Técnicas Moleculares

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Técnicas moleculares 
@study.sakata 
MARCOS HISTÓRICOS 
 1862 – Gregor Johann Mendel com as leis 
da hereditariedade 
 1909 – Wihelm Johannsesn caracterizando 
o gene sendo a unidade mendeliana da 
heredietariedade 
 1944 – Oswald T. Avery, Colin M, MacLeod 
descoberta do DNA, e suas características 
hereditárias 
 1953 – James Watson, Francis Crick e 
Rosalind Franklin conseguiram identificar a 
estrutura do DNA 
 1971 – Walter Gilbert e Frederick Sanger 
com os métodos para o sequenciamento 
de DNA 
 1982 – NCBI GENBANK, a criação do 
banco de dados de sequências 
biológicas 
 1985 – Kary Mullis com a criação do PCR 
(polymerase chain reaction) 
 1986 – Leroy Hood, melhoramento da 
técnica de sequenciamento, fazendo de 
forma mais automatizada 
 2001 – Sequenciamento do DNA humano 
inteiro 
APLICAÇÕES 
1. Diagnostico de doenças hereditárias 
(genes mutados, Angelina Jolie por 
exemplo) e infecciosas, a técnica mais 
utilizada para isso é o PCR 
2. Detecção de agentes patogênicos e 
mutações 
3. Determinação do sexo a partir do sangue 
materno (gene SRY, presença indica sexo 
masculino) 
4. Medicina forense 
5. Verificação de polimorfismos 
6. Verificação de mutações 
7. Análise de expressão gênica (análise do 
RNA) 
PREPARO DA AMOSTRA 
Pode-se coletar qualquer material que contenha 
um material genético, como por exemplo 
amostra sanguínea e até mesmo de urina, 
podendo ser de diferentes procedimentos, como 
por exemplo a punção de vasos sanguíneos, 
biópsias, esfregaços, cultivos microbiológicos ou 
fragmentos de tecidos 
Para uma melhor eficácia da análise do material 
genético, deve-se conservá-lo em temperaturas 
baixas para impedir a ação das 
DNAases/RNAases, responsáveis pela 
degradação do material genético 
Os procedimentos utilizados na técnica molecular 
são: 
1. A extração de DNA ou RNA 
2. Análise da integridade do RNA ou DNA 
(qualitativo) 
3. Quantificação do material genético 
4. Conversão de RNA para cDNA – com a 
extração de RNA 
5. Técnica molecular: PCR, sequenciamento, 
NGS, entre outros 
Geralmente, os processos 1, 2 e 3 são realizados 
para todos os casos, de PCR, sequenciamento e 
etc 
EXTRAÇÃO DO DNA OU RNA 
Para a extração do DNA, é necessário realizar as 
seguintes etapas: 
1. Lise celular 
2. Separação dos constituintes celulares 
3. Precipitação do DNA 
Lise celular 
Deve-se romper a membrana celular da célula 
para conseguir acessar o material genético, 
podendo ser realizado através do uso de 
detergente ou então com o uso de ultrassom (as 
vibrações rompem a membrana), sendo feitas 
geralmente em soluções tamponadas para evitar 
a variação do pH 
Vale ressaltar que é necessário a adição de 
EDTA, um agente quelante que auxilia na 
inibição da ação das DNAases/RNAases, já que 
se ligam aos cofatores de cálcio e magnésio da 
enzima, inibindo sua ação 
 
 
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Separação dos constituintes celulares 
A separação dos componentes celulares é 
realizada através de uma centrifugação, 
separando a solução em 3 fases: 
 Fase aquosa – onde o DNA é suspenso 
pela adição de fenol ou clorofórmio 
 Fase intermediária – contém proteínas 
mais ‘leves’ 
 Fase orgânica – componentes mais 
pesados, como proteínas maiores e 
determinadas células, por exemplo 
 
Precipitação do DNA 
Para a ‘captura’ do DNA, é necessário que seja 
feita a precipitação do mesmo, a qual é 
realizada em condições de baixa temperatura e 
com elevada concentração salina 
É adicionado etanol absoluto, isopropanol (mais 
comum) ou soluções de acetato de amônio que 
são responsáveis pela precipitação do material 
genético 
 
A extração do RNA é semelhante ao processo do 
DNA, a diferença se refere ao tipo de materiais 
utilizados, ou seja, há a possibilidade de escolha 
por meio das substâncias selecionadas para o 
processo 
QUANTIFICAÇÃO E QUALIDADE DO 
MATERIAL GENÉTICO 
O método mais comum para a determinação da 
qualidade do material genético é o uso da 
técnica de eletroforese em gel de agarose 
 
O processo é caracterizado pelo uso de uma 
fonte de energia com o polo + e – , pelo brometo 
de etídio como marcador de ácidos nucleicos 
(marco fluorescente) e o uso do gel de agarose 
que atua como uma malha para ‘filtrar’ o DNA 
Como o material genético possui cargas, ele 
tende a correr do polo negativo ao positivo, de 
forma que o gel vai filtrando os fragmentos com 
maior tamanho (maior quantidade de DNA) dos 
que possuem um menor tamanho. O material 
genético com maior peso/sequência fica 
localizados na região de polo negativo, sendo 
separados em bandas 
 
 
 
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Além da análise qualitativa (verificação da 
integridade do material) é possível observar 
quantitativamente também a amostra, de modo 
que quanto maior a intensidade da banda, maior 
a amostra de DNA coletada – não é precisa 
AMPLIFICAÇÃO DE DNA PELA REAÇÃO EM 
CADEIA DA DNA POLIMERASE (PCR) 
A técnica de PCR (reação em cadeia da 
polimerase) é caracterizada pela grande 
quantidade de um determinado fragmento do 
DNA, com técnicas específicas e através de 
repetidos ciclos 
Pode ser utilizada em: diagnóstico de doenças 
infecciosas, clonagem de DNA e analises forenses 
de DNA 
A técnica de PCR está intrinsicamente 
relacionada com o uso da eletroforese em gel 
quando se trata de diagnósticos e do seu uso 
forense 
Essa técnica permite a amplificação da 
quantidade de DNA específico, utiliza-se de 
principalmente: 
 Enzimas 
 DNA taq polimerase 
 dNTP 
 Sequências iniciadoras específicas 
(primers) 
 Variação de temperatura 
Método 
As etapas básicas da PCR compreendem-se por: 
Desnaturação: Aquecimento do material 
genético a fim de separar as fitas 
Anelamento: Ocorre o resfriamento para que os 
primers específicos possam se acoplar na 
sequência complementar do DNA molde 
Extensão: Novamente há o aquecimento do DNA 
para que haja a ação da taq DNA polimerase 
O processo da PCR (reação em cadeia da DNA 
polimerase) é semelhante ao processo de 
replicação do material genético, visto que ocorre 
sua amplificação em relação à quantidade 
Como é uma técnica in vitro, não é possível 
colocar todas as enzimas que participam no 
processo de replicação, visto que seriam 
componentes que atuariam sem controle, como 
por exemplo a DNA helicase, caso colocada no 
meio, poderia desfazer as ligações de forma 
anormal (um dos principais problemas) 
Por isso, é de extrema importância o processo da 
variação e temperatura, que ao ser elevada, 
rompe as ligações de hidrogênio do DNA 
permitindo a abertura entre as fitas 
Como a DNA polimerase humana responde a 
temperaturas especificas, ao ser colocada neste 
meio, iria desnaturar. Portanto, utiliza-se a enzima 
taq DNA polimerase, uma enzima de bactéria 
que possui a capacidade de resistir à altas 
temperaturas 
Posteriormente, há a ação dos primers 
específicos (determinação da área de interesse) 
sendo acoplados na região complementar do 
DNA, possibilitando então a atuação da taq DNA 
polimerase e por fim finalizando o primeiro ciclo 
da PCR 
Tal processo ocorre diversas vezes, em ciclos, o 
que caracteriza a amplificação do DNA por PCR 
OBS: Diagnóstico de doenças infecciosas 
Para a identificação de vírus/bactérias, é possível 
realizar pelo método de PCR. É realizada a 
amplificação do material genético do agente 
patogênico e então, são utilizadas sequências 
iniciadoras deste subtipo de vírus/bactérias -
primers para a amplificação do material 
Após esse processo, é colocada a amostra na 
eletroforese, caso seja positivo haverá uma maior 
abundância de fluorescência 
PCR EM TEMPO REAL 
É uma técnica realizada em um instrumento 
fechado, que contém um termociclador 
acoplado a um sistema óptico para a excitação 
da fluorescência e um sistema de detecção dos 
sinais fluorescentes 
Identificar um gene qualquer ou entãoserve 
para determinar a expressividade de um gene 
 
 
 
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COMPONENTES 
 
O processo é realizado e computadorizado 
através de um gráfico, mas a análise é 
semelhante à da eletroforese por bandas, ou 
seja, quanto maior a curva maior a amplificação 
do gene selecionado 
Exemplificando, se o gráfico se trata-se de algum 
teste comparativo entre indivíduos infectados, a 
curva mais à esquerda seria a do individuo com a 
maior carga patogênica, visto que possui a maior 
quantidade de genes amplificados 
SEQUENCIADORES DE DNA 
São equipamentos que leem uma amostra de 
DNA e geram um arquivo eletrônico com 
símbolos que representam a sequência de bases 
nitrogenadas contidas na amostra 
 Sequenciador de eletroforese – Processa 
no máximo 96 fragmentos por vez 
 NGS – podem ler até bilhões de 
fragmentos ao mesmo tempo 
O sequenciamento de DNA é feito com maior 
frequência pelo método de Sanger 
COMPONENTES 
 Uma enzima DNA polimerase 
 Um primer, que é um pequeno fragmento 
de DNA de fita simples que se liga ao DNA 
molde e atua como um "iniciador" para a 
polimerase 
 Os quatro nucleotídeos do DNA (dATP, 
dTTP, dCTP, dGTP) 
 O DNA molde a ser sequenciado 
 Terminadores de cadeia, para os quatro 
nucleotídeos (ddATP, ddTTP, ddCTP, 
ddGTP), cada uma marcada com um 
corante de uma cor diferente 
 
MÉTODO 
A amostra de DNA a ser sequenciada é 
combinada em um tubo com primer, DNA 
polimerase e nucleotídeos de DNA (dATP, dTTP, 
dGTP, and dCTP). Os quatro nucleotídeos 
terminadores de cadeia marcados com corantes 
são adicionados também, mas em 
concentração muito menor que a dos 
nucleotídeos comuns 
A mistura é primeiro aquecida para a 
denaturação do DNA molde (separar as fitas), 
então resfriadas para que os primers possam se 
ligar ao molde de fita simples. Uma vez que o 
primer se ligou, a temperatura é aumentada 
novamente, permitindo que a DNA polimerase 
sintetize um novo DNA a partir do primer. A DNA 
polimerase continuará a adicionar nucleotídeos à 
cadeia até que aconteça a adição de um 
dideoxinucleotídeo ao invés de um normal. Nesse 
ponto, os nucleotídeos não podem mais ser 
adicionados, e, portanto, a fita terminará em um 
dideoxinucleotídeo. 
Este processo é repetido em um número de 
ciclos. Quando o ciclo se completa, é 
praticamente garantido que um 
dideóxinucleotídeo terá se incorporado em todas 
as posições do DNA alvo em pelo menos uma 
reação. Ou seja, o tubo irá conter fragmentos de 
diferentes comprimentos, terminando em cada 
uma das posições de nucleotídeos no DNA 
original. (veja a figura abaixo). As extremidades 
dos fragmentos serão rotuladas com corantes 
que indicam o nucleotídeo final. 
Depois que a reação é executada, os 
fragmentos são levados através de um longo e 
fino tubo contanto uma matriz de gel em um 
processo chamado de electroforese capilar em 
 
 
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gel. Pequenos fragmentos movem-se 
rapidamente através dos poros do gel, enquanto 
longos fragmentos movem-se mais devagar. 
Assim que cada fragmento cruza a "linha de 
chegada" no final do tubo, ele é iluminado por 
um laser, permitindo que o corante anexado seja 
detectado. 
O menor fragmento (que termina apenas um 
nucleotídeo após o primer) atravessa a linha de 
chegada primeiro, seguido do próximo menor 
fragmento (terminando dois nucleotídeos após o 
primer), e assim por diante. Portanto, a partir das 
cores dos corantes registradas uma após a outra 
no detector, a sequência do pedaço original de 
DNA pode ser construída com um nucleotídeo 
por vez. Os dados registrados pelo detector 
consistem em uma série de picos em intensidade 
de fluorescência, como mostrado no 
cromatograma acima. A sequência de DNA é 
lida a partir dos picos no cromatograma. 
 
 
BENEFÍCIOS 
Obter informações genômicas em curto tempo 
com custo razoável 
Flexibilidade para ser aplicada em uma série de 
estudos genômicos 
Sequenciamento gênico completo em 
determinadas situações e condições biológicas 
Exoma – conjunto de éxons, a análise completa 
do exoma compreende-se pela análise dos éxons 
do DNA, portanto às regiões codificantes do 
mRNA 
NGS 
NGS – Nova geração de sequenciadores de DNA 
 
GENOTIPAGEM DE MICRORGANISMOS 
Identifica quais são as mutações entre os 
microrganismos circulantes 
Pode identificar espécies novas 
Auxilia no diagnóstico e tratamento 
Auxilia na definição de perfis epidemiológicos 
Utiliza-se da metodologia da técnica de 
sequenciamento automático de DNA 
Exemplo: sequenciamento do SARS-CoV-2 
TÉCNICA DO DNA RECOMBINANTE 
Técnicas que visam o isolamento de genes e a 
introdução de genoma exógeno em outros 
microrganismos 
São produzidos organismos transgênicos, com 
diversas finalidades 
Ampla aplicação comercial e tecnológica 
Utilização do cDNA (provém do rRNA) e é 
aplicado em um plasmídeo, por exemplo 
Exemplo: em fase de desenvolvimento, vacina 
da Bio-Manguinhos 
 
 
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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
Enzimas que as bactérias possuem que clivam em 
momentos específicos -> sequencias 
palíndromas, faz parte do sistema imunológico da 
bactéria 
São enzimas encontradas em bactérias, utilizadas 
para realizar cortes no DNA 
Cada enzima de restrição corta o material 
genético em um sitio especifico, que são 
palíndromas 
 
As extremidades das partes cortadas recebem o 
nome de extremidades de ligação, pois se 
encaixam perfeitamente 
Exemplo: Vacina do HPV 
A vacina contra o papilomavírus humano (HPV) 
contém partículas semelhantes à do vírus – 
capsídeos virais vazios sem DNA, produzidas a 
partir da técnica de DNA recombinante 
TÉCNICA CRISPR CAS 9 
Denominada de repetições palindrômicas curtas 
agrupadas e regularmente interespeaçadas 
Sequências na bactéria que são CRISPR atuam 
como o sistema imunológico da bactéria, utiliza 
como memória imunológica, principalmente 
contra os bacteriófagos 
Enzima CAS2 fragmenta o genoma do vírus e 
coloca na região de CRISPR -> o fragmento 
passa a fazer parte do DNA da bactéria, sendo 
um ganho de informação, atuando na memória 
imunológica 
Se entrar em contato novamente, a bactéria 
consegue fabricar o gRNA (guia), junto com a 
CAS9 (endonuclease) e então consegue clivar o 
DNA do vírus na região que estava na memória, 
impedindo a infecção viral 
RNAg + cas 9 -> editar um gene em célula 
humana 
Possibilita a quebra de qualquer gene, por isso é 
fácil a edição de cor dos olhos, pele e entre 
outros (genes ativos) 
Utilizada para transplante de órgãos – molécula 
de MHC (polimórfica), por isso a rejeição de 
órgãos, ativam a resposta imune 
 Utilizar porcos para transplante de órgãos, 
principalmente o renal (maior semelhança) 
Rejeição hiperaguda – gene muito 
imunogênico, tiraram a proteína e o transplante 
foi eficaz, não houve rejeição