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Imunologia I unidade Estuda os mecanismos fisiológicos que os seres humanos usam para defender os corpos da invasão por microrganismos. Função: Consiste em evitar ou limitar infecções por microrganismos. - Bactérias, vírus, fungos, parasitas e substâncias estranhas – desencadear resposta imunológica Linhas de defesa: 1° linha (epitélios) Pele e membranas das mucosas. Vias respiratórias – muco; gástrica – HCL e vaginal meio ácido. HEMATOPOIESE: PRODUÇÃO DAS CÉLULAS DO SANGUE – 2° e 3° LINHA APÓS O NASCIMENTO: FUNÇÃO DA MEDULA ÓSSEA Imunidade: 2° linha = ramo inato – inespecífico. - Defesa inicial contra os microrganismos – mecanismos celulares e bioquímicos que já existiam antes da infecção. - Reagem apenas contra microrganismos – da mesma maneira a sucessivas infecções. Células Neutrófilos – fagocitose Macrófagos – fagocitose Eosinófilos – ataque a parasitas Imunidade Inata: Existe antes da exposição ao antígeno/microrganismo. Inespecífica: Barreiras – mucosas Células – NK Proteínas – interferon Fagocitose Inflamação Não é aumentada após a exposição ao microrganismo Não possuem memória Ramo inato desenvolve duas funções: - Morte dos microrganismos invasores Neutrófilos - Ativação de processos imunes adquiridos / adaptativos Macrófagos – realizam as duas funções Embora seja bem sucedida tanto na eliminação dos microrganismos quanto prevenção de doenças: Não é suficiente para a sobrevivência humana. Crianças com imunodeficiência com imunidade inata intacta – risco repetido de infecções de risco a vida – desprovidos de imunidade adquirida. Os componentes da resposta inata apresentam receptores de reconhecimento padrão: Reconhecem padrão molecular presente na superfície de microrganismos e ausentes em células humanas. Reconhecendo o que é exógeno – microrganismos Distinguindo do que é do próprio organismo. Imunidade Adquirida: 3° linha = ramo adquirido – específico Estimulada por agentes infecciosos – alta especificidade e habilidade de se lembrar e de responder com mais intensidade. Imunidade Humoral: Linfócitos B – produção de anticorpos: Neutralizar toxinas e vírus; Opsonizar bactérias. Imunidade Celular: Linfócitos T – produção de citocinas. Mecanismos de defesa específicos – resposta imune: Imunidade humoral: Anticorpos (imunoglobulinas) no plasma. macrófagos linfócitos T (T4) linfócitos B plasmócitos estimula Produção de interleucinas e interferon; formação anticorpos. Imunidade celular: . Destruição de células com vírus ou tumorais. . Linfócitos T (T8). . Linfócitos citotóxicos – natural killer. Imunidade Adquirida: Ocorre após exposição a um agente É específica Mediado por anticorpos produzidos pelos linfócitos B e pelos linfócitos T Memória de longa duração contra um antígeno específico Podendo ser ativa ou passiva. Especificidade Respostas imunológicas são específicas para cada antígeno Expressam em sua superfície receptores de membrana que conseguem distinguir - receptor de antígeno – TCR. Memória A exposição a um antígeno estranho aumenta a habilidade de responder novamente àquele antígeno. Autolimitação Todas as respostas imunológicas normais diminuem com o passar do tempo, fazendo com que o sistema imunológico retorne ao seu estado basal Hemostasia Antígenos desencadeia a resposta – destruir e eliminar Reduz o estímulo para ativação e sobrevivência dos linfócitos – morte. Idade – Resposta Imune: Imunidade inferior nos extremos da vida = recém-nascidos e idosos. Recém-nascidos Apresentam função de células T menos efetiva que os adultos Usam anticorpos passados pela mãe – decaem com o tempo – risco aumentado de infecção. Idosos Imunidade geralmente declina Resposta de anticorpos reduzida contra certos antígenos Menor quantidade de células T. Imunidade: Ativa Resistência induzida após o contato com antígenos exógenos Produção ativa um resposta imune Resistência de longa duração, porém a desvantagem em seu lento Estabelecimento. Exposição posteriores – IMUNIZADO. Ex.: contato com microrganismos, hepatite. Passiva Resistência baseada em anticorpos pré-formados em outro hospedeiro Apresenta disponibilidade imediata, porém a desvantagem de apresentar curta Duração. Ex.: anticorpo contra tétano – neutralizam a toxina. Resposta Imune: Inata & Adquirida INATA ADQUIRIDA A resposta é imediata Há um período de tempo para que a resposta seja máxima Não é específica para um único Ag É gerada para um Ag determinado Não resulta em memória imunológica Induz resposta de memória Neutrófilos Eosinófilos Os Neutrófilos são os granulócitos mais comuns no sangue. (55-70% de todos os Leucócitos são Neutrófilos). Eles tem núcleo segmentado, tipicamente com 2 a 5 lobos conectados entre si através de finas fitas de cromatina as quais podem ser difíceis de se ver. A célula pode aparentar ser multinucleada. São fagócitos capazes de ingerir microrganismos ou partículas. Ao fagocitar, forma-se o fagossomo onde os microrganismos serão mortos pela liberação de enzimas hidrolíticas e de espécie reativa de oxigênio. Os Eosinófilos correspondem a 2-5% do total de leucócitos, e são distinguíveis pelos seus grânulos acidofílicos (vermelho/laranja) proeminente contendo um componente conhecido como Proteína Básica Principal, a qual é tóxica para muitas larvas de parasitas. O núcleo tem usualmente apenas 2 a 3 lobos. As funções desse tipo de granulócito estão associadas com respostas alérgicas e defesa contra parasitas. Basófilos Monócitos Os Basófilos compreendem menos de 1% do total de leucócitos,e são distinguidos pelos grânulos azul escuro específicos proeminentes que contém histamina, heparina e outros componentes. Onúcleo está usualmente obscurecido pelo densidade dos grânulos. Os Basófilos estão associados com a resposta imune inata a antígenos externos, assim como na ocorrência de asma e anafilaxias. Os Monócitos são as maiores células vistas no esfregaço sanguíneo e constitui 5 a 8% dos leucócitos. Seu núcleo não é multilobular como os granulócitos,mas pode ser em forma de “U” com cromatina aparentemente reticular. O citoplasma dos monócitos contém numerosos grânulos lisossomais os quais dão a ele uma aparência acinzentada de vidro fosco. Os Monócitos saem eventualmente da corrente sanguínea e se tornam macrófagos tissulares, os quais são responsáveis pela defesa contra certos tipos de invasores Macrófagos Linfócito S são células de grandes dimensões do tecido conjuntivo, ricos em lisossomas, que fagocitam elementos estranhos. Ativam mecanismos microbicidas. Apresentam antígenos aos linfócitos. O linfócito é uma célula arredondada ou ovalada com um núcleo oval ou em forma de rim que ocupa a maior parte da célula. O nucléolo pode estar presente mas a cromatina densaimpede a distinção. Possui um diâmetro de 6 a 16 micrômetros. Normalmente são menores que osmonócitos. Linfócitos T Regulatória Mediadas por células T auxiliares – CD4+ - produção de interleucinas Ex.: IL4 e IL5 – auxiliam os LB na produção de anticorpos / interferon gama – ativa macrófagos Efetoras Mediadas por células citotóxicas – CD8+ Matam células infectadas por vírus e células tumorais. CD4+ desempenham as funções Auxiliam no desenvolvimento de células B em plasmócitos – produtores de anticorpos Auxiliam p desenvolvimento de células T CD8 – T citotóxica ativadas Auxiliam macrófagos a efetuarem a hipersensibilidade tardia Resposta Th-1: produção de interferon gama e IL-2 – aitvam macrófagos e LT-CD8 Resposta Th-2: produção de IL-4 e 5 - LB – plasmócitos – anticorpos. CD8+ Funções citotóxica Matam células infectadas por vírus e tumores Liberam perforinas – destroem a membranas célulares Indução da morte celular programada – apoptose. Ativação TCR – reconheça um complexo – célula apresentadora de antígenos MHC-I – vírus – LB MHCII – bactérias – LT CD4+ Anergia – receptor da célula T interage com seu antígeno e não ocorre sinal coestimulatório – segue-se um estado não responsivo. MHC- Complexo Principal de Histocompatibilidade Classe I- constitutivamente expresso em todas as células nucleadasClasse II- em células dendríticas, linfócitos B, macrófagos A expressão das moléculas de MHC é aumentada ou diminuída por citocinas, tanto na resposta inata quanto na adaptativa. • As células T CD4+ e CD8+ podem reconhecer antígenos apenas quando está presente uma molécula de MHC. • Células T (CD4+) são restritas ao MHC de classe II • Células T (CD8+) são restritas ao MHC de classe I Moléculas do MHC: Moléculas do MHC são proteínas, cujos domínios extracelulares formam uma fenda, onde o fragmento peptídico se liga. As moléculas do MHC apresentam fragmentos peptídicos do antígeno na superfície das células. Citocinas Propriedades das citocinas: Proteínas produzidas por células do sistema imune em resposta a microrganismos e antígenos, mediando a inflamação e a imunidade; Iniciam e regulam a resposta imune; São produzidas por células da resposta imune inata e adaptativa; Também estimulam o desenvolvimento de células hematopoiéticas. Tem uma secreção rápida e limitada não são armazenadas são produzidas quando necessário Ligam-se em receptores de alta afinidade nas células alvo. - Uma mesma citocina pode exercer atividades biológicas variadas sobre tipos celulares (pleiotropia). - Diferentes citocinas podem ter atividades biológicas semelhantes (redundância). Podem influenciar a síntese de outras citocinas: efeito cascata aumentando ou suprimindo a produção de outras citocinas regulando (positiva ou negativa) a resposta imune Influencia a ação de outras citocinas. Sistema em cascata As citocinas frequentemente influenciam a síntese de ações de outra citocinas. A capacidade de uma citocina em estimular a produção de outras leva ao desencadeamento de uma cascata. Anticorpo Função: Neutralização de toxinas e vírus Opsonização de microrganismos Ativação do sistema complemento Prevenção de ligação de microrganismos com a mucosa. Os anticorpos são classificados de acordo com o tipo de cadeia pesada que apresentam (isotipos): γ – IgG (subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) δ – IgD ε – IgE α – IgA (subclasses IgA1 e IgA2) μ – IgM IMUNOGLOBULINAS IgM: 1º classe de anticorpo secretado na resposta primária. Forma secretada = pentâmero com 10 sítios de ligação de antígenos. 10% das imunoglobulinas do plasma. Eficiente na ativação a Cascata do Complemento e lise celular. Responsável pela resposta primária IgG: Ig predominante no plasma = monômero 75% das Ig séricas. 4 sub-classes: IgG1 a 4. IgA: classe de imunoglobulinas principal nas secreções – 15% do total de Ig no plasma; IgE: < 1% do total de Ig do plasma; A porção Fc da molécula se liga a basófilos e mastócitos. Porção Fab se liga a um alérgeno - ligação cruzada com outra molécula - liberação histamina (reação alérgica). IgD: papel na diferenciação do lifócito B. Antígeno Imunógeno: substância que pode induzir uma resposta imune. Antígeno: qualquer substância que pode se ligar a anticorpos. Maioria os antígenos são imunógenos. Hapteno: não induz a produção de anticorpos, mas podem se ligar a eles, uma vez que a resposta tenha se produzido. São incapazes de ativar as células T Incapaz de se ligar ao MHC. Hapteno se liga a uma proteína carreadora – sendo possível ser apresentada ao LT – ativam produção de anticorpos contra o hapteno. Métodos Imunológicos Testes sorológicos cada vez mais refinados; Elevando sensibilidade e especificidade; Resultados cada vez mais fidedignos; Mais fácil execução; Objetivo: pesquisar Ac e Ag; Várias metodologias disponíveis. Imunoprecipitação: Precipitação: Permite a identificaçaõ e quantificação de precipitados formados pela reação Ag-Ac. Fatores físico-químicos e imunológicos interferem na quantidade de precipitado formado. (concentrações de Ag e Ac). É uma reação reversível que pode ser dissolver quando há excesso de um dos componentes. A visualização de preciptados em meio líquido é difícil Amostras e soluções apresentam turvação e coloração próprias e variáveis Resolvido os incovenientes pela automação Vantagens e Desvantagens: Totalmente automatizado Fácil realização, rápida e precisa Emprega pequenos volumes de amostra Sensibilidade adequada Presença de amostras lipêmicas e hemólise. Imunoensaios de Aglutinação: Aglutinação: Similar ao princípio das técnicas de precipitação Agrupamento de partículas, usualmente moléculas de Ac que se ligam ao Ag na superfície de partículas adjacentes. Adsorção de Ac e Ag a partículas de látex, hemácias... As reações de aglutinação decorre da ligação entre o Ac e Ag, um solúvel e outro, particulado. Formação de agregados visíveis; Interação de Ag e Ac; Pode ser realizado em lâmina, placa ou tubo. Resultados qualitativos ou semi-quantitativos. Aglutinação Direta: O antígeno faz parte naturalmente da célula, e haverá aglutinação dessas células promovidas por anticorpos contra esses antígenos. Geralmente feito em tubo, incubando amostras de soro em diluições seriadas diante da concentração constante de suspensão de células (antígeno). Floculação: Variante da aglutinação indireta, ocorre quando a interação direta de anticorpos específicos com o antígeno leva à formação de imunocomplexos em meio líquido detectáveis com o auxílio de lupa ou microscopia óptica. VDRL (Veneral Disease Research Laboratories) : cristais de colesterol sensibilizado com lecitina e cardiolipina; Detecção de Anticorpos anti-fosfolipídeos; Prática: triagem para Sífilis; Inespecificidade para sífilis; Técnica manual, rápida e baixo custo; Vantagens da Técnica: Metodologia manual; Elevada sensibilidade Baixo custo; Leitura visual Rapidez; Facilidade de excecução Limitações: reprodutibilidade em lotes de reagentes e estabilidade da ligação Ac-Ag. Imunofluorescência: A interação Ac-Ag nem sempre é evidenciada por um fenômeno visível –precipitação e aglutinação Emprego de moléculas marcadas com compostos químicos definidos e detectáveis e que podem ser mensurados. Conjugados: Moléculas ligadas covalentemente aos compostos ligantes Mantêm a propriedades funcionais – ex: antígeno marcado com uma enzima peroxidade – continuará exibindo a mesma antigenicidade. Elevada sensibilidade e especificidade; Uma das metodologias mais utilizadas na pesquisa de Anticorpos; Para pesquisa de Ag em espécimes clínicas; cada vez mais usando Ac monoclonais; Método: capacidade de ligação de Ac ou Ag aos fluorocromos; substância capaz de absorver a luz de comprimento menor e que quando excitados pela radiação UV emitem luz de comprimento maior (fenômeno da fluorescência); Fluoresceína, fluorocromos e rodamina B; Imunoflorescência: direta e indireta para pesquisa de Ac ou Ag; Pesquisa de Ag: Ag em células ou tecidos - reação com Ac específico marcado; Para Anticorpos: Indireta: Ag padronizados fixados em lâminas – Soro (reação) - anti-imunoglobulina marcada; Ex: Anti-HIV, FTA ABs, CMV,T.cruzy, Técnica muito sensível e específica; Tida como padrão ouro para diagnóstico de muitas doenças; Limitação: custo; Resumo: aplicação técnica IFA direta: Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais. IFA indireta: Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como: Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças autoimunes (Lúpus) É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade e especificidade. Enzimaimunoensaio: ELISA Alta sensibilidade; Detecção de Ag ou Ac; Vários métodos: captura, sanduíche, indireto etc; Uso de um conjugado enzimático: desdobramento de substrato com produção de cor: medição espectrofotométrica; O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro. Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura. Técnica pode ser semi-automatizada ou automatizada; Baixo custo e alta sensibilidadee especificidade: grande difusão; Ex: TORCH, HIV, HTLV, HCV, Neisserias (detecção de Ag), T. pallidum, T.cruzy, Leishmania chagasi, Plasmodium etc... Quimioluminescência Semelhante ao ELISA Tipo de reação química, que ao se processar gera energia luminosa. Revelação ocorre pela produção de fluorescência ultra-rápida. O composto químico Luminol, é um dos representantes mais conhecidos da quimioluminescência. Utilizam-se de anticorpos ligados a um marcador luminescente (cromógeno) que pode ser o próprio luminol ou mais modernamente derivados de acridina, sistema avidina-biotina, entre outros. O Luminol quando em contato com o sangue, por exemplo, utiliza o ferro da hemoglobina como catalisador para a reação de liberação de luz. Teste completamente automatizado Rápido Resultados melhores que o ELISA Custo limita sua utilização Radioimunoensaio Ensaio competitivo, direto Anticorpo anti-analito em quantidades fixas; Incubado a amostra a se conhecer concentração do analito, juntamente com o analito marcado com isótopo radioativo; Medição da radiotavidade do precipitado; Se elevada: pouco analito na amostra; Se baixo, e quanto mais baixo for maior é a concentração do analito na amostra; Marcações: I125: raios gama H3: raios beta Boa Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Aplicações: Hormônios, proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa Preferencialmente tem-se optado por técnicas não radioativas Teste automatizado; Alta sensibilidade e especificidade; Custo e riscos: limitação do uso; Western Blotting Muito utilizado ultimamente para identificar proteínas específicas; O protocolo básico de WB pode ser resumido nos seguintes passos: preparação das amostras e fracionamento de proteínas, execução da eletroforese em gel, transferência das proteínas separadas do gel para uma membrana adsorvente, bloqueio de ligações inespecíficas, adição de anticorpo específico e detecção da reação. Formas de avaliação dos métodos Controles de qualidade: Interno e Externo; Sensibilidade Diagnóstica: Capacidade do teste fornecer um resultado + quando o indivíduo realmente tem o parâmetro. Especificidade Diagnóstica: Capacidade do teste fornecer um resultado - quando o indivíduo realmente não tem o parâmetro. Associação com métodos Padrão-ouro; Sífilis É definida como uma infecção sistêmica crônica Transmitida sexualmente na maior parte dos casos Congênita e por transfusão Tem como característica em sua evolução episódios sintomáticos interrompidos por períodos de latência. Agente etiológico: Treponema pallidum Doença de evolução lenta. A infecção pelo Treponema pallidum não confere imunidade permanente, Por isso, É necessário diferenciar entre a persistência de exames reagentes (cicatriz sorológica) e a reinfecção pelo T. pallidum. Formas Clínicas: Sífilis 1º Período de incubação entre 10 e 90 dias – media de 21 dias. Lesão persiste por 4 - 6 semanas e resolve-se espontaneamente. O primeiro sintoma é o aparecimento de uma lesão única no local de entrada da bactéria. A lesão denominada cancro duro é indolor, tem a base endurecida, contém secreção serosa e muitos treponemas. A lesão primária se cura espontaneamente, num período aproximado de duas semanas. Diagnóstico Laboratório: Exames: Pela pesquisa direta do Treponema pallidum por microscopia de campo escuro. Anticorpos começam a surgir na corrente sanguínea cerca de 7 a 10 dias após o surgimento do cancro duro. Nessa fase os testes sorológicos são não-reagentes. O primeiro teste a se tornar reagente em torno de 10 dias da evolução do cancro duro é o FTA-Abs, Seguido dos outros testes treponêmicos e não treponêmicos. Quanto mais precocemente a sífilis primária for tratada maior será a possibilidade dos exames sorológicos tornarem não-reagentes. Porém, mesmo após a cura, os testes treponêmicos podem permanecer reagentes por toda a vida. Formas Clínicas: Sífilis 2º Quando a sífilis não é tratada na fase primária, evolui para sífilis secundária – 4 a 8 semanas após desaparecimento da lesão primária. Período em que o treponema já invadiu todos os órgãos e líquidos do corpo Lesões cutâneas-mucosas não ulceradas simétricas, localizadas ou difusas Invasão do SNC ocorre durante as primeiras semanas e meses de infecção Detectada em 40% dos pacientes com sífilis 2º As lesões cutâneas podem apresentar diversos padrões As lesões desaparecem em 2-6 semanas e a infecção entra em uma fase latente, só sendo detectada por métodos sorológicos – raramente deixam cicatrizes Nesta fase, aparece como manifestação clínica o exantema (erupção) cutâneo. - Na sífilis secundária, todos os testes sorológicos são reagentes e os testes quantitativos tendem a apresentar títulos altos. Após o tratamento nessa fase, os testes treponêmicos permanecem reagentes por toda a vida do usuário, enquanto os testes não treponêmicos podem ter comportamento variável. Em alguns indivíduos ficam não reagentes e em outros permanecem indefinidamente reagentes em baixos títulos. Sífilis latente Se não houver tratamento, após o desaparecimento dos sinais e sintomas da sífilis secundária, A infecção entra no período latente, considerado recente no primeiro ano e tardio após esse período. A sífilis latente não apresenta qualquer manifestação clínica. Diagnóstico laboratorial Nessa fase todos os testes sorológicos permanecem reagentes e observa-se uma diminuição dos títulos nos testes quantitativos. Para diferenciar esta fase da infecção primária deve-se pesquisar no líquor a presença de anticorpos, utilizando-se o VDRL. Evidencia-se sífilis latente quando o VDRL é reagente no líquor, acompanhado de baixos títulos no soro. Sífilis 3º A sífilis terciária pode levar de três a vinte ou mais anos para se manifestar. A sífilis terciária se manifesta na forma de inflamação e destruição de tecidos e ossos. É caracterizada por formação de gomas sifilíticas, tumorações amolecidas vistas na pele e nas membranas mucosas, que também podem acometer qualquer parte do corpo, inclusive no esqueleto ósseo. As manifestações mais graves incluem a sífilis cardiovascular e a neurossífilis. Diagnóstico Laboratorial da Sífilis: Depende da associação entre: História do usuário; Dados clínicos; Detecção de antígenos ou anticorpos por meio de testes laboratoriais. Por isso é importante conhecer: A Evolução da doença; Diferentes fases da evolução; E a indicação de cada teste laboratorial. Para o diagnóstico laboratorial da sífilis pode-se utilizar os testes treponêmicos e os não treponêmicos. Sorologia não treponêmica: São testes que detectam anticorpos não treponêmicos, esses anticorpos não são específicos para Treponema pallidum e podem ser qualitativos e quantitativos. VDRL. - Reativo a partir da segunda semana após o cancro. Ocorre redução após o primeiro ano.Negativação após 9 e 12 meses após o tratamento. Caso encontre títulos baixos < 1:16 : Sífilis muito recente; Muito antiga; Tratada - Falso positivo: Gravidez; Lúpus eritematoso sistêmico; Hanseníase e mononucleose. Sorologia Treponêmica: São testes que empregam como antígeno Treponema pallidum, e detectam anticorpos anti-treponêmicos. Esses testes são feitos apenas qualitativamente. São indicados para confirmação do diagnóstico, quando a triagem é feita com um teste não treponêmico. FTA-Abs IFI TPHA São exames qualitativos e muitos específicos para o treponema, podem nunca negativar, mesmo após tratamento eficaz. Seguimento: Para o seguimento do paciente, os testes não treponêmicos devem ser realizados mensalmente nas gestantes; Na população geral, a cada três meses no primeiro ano de acompanhamento do paciente e a cada seis meses no segundo ano. E indicação de sucesso de tratamento a ocorrência de diminuição dos títulos em torno de duas diluições em três meses, e três diluições em seis meses após a conclusão do tratamento. Por exemplo, quando o titulo da amostra era de 1:64 e cai para 1:16 no exame de controle pós-tratamento.
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