Biologia Molecular - Unidade 1

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<p>Biologia molecular</p><p>Isolamento e Clonagem</p><p>Profª Dra. Maria Carolina Stipp</p><p>docente</p><p>Práticas Obrigatórias</p><p>Apesar de hoje conhecermos muito bem essas moléculas, o DNA em si só foi descrito como estrutura de dupla hélice complementar em 1950 por James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins e Rosalind Franklin. Através dessa descoberta, passamos a compreender como a informação genética era replicada e transmita das células mães, às células filhas.</p><p>2</p><p>DNA E RNA</p><p>Dentro da grande área de biologia molecular são estudadas as moléculas DNA, RNA e proteínas. Essas moléculas fazem parte do dogma da biologia molecular, onde o DNA é replicado a um novo DNA; um DNA é transcrito a RNA, e um RNA é traduzido à proteína.</p><p>Apesar de hoje conhecermos muito bem essas moléculas, o DNA em si só foi descrito como estrutura de dupla hélice complementar em 1950 por James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins e Rosalind Franklin. Através dessa descoberta, passamos a compreender como a informação genética era replicada e transmita das células mães, às células filhas.</p><p>Apesar de hoje conhecermos muito bem essas moléculas, o DNA em si só foi descrito como estrutura de dupla hélice complementar em 1950 por James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins e Rosalind Franklin. Através dessa descoberta, passamos a compreender como a informação genética era replicada e transmita das células mães, às células filhas.</p><p>3</p><p>DNA e rna</p><p>https://uniasselvi.me/3zP7kVX</p><p>FONTE:</p><p>Dentro da grande área de biologia molecular são estudadas as moléculas DNA, RNA e proteínas. Essas moléculas fazem parte do dogma da biologia molecular, onde o DNA é replicado a um novo DNA; um DNA é transcrito a RNA, e um RNA é traduzido à proteína.</p><p>4</p><p>DNA e rna</p><p>James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins e Rosalind Franklin.</p><p>Apesar de hoje conhecermos muito bem essas moléculas, o DNA em si só foi descrito como estrutura de dupla hélice complementar em 1950 por James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins e Rosalind Franklin. Através dessa descoberta, passamos a compreender como a informação genética era replicada e transmita das células mães, às células filhas.</p><p>5</p><p>DNA</p><p>O DNA é composto uma pentose (desoxirribose), um nucleotídeo (Adenina, Timina, Citosina e Guanina) e um fosfato, sendo uma estrutura em dupla hélice.</p><p>O RNA é composto por uma pentose (ribose), um nucleotídeo (Adenina, Uracila, Citocina e Guanina) e um fosfato, sendo uma estrutura fita simples.</p><p>A sequência desses nucleotídeos no DNA irá descrever a sequência de nucleotídeos no RNAm, que por sua vez, indica a sequência de aminoácidos que compõem uma proteína.</p><p>Apesar de hoje conhecermos muito bem essas moléculas, o DNA em si só foi descrito como estrutura de dupla hélice complementar em 1950 por James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins e Rosalind Franklin. Através dessa descoberta, passamos a compreender como a informação genética era replicada e transmita das células mães, às células filhas.</p><p>6</p><p>https://uniasselvi.me/3q4CPYL</p><p>DNA e rna</p><p>FONTE:</p><p>O DNA é composto uma pentose (desoxirribose), um nucleotídeo (Adenina, Timina, Citosina e Guanina) e um fosfato, sendo uma estrutura em dupla hélice. O RNA é composto por uma pentose (ribose), um nucleotídeo (Adenina, Uracila, Citocina e Guanina) e um fosfato, sendo uma estrutura fita simples. A sequência desses nucleotídeos no DNA irá descrever a sequência de nucleotídeos no RNAm, que por sua vez, indica a sequência de aminoácidos que compõem uma proteína.</p><p>7</p><p>https://uniasselvi.me/31Bvsyx</p><p>Com essas descobertas, tornou-se possível identificar uma série de técnicas que permitem estudar a fundo as particularidades do DNA e seus produtos.</p><p>FONTE:</p><p>Com essas descobertas, tornou-se possível identificar uma série de técnicas que permitem estudar a fundo as particularidades do DNA e seus produtos.</p><p>8</p><p>Isolamento do dna</p><p>https://uniasselvi.me/332QXJ4</p><p>Inicialmente, para que possamos estudar o DNA, é necessário isolá-lo através das técnicas de extração do DNA. Ela pode ser feita por meio de amostras de células ou tecidos.</p><p>FONTE:</p><p>Inicialmente, para que possamos estudar o DNA, é necessário isolá-lo através das técnicas de extração do DNA. Ela pode ser feita por meio de amostras de células ou tecidos.</p><p>9</p><p>Eletroforese em gel</p><p>https://uniasselvi.me/3t1vdbk; https://uniasselvi.me/3q42UXE</p><p>A eletroforese permite a separação das moléculas de DNA, RNA ou ainda de proteínas. A separação por meio de uma corrente elétrica que é aplicada no gel de agarose ou poliacrilamida, que está imerso em um tampão. As moléculas então irão migrar de acordo com a sua afinidade, onde moléculas positivas migram para o polo negativo, e as negativas para o polo positivo do gel, de acordo com o tamanho da molécula. O DNA, por exemplo, é carregado negativamente, então tem afinidade pelo polo positivo do gel. Cada molécula irá ser carregada, formando bandas no gel, que podem ser coradas. O DNA e RNA são corados por brometo de etídio, visualizado em UV.</p><p>FONTE:</p><p>10</p><p>Endonucleases de restriÇão</p><p>https://bit.ly/3ndRv62</p><p>São enzimas isoladas e purificadas de bactérias, que são conhecidas como tesouras moleculares. Elas são capazes de gerar pequenos fragmentos no DNA, em locais específicos, sempre clivando nas mesmas regiões, em uma sequência específica de 4 a 8 nucleotídeos. Um exemplo é a EcoRI, obtida da Escherichia coli. Elas podem ser utilizadas para fragmentar o DNA, e selecionar o fragmento de interesse. Após o corte com as enzimas de restrição, a amostra pode ser submetida a eletroforese, e então isolada para futuros estudos.</p><p>FONTE:</p><p>11</p><p>Hbrididização</p><p>A hibridização permite que um fragmento específico, produzido em laboratório, reconheça um fragmento de DNA/RNA a ser estudado. Os fragmentos são denominados de sondas de ácidos nucleicos, que são marcadas. Quando ocorre a ligação entre a sonda e o fragmento de DNA pesquisado, ela irá emitir coloração ou fluorescência. As principais aplicações da técnica de hibridização são chamadas de hibridização in situ,</p><p>Northern e Southern-blotting.</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=_sNZdf5i444</p><p>Apesar de hoje conhecermos muito bem essas moléculas, o DNA em si só foi descrito como estrutura de dupla hélice complementar em 1950 por James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins e Rosalind Franklin. Através dessa descoberta, passamos a compreender como a informação genética era replicada e transmita das células mães, às células filhas.</p><p>12</p><p>https://bit.ly/3HPuSMV</p><p>hibridização</p><p>FONTE:</p><p>A hibridização permite que um fragmento específico, produzido em laboratório, reconheça um fragmento de DNA/RNA a ser estudado. Os fragmentos são denominados de sondas de ácidos nucleicos, que são marcadas. Quando ocorre a ligação entre a sonda e o fragmento de DNA pesquisado, ela irá emitir coloração ou fluorescência. As principais</p><p>aplicações da técnica de hibridização são chamadas de hibridização in situ,</p><p>Northern e Southern-blotting.</p><p>13</p><p>https://shutr.bz/3K08QJw</p><p>clonagem</p><p>A clonagem se refere à síntese de DNA dentro de uma célula. Para que ela ocorra são células hospedeiras e DNA recombinante.</p><p>O DNA do vetor plasmidial e o DNA de interesse são clivados pela mesma enzima de restrição e em seguida ligados pela DNA ligase.</p><p>O DNA recombinante é inserido na célula hospedeira (como a bactéria E. coli);</p><p>O DNA é replicado em meio de cultura e milhões de clones são gerados.</p><p>FONTE:</p><p>A clonagem se refere à síntese de DNA dentro de uma célula. Para que ela ocorra são células hospedeiras e DNA recombinante.</p><p>O DNA do vetor plasmidial e o DNA de interesse são clivados pela mesma enzima de restrição e em seguida ligados pela DNA ligase.</p><p>O DNA recombinante é inserido na célula hospedeira (como a bactéria E. coli);</p><p>O DNA é replicado em meia de cultura e milhões de clones são gerados.</p><p>14</p><p>Bons estudos!</p><p>https://shutr.bz/3f8B9XQ</p><p>FONTE:</p><p>15</p><p>Obrigada!</p><p>“</p><p>1 Quais são os princípios físicos que permitem que a eletroforese em gel seja aplicada no isolamento de fragmentos de DNA?</p><p>a) ( ) Cargas negativas dos fragmentos de DNA, corrente elétrica e polaridade</p><p>do gel.</p><p>b) ( ) Cargas positivas dos fragmentos de DNA, corrente elétrica e porosidade da matriz do gel.</p><p>c) ( ) Cargas negativas dos fragmentos de DNA, corrente elétrica e porosidade da matriz do gel.</p><p>d) ( ) Cargas negativas do gel, elevação de temperatura e corrente elétrica.</p><p>2- A hibridização in situ foi elaborada com o objetivo de isolar e identificar fragmentos, através do anelamento entre duas fitas simples de origens distintas, sejam elas DNA ou RNA. Sobre essa técnica, associe os itens, utilizando o código a seguir:</p><p>I- Northen-blotting.</p><p>II- Southern-blotting.</p><p>III- Hibridização in situ.</p><p>( ) Técnica que utiliza sondas de ácidos nucleicos, com marcação química, no local em que a molécula de interesse deve ser encontrada (RNA dentro da célula, DNA específico em cromossomos).</p><p>( ) Técnica que avalia padrões de sequências de nucleotídeos de genes do DNA e utiliza sondas de DNA molde, os quais são marcados com radiação ou quimicamente.</p><p>) Nesta técnica, o RNA mensageiro (mRNA) é utilizado a fim de buscar comparar situações distintas, como, por exemplo, utilizar amostras controle como padrão para expressão do gene de interesse e, assim, comparar com a amostra de interesse.</p><p>Assinale a alternativa que apresenta a sequência CORRETA:</p><p>A) I - II - III.</p><p>B) II - I - III.</p><p>C) I - III - II.</p><p>D) III - II - I.</p><p>3- A clonagem de DNA se refere à produção, dentro de uma célula, de diversas cópias de uma sequência específica de um fragmento de DNA. Sobre o exposto, avalie as asserções a seguir e a relação proposta entre elas:</p><p>I- A clonagem de DNA depende da utilização de um vetor, do fragmento de DNA e, posteriormente, de um organismo hospedeiro.</p><p>PORQUE</p><p>II- O fragmento de DNA de interesse, será inserido em uma molécula de DNA genômico com capacidade de autorreplicação (DNA do vetor), originando o DNA recombinante. Essa inserção se dá através de enzimas de restrição e enzimas de ligação.</p><p>Assinale a alternativa CORRETA:</p><p>a) As asserções I e II são proposições verdadeiras, e a II é uma justificativa da I.</p><p>b) A asserção I é uma proposição falsa, e a II é uma proposição verdadeira.</p><p>c) As asserções I e II são proposições falsas.</p><p>d) As asserções I e II são proposições verdadeiras, mas a II não é uma justificativa da I</p><p>4- O RNA é uma molécula muito semelhante ao DNA, originado a partir do processo de transcrição, em que carrega informações contidas no DNA para fora do núcleo. Essas informações, darão origem à síntese de proteínas, através do processo de tradução. Sobre o RNA, assinale a alternativa CORRETA:</p><p>A) O RNA é uma estrutura em dupla hélice, composta pela desoxirribose, nucleotídeos e fosfato.</p><p>B) O RNA é composto por cinco nucleotídeos, adenina, uracila, timina, guanina e citosina.</p><p>C) O RNA é uma estrutura em fita simples, composta pela pentose denominada como ribose; os nucleotídeos adenina, uracila, citosina e guanina e fosfato.</p><p>D) O RNA é uma estrutura em fita simples, composta pelos nucleotídeos adenina, timina, citosina e guanina</p><p>5- As endonucleases de restrição são produzidas naturalmente por diversas bactérias. De acordo com essas enzimas, classifique V para as sentenças verdadeiras e F para as falsas:</p><p>( ) As enzimas de restrição são utilizadas para fragmentar o DNA em regiões específicas,</p><p>permitindo a manipulação do DNA.</p><p>( ) Cada bactéria produz uma enzima de restrição específica, que pode ser isolada e purificada a partir de colônias dessas bactérias.</p><p>( ) As enzimas de restrição não reconhecem sequências específicas, apresentando regiões de clivagem aleatórias de 4 a 8 nucleotídeos.</p><p>Assinale a alternativa que apresenta a sequência CORRETA:</p><p>A) V - F - F.</p><p>B) V - V - F.</p><p>C) F - V - F.</p><p>D) F - F - V.</p><p>6-A escolha do gel para a técnica de eletroforese deve-se dar através do tamanho da molécula a ser isolada e do objetivo do isolamento. Com base nas matrizes de agarose e poliacrilamida para a técnica de eletroforese em gel, analise as sentenças a seguir:</p><p>I- A poliacrilamida pode separar fragmentos de DNA com até mesmo uma única base nitrogenada de diferença.</p><p>II- A agarose, apresenta menor resolução, ou seja, cada banda presente no gel, representa um agrupamento de moléculas de tamanho semelhantes.</p><p>III- No gel de poliacrilamida, uma menor faixa de tamanho das moléculas pode se movimentar, enquanto fragmentos maiores de DNA podem migrar facilmente no gel de agarose.</p><p>Assinale a alternativa CORRETA:</p><p>A) As sentenças I, II e III estão corretas.</p><p>B) Somente a sentença III está correta.</p><p>C) Somente a sentença I está correta.</p><p>D) Somente a sentença II está correta</p><p>Biologia molecular</p><p>Reação em Cadeia da Polimerase</p><p>Profª Dra. Maria Carolina Stipp</p><p>docente</p><p>pcr</p><p>https://shutr.bz/3I6kjWb</p><p>A PCR, ou reação em cadeia da polimerase, é uma das grandes inovações no campo de biologia molecular. Essa técnica permite que o DNA seja replicado (amplificado) de forma rápida e eficaz dentro de um tubo de ensaio. Ela usa o princípio da replicação do DNA. Você lembra como ela ocorre?</p><p>FONTE:</p><p>25</p><p>https://shutr.bz/3taK6Ir</p><p>replicação</p><p>A replicação é um processo semi-conservativo, onde uma dupla fita de DNA irá se “abrir ao meio” e duas novas fitas serão sintetizadas. A síntese das novas fitas ocorre com o uso da enzima DNA polimerase, que reconhece o nucleotídeo especifico da fita antiga, e adiciona o nucleotídeo complementar na fita nova. Por exemplo, se a fita molde (antiga) tiver um nucleotídeo Guanina (G), a DNA polimerase irá inserir um nucleotídeo Citosina (C) na fita nova que está sintetizando. Esse processo ocorre ao longo de todo DNA, de modo que ao final do processo, são geradas duas novas moléculas de DNA idênticas contendo uma fita molde (antiga) e uma fita complementar (nova).</p><p>FONTE:</p><p>26</p><p>Dna e rna</p><p>É importante lembrarmos que a replicação in vivo ocorre com o auxilio de diferentes enzimas, como a RNA polimerase (primase), helicase, DNA girase, DNA polimerase e DNA ligase. Cada uma possui funções especificas e são essenciais para que a replicação ocorra de modo preciso.</p><p>DNA girase – enzima responsável por girar o DNA, que se encontra “enrolado em forma de fio de telefone”, para que ele fique reto durante a replicação.</p><p>Helicase – enzima que realiza o corte das pontes de hidrogênio entre as duas fitas do DNA, permitindo que seja formado um espaço entre elas, e que as demais enzimas consigam realizar a replicação em si.</p><p>RNA polimerase (primase) – enzima com função de adicionar os primers (iniciadores) nas pontas do DNA. Esses primers vão permitir que a enzima DNA polimerase adicione os demais nucleotídeos, uma vez que ela precisa de uma hidroxila livre para conseguir iniciar o processo.</p><p>DNA polimerase- enzima que adiciona os nucleotídeos de forma complementar, formando a nova fita do DNA.</p><p>DNA ligase- enzima que realiza a ligação entre os nucleotídeos da nova fita de DNA, e confere possíveis erros no DNA.</p><p>A DNA girase, helicase e RNA polimerase trabalham no estágio inicio da replicação, conhecido como iniciação. Já a DNA polimerase irá realizar o estágio de alongamento; enquanto a DNA ligase, participa do estágio de finalização da replicação.</p><p>FONTE:</p><p>27</p><p>https://shutr.bz/3I6kjWb</p><p>Dna e rna</p><p>FONTE:</p><p>28</p><p>https://shutr.bz/3q9xQWy</p><p>pcr</p><p>Agora que lembramos como a replicação acontece, podemos entender melhor como é possível replicar o material genético in vivo. Iniciamos escolhemos um par de primers específicos, que possuem uma sequencia de 18 a 22 nucleotídeos. Esses primers devem ser complementares a cadeia que se deseja amplificar. Ele é sempre desenhado no sentido 5’-3’.</p><p>Em seguida, são adicionados desoxinucleotídeos (dNTPS: A, T, G e C), a enzima Taq DNA polimerase, cofatores enzimáticos (Mg) e o DNA extraído.</p><p>A enzima Taq DNA polimerase é utilizada no processo, pois é a única capaz de aguentar as altas temperaturas exigidas para a desnaturação do DNA.</p><p>O conteúdo é inserido em um equipamento, que por sua vez, realizada três estágios:</p><p>Desnaturação: abertura da fita a 95ºC;</p><p>Anelamento: ligação dos primers no local específico do DNA, que ocorre a 60-65ºC;</p><p>Extensão – Os dNTPs são adicionados</p><p>de forma complementar para enzima Taq DNA polimerase, que ocorre a 72ºC.</p><p>Esses estágios se repetem entre 20 a 40 ciclos, afim de obter um grande número de cópias de DNA.</p><p>FONTE:</p><p>29</p><p>https://shutr.bz/3tbNqD2</p><p>Transcrição reverSa</p><p>A RT-PCR, ou transcrição reversa é uma técnica que utiliza a enzima transcriptase reversa para converter uma molécula de mRNA (RNA mensageiro) em cDNA (DNA complementar). Ela é utilizada para avaliar o nível de expressão gênica de um tecido. Para essa avaliação precisamos usar mRNA, que indica quanto de um gene está sendo transcrito em uma célula. Mas o PCR não ocorre em uma molécula com fita simples, sendo necessária converte-la em fita dupla (cDNA).</p><p>Nessa técnica utilizamos Oligonucleotideos sintéticos (primers), enzima transcriptase reversa, dNTPs, amostra de RNA e cofatores enzimáticos.</p><p>Os primers irão permitir que a sequencia de mRNA específica do gene de interesse seja amplificada e transformada em cDNA.</p><p>Todo processo é automatizado, e em seguida, o material obtido pode ser amplificado por PCR e quantificado.</p><p>FONTE:</p><p>30</p><p>https://shutr.bz/3tbNqD2</p><p>Transcrição reverSa</p><p>FONTE:</p><p>31</p><p>https://uniasselvi.me/3q42UXE; https://shutr.bz/3r7LLvP</p><p>Pcr qualitativo</p><p>Pcr quantitativo</p><p>PCR qualitativo avalia se houve amplificação do material, observado ao final da técnica por meio de um gel de eletroforese.</p><p>PCR quantitativo: detecta a amplificação em tempo real através de fluorescência e indica de forma numérica a quantidade de material que está sendo amplificado na reação.</p><p>FONTE:</p><p>32</p><p>https://bit.ly/3ndRv62</p><p>Pcr em tempo real</p><p>Essa técnica utiliza os mesmos princípios do PCR convencional, no entanto, o equipamento utilizado precisa ser capaz de detectar a fluorescência emitida durante cada amplificação. Essa fluorescência é emita com o uso de sondas específicas que se intercalam às fitas de DNA que estão sendo amplificadas. Assim, ao detectar essa fluorescência, é possível detectar quanto do material genético está sendo amplificado ao longo dos ciclos.</p><p>FONTE:</p><p>33</p><p>Biologia molecular</p><p>Bibliotecas de DNA e cDNA</p><p>Profº Dra. Maria Carolina Stipp</p><p>docente</p><p>Bibliotecas de dna</p><p>https://shutr.bz/3qb8qYP</p><p>Biblioteca de DNA: formada por fragmentos de DNA genômico.</p><p>Biblioteca de cDNA: formada por sequências de mRNA, ou seja, por genes que estavam expressos em uma determinada amostra.</p><p>As bibliotecas de DNA e cDNA podem ser descritas como “coleções” de material genético. Esse material é mantido em colônias de bactérias, onde cada uma possui um fragmento específico de DNA ou gene que precisam ser estudados.</p><p>FONTE:</p><p>35</p><p>https://shutr.bz/3K08QJw</p><p>bibliotecas</p><p>Essa coleção de material genético só é possível por meio da técnica de clonagem do material genético.</p><p>Isolamento e extração do DNA genômico;</p><p>Clivagem por enzimas de restrição, originando milhões de fragmentos de DNA;</p><p>Inserção dos fragmentos em vetores específicos, como plasmídeos;</p><p>Os fragmentos serão ligados ao vetor através da enzima DNA ligase.</p><p>Transformação das células hospedeiras, onde as bactérias, por exemplo, são “transformadas” para permitirem a entrada do vetor;</p><p>Multiplicação dos fragmentos, através da multiplicação das células bactérias contendo os vetores.</p><p>FONTE:</p><p>36</p><p>Hibridização de colônia</p><p>https://shutr.bz/3qb8qYP</p><p>As bibliotecas de DNA genômico podem ser mantidas por tempo indefinido e ser clonadas, identificadas e isoladas para diversas aplicações, por exemplo, para o sequenciamento de todo o genoma.</p><p>Já as de cDNA permitem o estudo de regiões codificantes do DNA. Ou seja, aquelas que irão formar uma proteína.</p><p>FONTE:</p><p>37</p><p>Hibridização de colônia</p><p>https://shutr.bz/3qWZS6M</p><p>Mas você pode se perguntar como identificamos quais fragmentos estão em cada colônia, ou ainda se o fragmento de interesse está ali...</p><p>Para identificar esses fragmentos utilizamos técnicas como hibridização em colônia, que são semelhantes as Southern e Northern-blot já mencionadas no tópico 1.</p><p>Essa técnica utiliza uma membrana que irá coletar uma pequena porção das células presentes em cada uma das colônias.</p><p>1- A membrana é colocada em contato com as colônias na placa;</p><p>2 - As células presentes na placa podem se aderir a membrana, formando uma impressão das colônias presentes na placa;</p><p>3- As células aderidas são lisadas para que o DNA seja liberado, mas que ainda fique aderido à membrana na posição relativa à sua colônia de origem na placa;</p><p>4- A membrana é incubada com sondas de hibridização marcadas, complementares à uma porção do gene de interesse que permitem a visualização da posição dos clones que contem o fragmento de interesse.</p><p>FONTE:</p><p>38</p><p>1- O advento das técnicas de biologia molecular possibilitou o estudo genético de diversos organismos, incluindo os seres humanos. Esses estudos têm trazido ganhos significativos no entendimento de doenças, síndromes e mecanismos de ação de substâncias. De acordo com a importância das técnicas de clonagem do DNA e construção de bibliotecas genômicas, classifique V para as sentenças verdadeiras e F para as falsas:</p><p>( ) As enzimas de restrição são utilizadas na construção de bibliotecas de DNA, com o objetivo de fragmentar o DNA genômico, já que podem ser conhecidas como tesouras moleculares.</p><p>( ) Os vetores são essenciais na técnica de clonagem e são utilizados tanto na construção de bibliotecas de DNA, quanto de cDNA, uma vez que carregam os fragmentos de DNA ou o cDNA extraído.</p><p>( ) As bibliotecas de cDNA são construídas a partir da extração do DNA de células ou tecidos, que posteriormente é submetido à clonagem do DNA.</p><p>( ) O mRNA é convertido em cDNA pela transcrição reversa, para então serem introduzidos em vetores e submetidos ao processo de clonagem para originar as bibliotecas de cDNA.</p><p>Assinale a alternativa que apresenta a sequência CORRETA:</p><p>A) V - V - F - V.</p><p>B) V - F - F - V.</p><p>C) F - F - V - F.</p><p>D) V - F - V - V</p><p>2- O PCR produz uma série de cópias de um determinado fragmento de DNA ou cDNA de uma maneira bastante rápida e eficiente. No entanto, de acordo com o seu objetivo de pesquisa, a PCR</p><p>qualitativa ou quantitativa se torna mais eficaz para fornecer os resultados esperados. De acordo com essas duas técnicas, classifique V para as sentenças verdadeiras e F para as falsas:</p><p>( ) A PCR qualitativa indica a presença de um fragmento específico de DNA ou cDNA em uma amostra, mas não indica quanto do gene está expresso na amostra.</p><p>( ) A qPCR é conhecida como PCR em tempo real (quantitativa) e fornece informações precisas relativas à quantidade de expressão de um gene.</p><p>( ) A PCR qualitativa necessita de um termociclador específico capaz de quantificar a amplificação dos fragmentos de DNA ao final de cada ciclo em tempo real.</p><p>Assinale a alternativa que apresenta a sequência CORRETA:</p><p>A) F - F - V.</p><p>B) F - V - F.</p><p>C) V - F - F.</p><p>D) V - V - F.</p><p>3- Os ciclos do PCR (reação em cadeia da polimerase) são críticos para o sucesso da técnica. Em torno de 20-40 ciclos são programados no termociclador, a fim de se obter milhares de cópias de DNA. Sobre os ciclos do PCR associe os itens, utilizando o código a seguir:</p><p>I- Desnaturação.</p><p>II- Anelamento.</p><p>III- Extensão.</p><p>( ) Estágio em que os primers se ligam à fita do DNA na sua sequência complementar.</p><p>( ) Estágio inicial, em que ocorre abertura da dupla fita, liberando os nucleotídeos de cada uma das fitas simples. Esta etapa ocorre em uma alta temperatura, em cerca de 95º C.</p><p>( ) Estágio correspondente à adição de nucleotídeos pela DNA polimerase específica, denominada como Taq DNA polimerase, em uma temperatura de 72º C.</p><p>Assinale a alternativa que apresenta a sequência CORRETA:</p><p>A) I - III - II.</p><p>B) II - I - III.</p><p>C) I - II - III.</p><p>D) III - II - I</p><p>4- As bibliotecas de DNA e cDNA são essenciais para manter e replicar um fragmento clonado por tempo indeterminado. Sobre essas técnicas, associe os itens, utilizando o código a seguir:</p><p>I- Biblioteca de cDNA.</p><p>II- Biblioteca de DNA.</p><p>III- Hibridização em colônia.</p><p>( ) Técnica que detecta os fragmentos do DNA de interesse com sondas específicas em meio de cultivo sólido.</p><p>( ) Clonagem de fragmentos aleatórios do</p><p>DNA, permitindo a sua identificação, isolamento e sequenciamento do genoma.</p><p>( ) Clonagem de mRNAs, em que cada célula/tecido pode originar uma biblioteca diferente, considerando o</p><p>padrão de expressão gênica específico, relacionado sempre a sua função.</p><p>Assinale a alternativa que apresenta a sequência CORRETA:</p><p>A) I - III - II.</p><p>B) II - I - III.</p><p>C) III - II - I.</p><p>D) I - II - III</p><p>Biologia molecular</p><p>SEQUENCIAMENTO</p><p>Profº Dra. Maria Carolina Stipp</p><p>docente</p><p>A definição de sequenciamento de DNA está bastante explicita no próprio nome, ou seja, esse é o processo em que é determinado qual nucleotídeo ocupa cada posição na fita de uma molécula ou de um fragmento de DNA. De maneira mais simples, é o método que determina a sequência dos nucleotídeos presentes em uma fita de DNA.</p><p>Sequenciamento de DNA</p><p>As primeiras técnicas de sequenciamento de DNA começaram a ser aplicadas ainda na década de 70, com o advento da técnica proposta por Sanger, atualmente conhecida como método de Sanger. Com o passar dos anos, esse método foi aprimorado e automatizado, sendo chamado de método de Sanger automatizado. Assim, os métodos de Sanger são atualmente chamados de técnicas de sequenciamento de primeira geração.</p><p>Com base nos princípios desse método pioneiro, na década seguinte foram desenvolvidos outros métodos de sequenciamento, como o método Shotgun, ainda considerados de primeira geração. De maneira geral, eles aumentaram a eficiência e agilidade do processo para que fragmentos maiores de DNA pudessem ser sequenciados, especialmente com os objetivos de otimizar e acelerar o projeto genoma.</p><p>Já nos anos 2000, os métodos de sequenciamento alcançaram um novo nível de avanço, com o surgimento dos chamados métodos de sequenciamento de próxima geração (do inglês Next Generation Sequencing – NGS) ou métodos de segunda geração, os quais já não são mais baseados na técnica proposta por Sanger.</p><p>Atualmente, já existem também os métodos conhecidos como sequenciamento de terceira geração, os quais são inovadores, pois são capazes de realizar o sequenciamento de apenas uma molécula de DNA sem que seja necessário amplificar a molécula a ser analisada.</p><p>MÉTODOS DE SANGER E SANGER AUTOMATIZADO</p><p>Para o sequenciamento com o método de Sanger, também conhecido como método terminador de cadeia, são sintetizadas, in vitro, com a utilização de primer ou iniciadores, diversas fitas de DNA réplicas da mesma fita molde, portanto, com a mesma extremidade 5’. No entanto, cada uma dessas fitas apresenta diferentes terminações 3’, decorrentes do processo de inserção de um nucleotídeo terminador de cadeia, os didesoxinucleotídeos (ddNTP: ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP).</p><p>Um método muito similar ao descrito anteriormente, chamado de Sanger automatizado, aplicável a fragmentos maiores de DNA, utiliza apenas uma reação, contendo os quatro didesoxinucleotídeos para a amplificação do fragmento de DNA de interesse, no entanto, cada um desses nucleotídeos terminadores de cadeia é marcado com um fluoróforo distinto dos demais.</p><p>SEQUENCIAMENTO SHOTGUN</p><p>Outro tipo de sequenciamento de primeira geração é o método de sequenciamento Shotgun, o qual é aplicado como estratégia para o sequenciamento de grandes sequências de nucleotídeos, especialmente genomas inteiros dos mais diversos organismos.</p><p>Na técnica Shotgun, o material clonado é sequenciado diversas vezes, fornecendo uma quantidade de dados de sequenciamento equivalente a aproximadamente 10 vezes o tamanho do material genético que está sendo estudado. Esse volume de reações e leituras de sequências de nucleotídeos deve ser realizado para assegurar que todos os nucleotídeos presentes no material genético sejam detectados e inseridos na sequência final do DNA.</p><p>SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO (NEXT</p><p>GENERATION SEQUENCING - NGS)</p><p>O grande advento alcançado com as tecnologias de sequenciamento de nova geração foi que elas não mais são dependentes da utilização dos nucleotídeos terminadores de cadeia, o que permitiu com que as plataformas criadas na segunda geração de sequenciamento fossem mais eficientes e rápidas, capazes de sequenciar moléculas muito maiores do que era possível com os métodos de Sanger e, ainda, em um curto período de tempo. Alguns desses métodos incluem o pirossequenciamento, o sequenciamento por síntese (SBS, do inglês sequence-by-synthesis), sequenciamento por terminação de cadeia reversível, sequenciamento por hibridização e ligação (SBL, do inglês sequence-by-ligation), entre outros.</p><p>SEQUENCIAMENTO DE TERCEIRA GERAÇÃO</p><p>Trazendo avanço substancial ao campo do sequenciamento de DNA, os métodos de terceira geração inovam por não necessitar que o DNA a ser sequenciado seja previamente amplificado por PCR, etapa comum aos métodos de primeira e segunda geração. Assim, essas novas tecnologias são chamadas de sequenciamento de única molécula (SNS, do inglês single molecule sequencing).</p><p>SEQUENCIAMENTO PORTÁTIL</p><p>O mais recente avanço no campo do sequenciamento de DNA foi o desenvolvimento de plataformas portáteis capazes de sequenciar grandes moléculas de DNA em pequenos equipamentos, semelhantes a pen drives. Uma dessas plataformas é a MinION, que utiliza nano poros para a leitura de variações na corrente elétrica, promovidas pela passagem de um determinado nucleotídeo, registrando em tempo real a sequência de nucleotídeos da molécula de DNA que está sendo analisada.</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=XPzMRyqEMkA</p><p>1- Com o passar do tempo, as técnicas de sequenciamento ficaram mais sofisticadas e automatizadas. Sobre o sequenciamento de segunda geração, analise as sentenças a seguir:</p><p>I- O Next Generation Sequencing (NGS) não utiliza nucleotídeos terminadores de cadeia, permitindo a criação de plataformas mais eficientes e rápidas.</p><p>II- Os métodos de segunda geração compreendem o uso de plataformas portáteis com processamento rápido e eficiente, em plataformas do tamanho de um pen drive.</p><p>III- Os métodos de segunda geração compreendem o pirosequenciamento, o sequenciamento por síntese, sequenciamento por terminação de cadeia reversível, sequenciamento por hibridização e ligação, dentre outros.</p><p>Assinale a alternativa CORRETA:</p><p>A) Somente a sentença I está correta.</p><p>B) As sentenças I e III estão corretas.</p><p>C) As sentenças I e II estão corretas</p><p>D) Somente a sentença II está correta.</p><p>2- Através da técnica de eletroforese, ocorre a separação de moléculas em populações de tamanhos</p><p>semelhantes, as quais são visualizadas como bandas no gel através de marcadores específicos. Sobre os marcadores para técnica de eletroforese em gel, assinale a alternativa CORRETA:</p><p>A) O corante ideal para eletroforese de DNA e RNA é aquele que não se liga ao DNA ou ao RNA,</p><p>ficando somente na solução tampão da técnica.</p><p>B) O marcador ideal é o brometo de etídio, um corante fluorescente, que se liga ao DNA ou RNA e</p><p>possibilita a sua visualização através de luz ultravioleta (UV).</p><p>C) O corante mais utilizado para marcação de DNA é o azul de brometo.</p><p>D) O marcador ideal para a técnica de eletroforese em gel será aquele capaz de separar as bandas de DNA em diferentes tons de cores</p><p>3- Existem diferentes formas de sequenciar um genoma, sendo que cada uma se aplica dependendo</p><p>da realidade do pesquisador em questão, podendo ser técnicas recentes, que são mais robustas e</p><p>sofisticadas, ou então, técnicas mais antigas, que, ainda assim, demonstram um excelente resultado,</p><p>apesar de serem mais complicadas e menos automatizadas. Sobre essas técnicas, associe os itens,</p><p>utilizando o código a seguir:</p><p>I- Sequenciamento de Sanger.</p><p>II- Next Generation Sequencing.</p><p>III- Sequenciamento de terceira geração.</p><p>( ) Método de primeira geração, mais conhecido por utilizar nucleotídeos terminados de cadeia</p><p>(ddNTP).</p><p>( ) Método que permite a análise da sequência de nucleotídeos em uma única molécula de DNA, sem a necessidade de amplificação dessa molécula, em tempo real.</p><p>( ) São métodos de nova geração, que não utilizam nucleotídeos terminadores de cadeia para o processamento das amostras.</p><p>Assinale a alternativa que apresenta a sequência</p><p>CORRETA:</p><p>A) I - II - III.</p><p>B) III - II - I.</p><p>C) II - I - III.</p><p>D) I - III - II</p><p>4- A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) se refere à replicação in vitro de um fragmento de DNA. Sobre o PCR, assinale a alternativa CORRETA:</p><p>A) A enzima DNA polimerase humana é uma das principais responsáveis pelo sucesso da técnica</p><p>in vitro.</p><p>B) O processo do PCR não necessita da utilização de nucleotídeos.</p><p>C) O processo de replicação in vitro, depende do uso de primers (oligonucleotídeos sintéticos), com sequências de 18 a 22 nucleotídeos, que seja complementar ao gene de interesse.</p><p>D) A ligação dos primers à fita de DNA é denominado como desnaturação</p><p>5- O sequenciamento Shotgun, o qual é aplicado como estratégia para o sequenciamento de grandes sequências de nucleotídeos, especialmente genomas inteiros dos mais diversos organismos.</p><p>Sobre o sequenciamento Shotgun, avalie as asserções a seguir e relação proposta entre elas:</p><p>I- Devido ao grande volume de informação gerado por esse procedimento, é necessário que programas computacionais sofisticados sejam utilizados para a determinação da sequência do material em estudo.</p><p>PORQUE</p><p>II- Na técnica Shotgun, o material clonado é sequenciado diversas vezes, fornecendo uma quantidade de dados de cerca de 10 vezes o tamanho do material genético que está sendo estudado, assegurando que todos os nucleotídeos presentes no material genético sejam detectados e inseridos na sequência final do DNA.</p><p>Assinale a alternativa CORRETA:</p><p>A) A asserção I é uma proposição falsa, e a II é uma proposição verdadeira.</p><p>B) As asserções I e II são proposições verdadeiras, mas a II não é uma justificativa da I.</p><p>C) As asserções I e II são proposições falsas.</p><p>D) As asserções I e II são proposições verdadeiras, e a II é uma justificativa da I</p><p>6- A terceira geração de métodos de sequenciamento de DNA, possibilitaram analisar as sequências de nucleotídeos de uma única molécula de DNA, sem a necessidade de amplificar a molécula. Sobre esses métodos, assinale a alternativa CORRETA:</p><p>A) É um método totalmente automatizado, também conhecido como Illumina, em que o DNA a ser sequenciado é fragmentado por nebulização e os fragmentos são acoplados a uma placa de vidro por meio de primers adaptadores, formando uma biblioteca de DNA, que será submetida ao PCR.</p><p>B) É o mais recente avanço em biologia molecular, que permite o sequenciamento de DNA de forma portátil, capaz de sequenciar grandes moléculas de DNA em pequenos equipamentos, semelhantes a pen drives. A plataforma MinION é a mais utilizada.</p><p>C) Para os métodos de terceira geração, são utilizadas plataformas 454, que são esferas sólidas, nas quais são ligadas as sequências adaptadoras, com o DNA a ser sequenciado, formando uma biblioteca de DNA.</p><p>D) A terceira geração de sequenciamento utiliza DNA fragmento que é transformado em fragmentos de DNA circular, os quais são replicados em chips com nano-poços. A cada novo nucleotídeo adicionado à nova fita, ocorre a emissão de fluorescência e a detecção ocorre em tempo real</p><p>O gráfico a seguir ilustra uma curva de amplificação da PCR em tempo real. De acordo com a interpretação do gráfico, classifique V para as sentenças verdadeiras e F para as falsas:</p><p>( ) A amostra A possui maior quantidade do gene avaliado, uma vez que possui menor Ct.</p><p>( ) A amostra C possui maior quantidade de amostra, pois quanto maior o Ct, maior a quantidade de</p><p>material disponível para iniciar a amplificação do gene de interesse.</p><p>( ) A amostra B ultrapassou o Threshold após o ciclo 20, apresentando uma quantidade</p><p>intermediária de amostra, quando comparadas às amostras A e C</p><p>Assinale a alternativa que apresenta a sequência CORRETA:</p><p>A) F - F - V.</p><p>B) V - F – V</p><p>C) V - V - F.</p><p>D) V - F - F</p><p>https://shutr.bz/3f8B9XQ</p><p>Bons estudos!</p><p>FONTE:</p><p>59</p><p>image2.jpg</p><p>image3.jpg</p><p>image7.png</p><p>image8.jpeg</p><p>image9.png</p><p>image10.jpeg</p><p>image11.jpeg</p><p>image12.jpeg</p><p>image13.jpeg</p><p>image14.jpeg</p><p>image15.gif</p><p>image16.jpeg</p><p>image17.jpeg</p><p>image18.jpeg</p><p>image19.emf</p><p>image6.jpg</p><p>image4.jpg</p><p>image20.jpeg</p><p>image21.jpeg</p><p>image22.jpeg</p><p>image23.jpeg</p><p>image24.jpeg</p><p>image25.jpeg</p><p>image26.emf</p><p>image27.jpeg</p><p>image28.jpeg</p><p>image29.jpeg</p><p>image30.jpeg</p><p>image1.jpg</p>