Biotecnologia_PCR

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BIOTEC 
 
Professora: Raquel Bagattini 
Curso: Ciências Biológicas - Bacharelado 
Período: 7º Semestre 
 
 
ü Aula Teórica: Engenharia genética. 
3- Métodos de análise dos ácidos nucleicos: 
- Sequenciamento de DNA, 
- Reação de polimerização em cadeia (PCR) e PCR em tempo real 
 - Microarray 
 - Interferência de RNA (RNAi) 
 
3- Métodos de análise dos ácidos nucleicos 
• PCR – Reação em cadeia da Polimerase 
A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas cópias de uma região específica do 
DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao invés de um organismo). A PCR depende de uma DNA polimerase 
termoestável, a Taq polimerase, e requer primers de DNA projetados especificamente para a região de interesse 
do DNA. Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações de temperatura, o que 
possibilita a produção de muitas cópias da região de interesse. 
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA polimerase que faça novas 
fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é chamada 
de Taq polimerase. Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe 
é dado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA. 
Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada, ou amplificada, pelos 
primers que ela ou ele escolher. Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por 
volta de 202020 aminoácidos de comprimento. Dois primers são usados para cada reação de PCR, e eles são 
projetados de modo que englobem a região de interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são dadas 
sequências que os farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada. Os 
primers se ligam ao molde por pareamento de bases complementares. 
 
Quando os primers são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela polimerase, e a região que está entre 
eles será copiada. 
 
 
As etapas da PCR 
Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, DNA molde e nucleotídeos. Os 
ingredientes são reunidos em um tubo, juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e passam por 
repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado. As etapas básicas são: 
1. Desnaturação (96°C): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso 
proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa. 
2. Anelamento (55 - 65°C): Resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências 
complementares no DNA molde de fita simples. 
3. Extensão (72°C): Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando 
novas fitas de DNA. 
 
Este ciclo se repete 25- 35 vezes em uma 
reação típica de PCR. Se a reação for eficiente 
a região de interesse pode gerar de uma ou 
poucas cópias até bilhões. 
Isso porque não é apenas o DNA original que 
é utilizado como molde a cada vez. Ao invés, o 
novo DNA feito em uma rodada pode servir de 
molde na próxima rodada de síntese de DNA. 
Há muitas cópias dos primers e muitas 
moléculas de Taq polimerase flutuando pela 
reação, então o número de moléculas de DNA 
pode aproximadamente dobrar a cada rodada 
do ciclo. Esse padrão de crescimento 
exponencial é mostrado na imagem abaixo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados da PCR 
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis) através do uso da eletroforese 
em gel. Eletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma corrente elétrica 
através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho.