qPCR - método qualitativo

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qPCR 
A tecnologia de PCR em Tempo Real é uma evolução do método de PCR (ou Reação em Cadeia da Polimerase). Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas análises. Com apenas um único fragmento de DNA é possível reproduzir milhões de cópias.
Os ensaios de PCR em Tempo Real são muito mais sensíveis, específicos e rápidos, principalmente quando comparados aos testes convencionais, levando de 2 a 3 horas para emitir o resultado. Para diagnósticos, são amplamente utilizados na infectologia clínica para a detecção de patógenos, identificando infecções virais e bacterianas, em que a cultura dos agentes causadores pode ser muito difícil ou até mesmo impossível. Este método não depende do isolamento ou crescimento do patógeno ou da detecção de uma resposta imune contra o agente. Em vez disso, o que é detectado nos ensaios são as sequências de ácidos nucleicos dos patógenos. Alguns exemplos de sua aplicação consistem no diagnóstico de dengue, infecções respiratórias, ISTs, anteriormente chamada de DSTs, e meningites.
Para entender completamente o que é a qPCR precisamos entender primeiro qual é o processo da PCR.
PCR convencional
Existem 3 etapas que compreendem a reação de PCR:
- Desnaturação – O DNA gnômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado. Ou seja, ocorre a separação da dupla fita de DNA.
- Anelamento ou Hibridização – os iniciadores ou primers se ligam a fita de DNA que se pretende amplificar. Um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. São eles que irão identificar/marcar qual trecho de interesse do DNA deverá ser copiado.
- Extensão ou polimerização – com o ponto de partida já identificado, a Taq polimerase liga-se a fita sinalizada pelo primer, complementando-a. Inicia-se então a extensão do novo fragmento de DNA, formando novamente uma fita dupla de DNA.
Esse ciclo é realizado inúmeras vezes até atingir milhões de cópias. Na PCR convencional, a detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose. Após a coloração, ocorre a visualização do DNA pesquisado.
 qPCR
 O resultado é visualizado imediatamente, dispensando a eletroforese. Isto é possível pela adição de sondas fluorescentes às reações de PCR. A amplificação do DNA-alvo é monitorada durante o processo de qPCR. A medida que o DNA é amplificado, o nível de fluorescência cresce proporcionalmente.
O equipamento é capaz de detectar a fluorescência eventualmente produzida pela amostra e assim a técnica permite acompanhar a reação e a apresentação dos resultados em tempo real.
Além disso, por meio do monitoramento da taxa de aumento da fluorescência na reação de PCR, é possível determinar com precisão a quantidade de DNA-alvo presente na amostra original. A qPCR pode ser utilizada para se avaliar a presença de um patógeno em uma amostra, podendo ser um teste qualitativo ou quantitativo.
APLICAÇÃO BIOTECNOLÓGICA: 
Análise qualitativa na infectologia clínica para a detecção de patógenos em animais
1- Coleta de amostra do animal possivelmente contaminado (que apresenta sintomas característicos da infecção por um patógeno). Vai ser extraído o material genético do animal e possivelmente do patógeno.
2- Amplificação apenas do material genético do patógeno, por meio de primers e sondas fluorescentes específicos ao genoma do patógeno a ser indentificado. Ou seja, quando amplificar (e se amplificar), vai amplificar apenas o material genético do patógeno.
3- Geração (ou não) de fluorescência. Se o animal estiver contaminado, havia o patógeno na amostra e os primers se ligaram no material genética e o amplificaram, ocorrendo a fluorescência. Se o animal não estava contaminado, não havia material genético dos patógenos e então os primers não se ligaram, não ocorreu ampliação e consequentemente, não tem fluorescência. 
OBS: na PCR os equipamentos necessários é o termociclador. Na RT-PCR precisa de termociclador, detector de fluorescência, e um agente que excite a fluorescência (lâmpadas, laser, etc).