REVISÃOGENÉTICA MOLECULAR

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REVISÃO P2 GENÉTICA MOLECULAR 
CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA EM EUCARIONTES 
· Os procariotos respondem prontamente a estímulos do meio através da transcrição gênica
· Já os eucariotos, por serem mais complexos, também possuem mecanismos de regulação, porém mais complexos, que atuam em diferentes níveis (regulação transcricional e pós-transcricional) 
· Sinais que regulam a expressão gênica 
1. Hormônios (ex. esteroides)
2. Fatores de crescimento e de diferenciação celular
3. Contato célula-célula (adesão celular)
4. Alterações nutricionais 
5. Alterações ambientais (ex. choque térmico)
· Via de transdução de sinal 
· Regulação do inicio da transcrição 
- Controle ocorre essencialmente junto a região promotora (core) do gene
- Regulação interfere na formação do complexo basal de transcrição (RNA polimerase + fatores gerais de transcrição)
· Estrutura do gene transcrito pela RNA polimerase II 
· REGIÃO CORE DO PROMOTOR contém os elementos mínimos necessários para permitir o inicio da transcrição (reconhecimento do ponto de início), podendo ser expresso em qualquer tipo celular
· O promotor (região core) e seus elementos básicos 
- GGGCGG GC Box (elemento multicópia – ativo nas duas orientações)
- CCAAT CAAT Box (determina a eficiência do promotor, mas não influencia a especificidade do mesmo – ativo nas duas orientações)
- TATA TATA Box (formação do complexo de iniciação da transcrição – reconhecimento do startpoint; único com posição fixa)
· A expressão a partir da região core do promotor é sempre basal – baixa eficiência 
· Para transcrição máxima, proteínas ativadoras (trans-atuantes) devem se ligar às regiões mais distais do próprio promotor ou a enhancers (cis-atuantes)
· Ativadores = fatores de transcrição específicos 
· GC Box e CAAT Box são reconhecidos por um ou diferentes tipos de ativadores. Podem ser ubíquos ou tecidos-específicos 
· ATIVADORES
- Recrutam as proteínas que tornam a cromatina acessível ao maquinário de transcrição 
- Aumentam a taxa de associação do complexo basal de transcrição junto ao promotor
- Normalmente são específicos para um gene ou família gênica
- Reconhece elementos cis-regulatórios (enhancers) presentes no DNA e acoplam a transcrição à necessidade fisiológica da célula/organismo
· Elementos distais que regulam a expressão de genes em eucariontes ENHANCERS 
· ENHANCERS 
- São os principais determinantes da transcrição espaço-temporal
- Um gene pode ter vários elementos enhancers, que podem ser ativados em diferentes tipos celulares 
- Enhancers podem ser usados para inibir a transcrição. Em alguns casos, o mesmo fator de transcrição que ativa um gene pode reprimir outro
- Os “enhancers negativos” são chamados silenciadores 
· Ativadores e o complexo basal o complexo basal de transcrição sofre regulação de fatores de transcrição específicos 
· INSULADORES Bloqueia a ação do enhancer evitando sua interferência nos genes vizinhos – os Ins são reconhecidos por proteínas especializadas. Alternativamente atuam inibindo os efeitos repressores da heterocromatina evitando sua propagação
· Regulação em Eucariotos 
- Transcrição envolve fatores de transcrição e diversas proteínas regulatórias auxiliares (formando complexos ativadores ou repressores)
- A associação de proteínas regulatórias a um enhancer pode também ter efeito negativo sobre a expressão (silencer elemento)
- A existência de um repressor gene – específico como em procariontes seria praticamente inviável em eucariotos (regulação com alta especificidade)
- Existência de controle combinatório
· Controle combinatório 
· Modelo combinatório de regulação 
· Fatores de transcrição – Características e modo de ação 
- Estrutura geral 
· Estrutura dos domínios que se ligam ao DNA 
- Proteínas homeodomain 
- Proteínas dedos de zinco
1- C2H2 (3 ou 4 dedos) – monômeros; ex: TFIIIA
2- C4 (2 dedos) – homo ou heterodímeros – receptores intracelulares 
3- C6 – homodímero – Gal4 de levedura 
- Proteínas zíper de leucinas – heterodímeros – leu a cada 7 aminoácidos – GCN4 de levedura 
- Proteínas Helix-loop-helix – heterodímeros 
- Proteínas Helix-turn-helix – dímeros 
· Repressores eucarióticos podem inibir transcrição por outros mecanismos 
· Proteínas regulatórias são reguladas de diferentes maneiras 
· Exemplos de regulação ação hormonal (esteroides) e fosforilação por quinases 
· Ligantes que utilizam receptores intracelulares glicocorticoides, vitamina A 
· Em presença de dexametasona, o receptor é translocado para o núcleo 
· Ativação da transcrição por ação hormonal e ativação do receptor 
· Elementos de resposta aos receptores intracelulares 
· Ativação da transcrição por fosforilação do receptor (sistema JAK/STAT)
· Estrutura da cromatina e regulação
- Cromatina precisa estar adaptada para que ocorra a transcrição
- A ativação da transcrição requer alterações na estrutura da cromatina junto á região core do promotor, aos enhancers e a outros elementos regulatórios 
- O remodelamento é um processo ativo que envolve o deslocamento e rearranjo dos nucleossomos
- Depende da configuração das histonas: a forte associação das histonas ao DNA conduz a repressão da expressão gênica 
· Remodelamento da cromatina envolve duas classes de fatores
1. Enzimas de acetilação (HAT)/deacetilação (HDACs) das histonas: promovem modificações covalentes
2. Complexos de remodelação da cromatina que atuam nos nucleossomos. 
· Acetilação das histonas e cromatina acetilação ou metilação da lisina, ou fosforilação da serina, reduz a carga liquida das histonas 
· Hiperacetilação de histonas – complexos ativadores da transcrição;
 Envolve um ativador da transcrição com atividade de acetilação 
- Acetilação ocorre nas lisinas presentes na região N-terminal das histonas
- Bloqueia as cargas positivas e reduz a afinidade das histonas pelo DNA 
Envolve um complexo repressor da transcrição com atividade DA 
- Remoção libera as cargas positivas = aumento da afinidade 
· Fatores de remodelação da cromatina 
- Alteram o posicionamento dos nucleossomos na cromatina em resposta a ligação de ativadores, podendo: deslocar nucleossomos deslizando para os lados; reestruturar os nucleossomos; transferir os nucleossomos para a fita complementar 
· O papel da metilação na regulação 
- Metilação ocorre junto ao dinucleotídeo CpG em regiões chamadas ilhas CpG presentes em regiões específicas do genoma 
Ex. Ilhas CpG em humanos ocorrem nas regiões promotoras de genes codificadoras de proteínas 
- Estado de metilação dos genes varia em diferentes tecidos e está correlacionado com a ativação da expressão 
- Metilação do DNA impede que a ligação dos fatores de transcrição na região modificada 
- Metilação tem efeito sobre o posicionamento dos nucleossomos conduzindo as estruturas especializadas diretamente associadas com a repressão da transcrição 
- A metilação recruta fatores capazes de se ligar exclusivamente a regiões metiladas do DNA, os quais por sua vez, inibem a ligação dos fatores de transcrição
EX. MeCP1 e MeCP2 (a MeCP2 é capaz de recrutar um complexo com atividade de deacetilação de histonas para junto da região metilada
RNA’s NÃO CODIFICANTES 
· Mais de 90% do genoma humano é transcrito, mas apenas 1-2% codifica proteínas
· ncRNA em procariontes – sRNAs grande numero de sRNAs que estão relacionados com respostas ao stress ambiental 
· ncRNA em eucariotos pequenos ncRNAs – RNAi (< 200 nucleotídeos)
· Experimento
- Hipóteses:
1- Efeito adverso na transcrição ou degradação citoplasmática do transcrito?? Nuclear RUN OFF: taxa de transcrição normal
Conclusão: degradação citoplasmática do mRNA (pós-transcricional)
2- Silenciamento do gene endógeno e do transgene co-supressão 
· RNAi – pequenos RNAs estavam presentes em todos os experimentos; identificados em vários organismos eucariontes 
· RNAi podem ser classificados de acordo com sua origem e função: siRNA (defesa contra patógenos); miRNA (controle da expressão gênica/desenvolvimento)
· Como ocorre?
·MiRNA – fundamental para diversas funções celulares incluindo diferenciação tecidual, ciclo celular, proliferação e apoptose; defeitos nesse sistema estão relacionados à câncer, alterações neuropsiquiátricas, problemas cardíacos, etc.
· IncRNA – sua função varia de acordo com sua estrutura terciaria e composição; envolvidos em múltiplas funções regulatória: imprinting, função de enhancers, inativação do cromossomo X e estrutura da cromatina; são críticos para o desenvolvimento normal
· IncRNA e câncer 
· Inativação do cromossomo X – gene Xist IncRNA
· Regulação transcricional 
- O ncRNA HOTAIR seria responsável pelo recrutamento do complexo de remodelamento de cromatina PRC2, que atua através da metilação do DNA
- Podem atuar regulando a atividade da RNA polimerase II
- Um transcrito forma um triplex na região promotora que impede a ligação do cofator TFIID 
· miRNAs e câncer participam da modulação de oncogenes (genes que ativam o ciclo celular) e de supressores tumorais (suprimem a divisão celular 
ELEMENTOS DE TRANSPOSIÇÃO 
· Ampla distribuição: presentes nos genomas de procariotos e eucariotos
· PROCARIOTOS: transposição ocorre do/para o cromossomo bacteriano, plasmídeos e fagos
· EUCARIOTOS: transposição ocorre do/para o mesmo cromossomo ou para cromossomo diferente 
· Recombinação não homologa não existe homologia de sequência entre o elemento de transposição e o ponto de inserção do DNA. Embora aleatória existem hot spots!
· Consequências para o genoma 
- Provoca rearranjos que tem consequências importantes na evolução dos genomas:
1. Inserção em regiões contendo genes
2. Inserção em regiões regulatórias – modifica a expressão gênica
3. Produz mutações cromossomais 
- Contribuem para rearranjos genômicos e mutações espontâneas
- Auxiliam em efeitos de especiação e mudanças genômicas (ex. transferência de resistência a antibióticos e bactérias)
- ETs tem expressão altamente controlada pelo hospedeiro 
· Elementos de transposição (ET)
1. RETOTRANSPOSONS ETs que codificam uma transcriptase reversa e usam intermediários de RNA no processo de transposição. Produzem copias de DNA que se integram em novos locais (presentes em eucariotos)
2. TRANSPONS DE DNA Movem o DNA direto para uma nova posição no genoma OU replicam o DNA e integram uma nova cópia em outro local (presentes em procariotos e eucariotos)
· Mecanismos de transposição dos transposons de DNA 
· TRANSPOSASE A transposase é uma enzima que se liga ao final de um transposon e catalisa o movimento do transposon para outra parte do genoma por um mecanismo de corte e colagem ou um mecanismo de transposição replicativo.
· Processo replicativo co-integração
· Elementos de transposição em procariotos 
1. SEQUENCIAS DE INSERÇÃO (IS)
- Modulo de transposição bem simples
- Codifica proteínas para mobilização e inserção (transposase)
- IS1 identificado no operon lac de e. coli 
- Repetições terminais invertidas: presentes em todos os elementos IS conhecidos 
2. TRANSPOSIÇÃO DOS ELEMENTOS IS 
- Transposição requer uma transposase codificada pelo próprio IS
- Transposição começa com o reconhecimento das repetições terminais invertidas (ITRs) pela transposase
- Modelo “Cut and Paste” – DNA doador perde a cópia original 
- O corte no DNA alvo é realizado deixando uma extremidade fita simples. Após a inserção, uma DNA polimerase celular preenche as lacunas e a ligase refaz as ligações 
- Pequenas duplicações são criadas no sitio de inserção 
· A integração de um elemento IS pode: 
- Interromper regiões codificadoras ou regulatórias – mutações espontâneas nos operons 
- Alterar a expressão de genes vizinhos
- Provocar deleções e inversões no DNA adjacente 
- Pode resultar em crossing – over 
· Transposons bacterianos (Tn)
- Semelhantes aos elementos IS mas estruturalmente mais complexos, podendo carregar mais genes; 2 tipos:
1- Transpons compostos (Tn) – não replicativos
 Carregam genes (ex. gene para resistência à antibióticos) flanqueados por elemento IS 
 Transposase e regiões ITR fornecidas pelos elementos IS 
2- Transpons não compostos (Tn) – replicativos 
 Carregam genes (ex. gene para resistência à antibióticos) mas não são flanqueados por elemento IS
 têm sequencias terminais invertidas mas não relacionadas com os IS 
· Modelo de transposição dos Tn
- Similar aos modelos IS; inserção resulta em sequencias duplicadas curtas no DNA receptor 
- São na maioria não-replicativos (Transposon é perdido no DNA doador)
- Podem, em alguns casos, ser replicativos (envolve duplicação do DNA mobilizado) 
- Transposição resulta nas mesmas modificações dos elementos IS: inserções, deleções, mudanças na expressão gênica, ou duplicação
- Crossing-over 
· ELEMENTOS MÓVEIS EM EUCARIOTOS 
 Propriedades gerais dos Transposons (Tn) em plantas 
- Tem sequencias ITR e geram sequencias duplicadas curtas no ponto de inserção 
- Podem ativar ou reprimir genes alvos – causam mutações nos cromossomos (quebras) e podem interromper genes 
- 2 tipos 
1- Elementos Autônomos: capazes de se mobilizar de forma autônoma e codificam uma transposase funcional
2- Elementos não-autônomos: não são capazes de se mobilizar pois não tem transposase ativa. Portanto precisam de um Tn autônomo para transposição 
 Experimentos de McClintock 
· Elemento Ds está associado a quebras cromossômicas
· Dados relevantes sobre Ac e Ds 
- Elemento Ac é autônomo / elemento Ds é não-autônomo
- Ac tem 4,563 pares de base e contém ITRs de 11 pares de base e uma região interna que codifica uma transposase
- Ds varia de tamanho e sequencia, mas apresenta as mesmas sequencias ITRs de Ac 
- Varios elementos Ds são versões deletadas ou rearranjadas de Ac; Ds são, portanto, derivados de Ac
- Ac/Ds são regulados ao longo do desenvolvimento
- Ac/Ds fazem transposição durante a replicação do DNA (DNA hemimetilado) e não deixam cópias no DNA doador (não replicativos)
· Resumo
· TRANSPOSONS EM DROSOPHILA
- 15% do genoma da drosophila é composto por elementos móveis
1- Elemento P (500-2900 pb)
- Responsáveis pela Disgenesia hibrida originada no cruzamento de algumas linhagens de Drosophila (PxM)
- O elemento P codifica um repressor e uma transposase. O repressor é herdado maternalmente
- O repressor mantém os elementos P estáveis em indivíduos portadores do citótipo P (citoplasma com repressor)
- Portadores do citótipo M não tem repressor no citoplasma – ocorre mobilização de P 
· Retrotransposons
· Retrotransposons com LTR – Ty de levedura 
- Elementos Ty tem organização similar aos retrovírus. Contém sequencias terminais repetidas longas (LTRs) e duplicações curtas nas extremidades provenientes do DNA alvo
- Sintetiza um intermediário de RNA e produz DNA por transcrição reversa, o qual é inserido no alvo 
· Retrotransposons humanos sem LTR 
1. L-1 LINEs 
- 5% do genoma humano
- Contém duas regiões codificadoras. Uma que codifica uma proteína que liga RNA e a outra uma proteína com homologia às transcriptases reversas virais tendo atividade de endonuclease
- São autônomos e transcritos pela RNA polimerase II
- Existem casos de hemofilia que resultam da transposição de elementos L1
2. Alu SINEs 
- Sequencias moderadamente repetidas contendo sitio para enzima de restrição AluI (nem todos)
- 10-15% do genoma humano
- Flanqueadas por repetições diretas de 7-20 pb 
- Não são autônomas e se mobilizam com o auxílio de LINES (S1). São transcritas pela RNA polimerase III e apresentam similaridade com 7SL RNA (sinal de endereçamento)
- Alu SINEs detectadas em neurofibromas; resulta na perda de um éxon no gene NF1 = uma proteína não-funcional 
TRANSDUÇÃO DE SINAIS BIOLÓGICOS
· As células estão respondendo continuamente a sinais do ambiente externo e interno 
· Os seis passos da sinalização celular 
1. Síntese do sinal
2. Liberação do sinal (molécula sinalizadora) pela célula sinalizadora: exocitose, difusão, contato célula a célula 
3. Transporte do sinal para a célula alvo
4. Detecção do sinal por um receptor de membrana especifico5. Transdução e sinalização intracelular induzindo determinada resposta 
6. Remoção do sinal
· A transdução do sinal é o processo pelo qual uma célula converte um sinal extracelular em uma resposta específica 
· A Transdução esta envolvida na: comunicação célula-célula; resposta celular do ambiente; homeostase intracelular (comunicação interna)
· Via de sinalização genérica
· Características dos sistemas de transdução de sinais: especificidade e seletividade; amplificação do sinal; desestabilização /adaptação; integração
· Definições 
- O LIGANTE é a molécula sinalizadora (ex. hormônio, íon, feromônio, neurotransmissor, droga) 
- O ligante se liga a um sitio especifico de um RECEPTOR presente na célula alvo
- O receptor é ativado pela ligação do ligante – mudança de conformação 
· Respostas induzidas pela ligação de um sinal ao seu receptor podem ser divididas em 2 tipos
1. RESPOSTAS RÁPIDAS que não requerem mudanças na expressão gênica. Envolve alterações em proteínas pré-existentes e a resposta é limitada ao citoplasma 
2. RESPOSTAS PERSISTENTES que requerem alterações na expressão gênica. Para tal, o sinal precisa ser traduzido ate o núcleo
· Tipos de receptores
1. Superfície celular 
2. Intracelular (receptor no núcleo ou citoplasma)
· Tipos de receptores de superfície 
1. Canais de íons: ligação do ligante provoca uma mudança de conformação no receptor que permite a passagem de determinados íons (sódio, potássio, cálcio, cloro, prótons) 
2. Receptores acoplados a proteína G trimérica
3. Receptores associados a uma cinase: ligação do ligante provoca dimerização do receptor e ativação de uma cinase citosólica – Exemplo: JAK 
4. Receptores apresentam atividade enzimática intrínseca que é ativada pela ligação do ligante 
· O que determina a especificidade das respostas celulares aos ligantes? 
1. Presença ou ausência do receptor em determinada célula
2. A forma de transdução do sinal interno ou maquinário de respostas de determinados tipos celulares – diferentes tipos celulares podem apresentar diferentes respostas ao mesmo ligante em função dos componentes envolvidos 
Ex. acetilcolina promove: em células do musculo contração; e células secretoras secreção; e na musculatura cardíaca relaxamento
· Varia vias de transdução de sinal contém grandes complexos multiproteicos que são mantidos por proteínas adaptadoras – sinalização envolve interação proteína-proteína (especificidade)
· Os efeitos de vários ligantes são mediados por mensageiro secundários 
· Uma consequência comum da ligação de um ligante ao seu receptor é a ativação intracelular de proteínas cinases, resultando na fosforilação reversível da mesma e de outras proteínas intracelulares 
· Proteínas cinases e fosfatases citosólicas: serina/treonina; associadas a membrana: tirosina 
· Transdução envolve amplificação do sinal
· Exemplos 
1. Transdução mediada por proteínas G trimérica 
 Proteina de ligação a GTP/GDP
 Receptores acoplados a proteina G (GCPRs)
 Receptores GCPRs são ativados pelo ligante. Esses por sua vez, ativam a proteína G que ativa ou inibe enzimas (efetores) geradoras de mensageiros secundários específicos 
 Ativação da proteína G trimérica pelo GTP 
 Diferentes proteínas G transduzem sinais para diferentes efetores 
 Ativação da adenilato ciclase pela proteína G ativada (subunidade Gα)
 A via cAMP/PKA – CREB associa o sinal gerado pelo mensageiro cAMP à transcrição 
2. Transdução mediada por Ras 
 Ras = proteina G monomérica relacionada aos receptores de tirosina cinase (RTK)
 Ras – proliferação celular, apoptose, migração, diferenciação 
 Ativação de um receptor RTK pelo ligante 
 Ativação de Ras por GTP 
 
 Ativação de Ras associada ao fator de crescimento epidérmico (EGF)
 A cascata de fosforilação a partir de Ras ativada 
 As MAP-cinases podem ativar outras cinases presentes no citoplasma ou adentrar o núcleo e ativar FTs nucleares (Ex: TCF e SRF)
 Diferentes MAP-cinases atuam em diferentes tipos de respostas em eucariotos – múltiplas vias 
3. A via JAK/STAT
 Receptor de citosina associado a uma cinase citoplasmática 
 Fosforilação de STAT 
· Interação e regulação das vias de sinalização 
- Os efeitos da ativação dos receptores GPCRs e RTKs são mais complexos que uma simples resposta em cascata 
- A estimulação de tais receptores leva a produção de mensageiros múltiplos, e ambos podem inibir ou estimular a produção dos mesmos mensageiros
- A mesma resposta celular pode ser induzida por múltiplas vias de sinalização
- A interação de diferentes vias permite a regulação fina de determinadas atividades celulares