necessários em baixa concentração. Os micronutrientes são fatores de crescimento pois são importantes para a composição de várias proteínas, estruturas celulares entre outras funções celulares. A exigência desses fatores varia muito, e em alguns microrganismos, como os Lactobacillus, as concentrações são até maiores que em humanos. A partir de agora estudaremos as fases de crescimento em uma população de bactérias, veri�cando todas as condições necessárias para uma bactéria crescer. Fonte: Shutterstock Crescimento e controle de bactérias No laboratório, quando um inóculo microbiano for semeado em um meio de cultura especí�co, ocorrerá inicialmente um período de adaptação. Em seguida, a população irá realizar múltiplas divisões até a redução dos nutrientes tornar impossível seu crescimento, levando-a à morte. Essas etapas ou fases de crescimento microbiano são divididas em: Clique nos botões para ver as informações. A primeira fase é de adaptação. As células quase não se dividem, ativando vários genes necessários para metabolizar os constituintes adquiridos do meio ou para a síntese de novos compostos. Esta fase de latência pode durar horas ou até mesmo dias dependendo de: Número de células viáveis no inóculo; Meio de cultura; Própria espécie microbiana. Lag Quando ocorrem as divisões celulares com o tempo de geração constante. O tempo de geração é o período necessário para uma célula se duplicar. Como os nutrientes estão em excesso nesta fase, as células se dividem bastante de acordo com seu(s): Metabolismo; Meio de cultura; Outros fatores (temperatura, pH e água). Log (ou exponencial) Fase também caracterizada pelo crescimento microbiano, embora, ao mesmo tempo, se observe um aumento no número de células mortas. O esgotamento de nutrientes do meio de cultivo leva ao acúmulo de resíduos. Por isso, o pH do meio torna- se ácido, causando danos para as células. Estacionária Se for crescente, a situação descrita no item acima leva à morte da população de bactérias quando todos os recursos forem consumidos. Declínio Observe o grá�co a seguir: Perceba no grá�co da fugira, o aumento dos valores de densidade ótica à direita. De um valor aproximado de 0,13 de turbidez, a fase exponencial eleva o valor em seis vezes. A medida da turbidez é um recurso laboratorial de fácil veri�cação do crescimento de bactérias em meio líquido. Ao crescerem, as bactérias tornam os frascos mais turvos; com isso, a luz atravessa com menos intensidade do que antes, fornecendo os valores de densidade ótica. A curva de crescimento só poderá ser observada em experiência se não houver nenhuma interferência. Exemplos: repor os nutrientes consumidos ou acertar o pH do meio de cultura. Curva de crescimento típica de uma população de bactérias. | Fonte: (MADIGAN et al., 2016) Diante de tantos micro-organismos presentes no ambiente, é muito importante controlar o crescimento deles utilizando agentes físicos e químicos. Eles podem atuar eliminando totalmente a população microbiana ou impedindo o seu crescimento. Exemplo Para controle de populações microbianas há algumas ações que podemos utilizar. Como por exemplo: Controle físico: como: uso de chama em objetos contaminados, calor seco e úmido, radiações gama e ultravioleta e �ltração. Controle químico: álcool, fenóis, detergentes e agentes oxidantes. Nesta aula, você aprendeu sobre os tipos de metabolismo dos principais grupos microbianos. A importância desse conhecimento reside em sua aplicação em vários processos industriais, como a biotecnologia. Atividade 1. Com relação ao metabolismo de seres vivos, assinale a opção que represente, respectivamente, a síntese de moléculas complexas a partir de formas mais simples e a construção das moléculas complexas: a) Anabolismo e catabolismo. b) Metabolismo aeróbio e anaeróbio. c) Fase log e declínio. d) Catabolismo e anabolismo. e) Fase lag e log. 2. Micro-organismos aeróbios toleram a presença de oxigênio porque possuem uma enzima chamada: a) ATPase b) NADH c) Oxigenase d) Superóxido dismutase. e) Cadeia transportadora de elétrons. 3. Em relação às condições de temperatura para crescimento, as temperaturas elevadas normalmente levam a (à): a) Taxas de crescimento mais elevado. c) Um estado de equilíbrio. d) Morte da bactéria. d) Morte da bactéria. e) Situações específicas dependendo da espécie. Notas degradativas 1 Nas reações degradativas, muitas vezes são utilizadas moléculas de água para quebrar essas ligações. Trata-se da chamada hidrólise. ATPase2 No processo com a ATPase, algumas enzimas desidrogenases especí�cas retiram prótons e elétrons, transferindo-os para coenzimas do tipo NAD ou FAD . Elas os encaminham para uma série de aceptores numa cadeia de transporte de elétrons até o oxigênio ou outro tipo de aceptor �nal. A cada H transportado, a enzima ATPase presente na membrana citoplasmática é ativada, promovendo a ligação entre ADP e o fosfato inorgânico (Pi). + + + glicólise3 A glicólise é chamada também de Embden-Meyerhoff em homenagem aos pesquisadores Gustav Embden e Otto Meyerhoff, mas um dos primeiros a estudá-la foi Pasteur, em 1860, com a fermentação de leveduras. Pseudomonas4 Essas bactérias reduzem o nitrato a nitrito (NO ), oxido nitroso (N O) ou gás CO .2- 2 2 fermentação dos vinhos5 Provavelmente, você deve lembrar que, na primeira aula, Louis Pasteur de�niu o chamado Efeito Pasteur. Ele viu que o número de micro-organismos presentes nas uvas amassadas aumentou logo no início desse processo, mas, com a redução da concentração de oxigênio, eles começavam a produzir etanol. Ele associou o fermento à concentração de oxigênio: quanto mais oxigênio, menos etanol. É o que hoje se faz nos tonéis de vinho, não permitindo a entrada de oxigênio para não reduzir a fermentação. Somos grandes produtores de álcool a partir do açúcar da cana pelo controle do mesmo processo. psicró�los6 Recentemente, um grupo de pesquisadores da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) identi�cou a bactéria psicró�la Deinococcus sp. Ela é capaz de resistir a radiações. Cientistas acreditam que isso pode ser útil na indústria de cosméticos e na busca por novos medicamentos. 25 e 40 °C7 Para as bactérias patogênicas a temperatura ótima de crescimento é 37 °C, igual ou próxima a dos animais que colonizam. desnaturando-as8 Por essa razão também que a maioria dos alimentos ácidos são protegidos da deterioração por microrganismos. Referências TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L.Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2010. MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; BENDER, K. S.; B., D. H.; STAHL, D. A. Microbiologia de Brock. Porto Alegre: Artmed, 2016. Próxima aula Tipos de metabolismo microbiano; Condições para crescimento de populações de bactérias. Explore mais Sugestões de vídeo: Bactérias que degradam petróleo <https://www.youtube.com/watch?v=kqx0zdmvbSA> . Bactérias que comem plástico <https://www.ted.com/talks/two_young_scientists_break_down_plastics_with_bacteria#t-160867> . https://www.youtube.com/watch?v=kqx0zdmvbSA https://www.ted.com/talks/two_young_scientists_break_down_plastics_with_bacteria#t-160867