IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVOS pdf 1

Prévia do material em texto

Estágio Supervisionado I 
Setor: Microbiologia 
Docente Preceptora: Esp. Edivânia Almeida 
 
 
 
IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVOS 
 STAPHYLOCOCCUS 
 
1. Prova Catalase 
Enzima que decompõe o peroxido de hidrogênio em água e oxigênio, havendo 
a formação de bolhas. 
 
 Técnica 
1. Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3% sobre uma 
lâmina; 
2. Com auxílio de fio bacteriológico ou palito, agregar a colônia em estudo na gota 
de peróxido de hidrogênio. 
 
 Interpretação 
 Positivo: Presença imediata de bolhas - a produção de efervescência indica a 
conversão do H2O2 em água e oxigênio gasoso. 
 Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência. 
 
2. Prova Coagulase 
Proteína com atividade similar à protrombina, capaz de converter o fibrinogênio 
em fibrina, que resulta na formação de um coágulo visível. 
 
 Técnica 
• Lâmina - Coagulase fixa ou ligada 
1. Utilizar uma lâmina de vidro; 
2. Colocar duas gotas de solução fisiológica estéreis dentro formando dois 
círculos; 
3. Com auxílio de um fio bacteriológico agregar a colônia em estudo, 
homogeneizando delicadamente em cada círculo; 
4. Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos 
círculos; 
5. No outro círculo, adicionar outra gota de água destilada ou solução 
fisiológica estéreis, como controle; 
6. homogeneizar com palito de madeira; 
7. Inclinar a lâmina delicadamente, para frente e para trás e observar 
presença de aglutinação. 
• Tubo - Coagulase livre 
1. Utilizar tubo de vidro; 
2. Colocar 0,5 mL de plasma em tubo de ensaio; 
3. Adicionar uma alçada de colônia diretamente no plasma de coelho; 
4. Incubar por 4 h a 37ºC em estufa ou banho-maria; 
5. caso não haja formação de coágulo, incubar por 24 h. 
 
Interpretação 
 Positivo: Presença de coagulo. (Realiza Dnase ou monitol em seguida). 
 Negativo: Ausência de coagulo. (Realiza Novabiocina). 
 Formação de grumos em 10 segundos (PARA PROVA EM LÂMINA). 
 
3. Prova Dnase 
Verifica se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada 
o ácido nucléico (DNA). 
 
 Técnica 
1. Preparar o meio DNAse 
2. Autoclavar a 121° c por 15 minutos 
3. Distribuir sobre placas 
4. Fazer um inóculo denso com cepa bacteriana de forma circular em uma 
pequena parte do meio; 
5. Incubar a 37ºC por 18 - 24 h. 
6. Obs: A placa pode ser inoculada com várias cepas. 
7. Adicionar HCL dentro da placa, aguardar por 5 minutos a formação de halo. 
 
Interpretação 
 Formação de halo- Positivo 
 Ausência de halo- negativo 
 
4. Teste De Fermentação do Monitol 
Verifica se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o manitol contendo 
7,5% de cloreto de sódio. 
 
 Técnica 
1. Preparar o meio monitol 
2. Autoclavar a 121° c por 15 minutos 
3. Distribuir sobre placas 
4. Fazer semeio do tipo estria sobre a placa 
5. Incubar a 37ºC por 18 - 24 h. 
 
Interpretação 
 Formação de halo amarelo ao redor das colônias, identifica Staphylococcus 
aureus. 
 Meio permanece inalterado ao redor das colônias, identifica outro 
Staphylococcus coagulase negativa. 
 
• OBS: CATALASE POSITIVA + COAGULASE POSITIVA+ DNASE POSITIVA 
SUSGESTIVO PARA STAPHYLOCOCCUS AUREUS. 
• OBS: CATALASE POSITIVA + COAGULASE NEGATIVA+ DNASE OU 
MONITOL NEGATIVO SUSGESTIVO PARA STAPHYLOCOCCUS 
LUGDUNENSIS. 
 
5. Teste Novabiocina 
Separa espécies de Staphylococcus coagulase negativa que podem ser 
sensíveis ou não a Novobiocina. 
 
 Técnica 
1. Preparar meio Ágar Mueller Hinton; 
2. Preparar uma suspensão do microrganismo em caldo BHI, TSA ou solução 
fisiológica estéril; 
3. Com auxílio de um "swab", semear na superfície de uma placa de Ágar 
Mueller Hinton; 
4. Com uma pinça previamente flambada, colocar um disco de Novobiocina na 
superfície do meio e pressionar delicadamente; 
5. Incubar na estufa por 24 horas. 
 
 Interpretação 
 Resistente: Ausência de halo de inibição ou halos <= 15 mm. 
 Sensível: Presença de halo de inibição igual ou superior a 16 mm. 
 Obs: (ausência de halo): Staphylococcus saprophyticcus. (RESISTENTE). 
 (presença de halo): Staphylococcus epidermidis ou Staphylococcus 
lugdunensis. (SENSÍVEL). 
 
• Obs: CATALASE POSITIVA + COAGULASE NEGATIVA + NOVABIOCINA 
RESISTENTE SUSGETIVO DE STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS. 
• CATALASE POSITIVA + COAGULASE NEGATIVA + NOVABIOCINA 
SENSÍVEL, SUSGETIVO DE STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS OU 
STAPHYLOCOCCUS LUGDUNENSIS. 
 
 
 STREPTOCOCCUS E ENTEROCOCCUS 
 
1. Prova Catalase 
Enzima que decompõe o peroxido de hidrogênio em água e oxigênio, havendo 
a formação de bolhas. 
 
 Técnica 
1. Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3% sobre uma 
lâmina; 
2. Com auxílio de fio bacteriológico ou palito, agregar a colônia em estudo na gota 
de peróxido de hidrogênio. 
 
 Interpretação 
 Positivo: Presença imediata de bolhas - a produção de efervescência indica a 
conversão do H2O2 em água e oxigênio gasoso. 
 Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência. 
 
BETA HEMOLISE: Lise total dos eritrócitos, apresentando coloração transparente ao 
contorno da bactéria. 
 
2. Teste Bacitracina 
Streptococcus beta hemolítico do grupo A são sensíveis a concentrações baixas de 
bacitracina. 
 
Técnica 
1. Preparar meio Ágar sangue; 
2. Preparar caldo BHI ou TSB recém turvado ou água destilada estéril; 
3. semear na superfície do meio Mueller hinton sangue, com auxílio do "swab"; 
4. Colocar um disco de bacitracina e pressionar levemente; 
5. Incubar à 35ºC 18 a 24 horas. 
 
Interpretação 
 Positivo (Sensível): Presença de qualquer halo ao redor do disco indica 
Streptococcus Pyogenes. 
 Negativo (Resistente): ausência de halo ao redor do disco. 
 
3. Teste De PYR 
O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida 
pelo S. pyogenes, mas não pelos demais estreptococos β-hemolíticos. Colônias β-
hemolíticas de enterococos podem ser confundidas com S. pyogenes, pois ambas 
apresentam positividade neste teste. 
 
 Técnica 
1. Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo 
sobre uma lâmina ou placa de Petri vazia; 
2. Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a 
reação mais lenta e menos intensa); 
3. Realizar um esfregaço com a bactéria a ser testada, recém-isolada, sobre o 
disco de PYR umedecido; 
4. Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação 
ocorrerá em até 1 minuto. 
 
 Interpretação 
 Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha; 
 O aparecimento de coloração amarela ou alaranjada indica resultado 
negativo; 
 Streptococcus Pyogenes e Enterococcus Spp. São PYR positivos. 
 
4. Teste de CAMP 
O teste visa a identificação de cepas de S. agalactiae (grupo B). Estas cepas 
produzem o fator CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen) que atua sinergicamente 
com a β-hemolisina produzida pelo Staphylococcus aureus em ágar sangue. 
 
Técnica 
1. Preparar meio ágar sangue 
2. Semear um inóculo de Staphylococcus aureus (ou cepa de S. aureus com duplo 
halo de hemólise) de um ponto a outro da placa de ágar sangue; 
3. Semear perpendicularmente (90°) a colônia de Streptococcus β-hemolítico a ser 
testada, sem que haja o contato com a estria de Staphylococcus aureus;4. Incubar a 37ºC por 48 h. 
 
 Interpretação 
 A formação de uma seta ou meia-lua convergindo para o S.aureus na 
intersecção do crescimento das duas bactérias indica que o teste é positivo e 
indicativo de Streptococcus Agalactiae. 
 Se não houver formação de seta ou meia-lua, o teste é negativo e a cepa não 
pertence ao grupo B de Lancefield. 
 
ALFA HEMOLISE: Lise parcial dos eritrócitos apresentando halo cor esverdeada em 
contorno da bactéria. 
GAMA HEMOLISE: Ausência de hemólise. 
 
5. Teste Optoquina 
É uma droga solúvel em água que se difunde rapidamente em meio de cultura 
sólido. Para este teste, em geral, utiliza-se o disco de optoquina de 6 mm contendo 5 
µg da droga. O teste tem sensibilidade maior que 95%. 
 
 
Técnica 
1. Preparar meio ágar sangue; 
2. Preparar uma suspensão do isolado em solução salina estéril (pegar alça com 
colônia da bactéria e diluir em tubo de vidro); 
3. Semear a suspensão em uma placa de ágar sangue de carneiro 5% em estrias 
e obter crescimento confluente; 
4. Após a absorção da suspensão pelo meio de cultura, colocar um disco de 
optoquina na superfície do meio semeado, com o auxílio de uma pinça; 
5. Incubar a 37 °c por 18 - 24 h; 
6. Fazer a leitura do halo de inibição do crescimento bacteriano. 
 
Interpretação 
 Sensível- Presença de halo maior ou igual 14 mm indica que a cultura é sensível à 
optoquina, sendo identificado para Streptococcus Pneumoniae. 
 Resistente- Presença de halo menor 14 mm indica que a cultura é sensível à 
optoquina, sendo identificado para Grupo Viridans. 
 
6. Bile Esculina 
A presença de bile no meio inibe o crescimento de organismos Gram positivos e 
estreptococos à exceção dos enteroccus e estreptococos grupo D. A hidrólise da 
esculina garante a diferenciação entre os dois gêneros. 
 
Técnica 
1. Preparar o meio bile esculina 
2. Acondicionar em tubo inclinados 
3. Usando alça de platina flambada e resfriada espalhar a amostra sobre a 
superfície inclinada do tubo conforme técnica adequada 
4. Incubar o material em estufa bacteriológica entre 35-37 C por 18-24h. 
 
Interpretação 
 Havendo crescimento com o desenvolvimento de uma coloração marrom Negra 
difusa pelo meio considera-se a esculina hidrolisada por Enterococcus Sp. 
 Não havendo alteração na coloração do meio considera Streptococcus. 
 
7. Tolerância Ao Nacl 6,5% 
Consiste em uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns 
microrganismos crescerem em presença do sal. O meio base utilizado é o BHI caldo, 
que é um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo de muitas bactérias. 
Este meio normalmente contém 0,5 % de NaCl e aumenta -se a concentração para 6,5 
%, tornando um meio semi-seletivo para o desenvolvimento de alguns microrganismos. 
 
Técnica 
1. Preparar o caldo BHI; 
2. Adicionar em tubos de vidro; 
3. Inocular 2 a 3 colônias a serem testadas em um caldo BHI; 
4. Incubar a 35 ºC (±2ºC) por até 72 h. 
 
 Interpretação 
 Turvação ou mudança de cor- Enterococcus Sp. 
 Ausência de turvação ou mudança de cor- Streptococcus Spp. 
 
8. Referências 
1. Oplustil CP, Zoccoli CA, Tobouti NR, Scheffer MC. Procedimentos 
básicos em Microbiologia Clínica. 4. ed. São Paulo: Sarvier, 2020. 
2. Madigan TM, Martinko JM, Bender KS, et al. Microbiologia de Brock. 14. 
ed. Porto Alegre: Artmed, 2016. 
3. Godoy ALPC, Cunha AMGC, et al. Análises Clínicas. 5. Vol. Salvador: 
Sanar, 2019.