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Questionário 6 de Bioquímica 1. Quando a diciclo-hexilcarbo-di-imida (DCCD) é adicionada a uma suspensão de mitocôndrias fortemente acopladas, respirando ativamente, a velocidade da transferência de elétrons e a velocidade da produção de ATP diminuem drasticamente. Se uma solução de 2,4-dinitrofenol for agora adicionada à preparação mitocondrial inibida, o consumo de O2 retorna ao normal, mas a produção de ATP permanece inibida. a) Que processo é afetado pela DCCD? A DCCD inibe o funcionamento da ATP-sintase, fazendo com que ela não bombeie mais prótons nem produza ATP. b) Por que a DCCD afeta o consumo de oxigênio da mitocôndria? Porque uma vez que os prótons começam a ficar acumulados do lado de fora pela interrupção da ATP-sintase, isso faz com que a cadeira de transporte de elétrons não consiga mais funcionar como deveria (porque fica mais difícil jogar H+ pra fora e portanto transportar elétrons) e o consumo de oxigênio é reduzido. c) Explique o efeito do 2,4-dinitrofenol na preparação mitocôndria inibida. O 2,4-dinitrofenol ou DNP age abrindo poros na membrana e então os prótons podem retornar à matriz, de modo que a cadeira de transporte de elétrons também volta a funcionar e consumo de oxigênio volta a ocorrer. Mas como a ATP-sintase continua inibida e os prótons estão passando livremente pela membrana, eles não irão passar pela ATP-sintase e não haverá produção de ATP. Esse processo é chamado de desacoplamento entre consumo de oxigênio e síntese de ATP. d) O DCCD afeta o ciclo de Krebs? Sim, pois irá impedir a regeneração do NADH em NAD+ e então o NADH que acumula atua como como regulador negativo do ciclo, fazendo com que ele aconteça com menor velocidade e portanto venha a produzir menos NADH. 2. O cianeto é um inibidor do complexo IV da cadeia transportadora de elétrons. Mitocôndrias expostas ao cianeto não realizam a transferência de elétrons do citocromo c para o O2. Qual o efeito do cianeto na produção de NADH pelo ciclo de Krebs? Similarmente ao DCCD, o cianeto impede a regeneração de NAD+ e o NADH por inibidor o citocromo c , e então o NADH passa a atuar como inibidor do ciclo de Krebs. 3. Assinale V (verdadeiro) ou F (falso) e justifique a resposta. a. O O2 consumido no processo de respiração celular é liberado na forma de CO2 produzido no ciclo de Krebs (F). Falso, na verdade o oxigênio é liberado na forma de água. b. A mitocôndria é o sítio do ciclo de Krebs e da fosforilação oxidativa, mas a glicólise acontece no citoplasma (V). A glicólise acontece no citoplasma pelo auxílio das enzimas livres ali, o ciclo de Krebs ocorre na matriz mitocondrial e a fosforilação oxidativa nas cristas mitocondriais. c. Um inibidor da Fo-F1-ATPase inibe a síntese de ATP, mas não necessariamente interrompe o fluxo de elétrons pela cadeia transportadora de elétrons (V). Verdadeiro. Como visto na questão 1, a adição de DNP após a inibição da ATP-sintase gera poros e os prótons voltam a fluir de modo que a cadeira de transporte de elétrons volta a funcionar. d. Um agente químico que abre um poro permeável à prótons na membrana mitocondrial interna inibe a síntese de ATP (F). É bem verdade que fazer com que os prótons fiquem fluindo livremente pela membrana vai diminuir as “chances” dele passar pela ATP-sintase a produção de ATP será bastante afetada, mas não vai ser completamente inibida. e. Para cada molécula de acetil-CoA que entra no ciclo de Krebs, uma molécula de oxaloacetato é produzida (F). A molécula de oxaloacetato é produzida mas logo é consumida, então não se pode dizer que o ciclo de Krebs produz uma molécula de oxaloacetato. 4. Uma solução contendo mitocôndrias isoladas, ADP e Pi foi incubada com diferentes compostos: a) glicose b) NADH e c) succinato. Indique qual foi o efeito de cada composto no consumo de oxigênio e produção de ATP e justifique a resposta. a) Glicose: A glicose não irá afetar em nada porque como estamos tratando de mitocôndrias isoladas, elas não possuem a capacidade de fazer glicólise pois as enzimas necessárias para esse processo estão no citoplasma. b) NADH: O NADH é um substrato para a síntese de ATP, portanto ele aumenta a produção de ATP e também o consumo de oxigênio. c) Succinato: O succinato é um intermediário do ciclo de Krebs. Se ele for adicionado, ele impulsiona o ciclo, o que irá também regular positivamente o consumo de oxigênio e a produção de ATP. 5. Um inibidor da FoF1-ATPase (ou ATP sintase) pode afetar a velocidade do transporte de elétrons entre a ubiquinona e o complexo III? Justifique. Sim. Se a ATP-sintase for inibida, prótons começam a acumular no lado de fora e fica cada vez mais difícil para os complexos da membrana funcionarem, pois eles trabalham jogando elétrons para fora (e agora esse processo acontece mais favoravelmente no sentido inverso pelo acúmulo). 6. Como o NADH produzido no citoplasma em consequência da glicólise pode ser aproveitado para produção de ATP pela fosforilação oxidativa? Ele pode ser aproveitado por meio dos métodos de lançadeiras de elétrons. A membrana interna não é permeável a NADH, por isso é necessário sistemas especiais. A lançadeira malato-aspartato, por exemplo, funciona transportando NADH para dentro da matriz mitocondrial. O oxaloacetato é convertido em malato que então entra por transportadores para a matriz. Dentro da matriz esse malato é convertido em oxaloacetato e um NADH é produzido. Outras reações acontecem no intuito de regenerar o oxaloacetato no espaço intermembrana novamente. Em resumo, todas essas reações ocorrem de maneira que seja possível colocarmos esse NADH para dentro. Outro tipo de lançadeira é a lançadeira do glicerol-3-fosfato. Essa, por sua vez, funciona por reações em que os NADHs produzidos na glicólise são usados para gerar glicerol-3-fosfato, que é reconvertido em dihidroxiacetona-fosfato e essa conversão forma FADH2, que é então entregue diretamente a ubiquinona, que passa os elétrons ao complexo III. As duas diferem na eficiência de produção de ATP, isso porque a malato-aspartato, entrega o NADH ao complexo I, e então a energia a ser aproveitada é maior. 7. Animais hibernantes (ursos) possuem depósitos adiposos que garantem a hidratação do organismo por períodos prolongados sem a ingestão de água, bem como a manutenção da temperatura corporal. Explique como isso é possível. Isso se faz possível porque esses animais possuem tecidos adiposos marrons. Esses tecidos são ricos em mitocôndrias, mas elas possuem uma proteína diferente, a termogenina. Essa termogenina é uma via para que os prótons retornem à matriz sem ser pela ATP-sintase. A energia dos prótons voltando, então, não é usada para gerar ATP, mas sim é liberada na forma de calor, que mantem a temperatura corporal desses indivíduos. A oxidação das gorduras, além de manter a temperatura corporal, também libera grandes quantidades de água que irão repor a água perdida na respiração. 8. A proteína IF1 dimeriza em situação de pH baixo na matriz mitocondrial e se associa às subunidades responsáveis pela catálise da síntese de ATP na FoF1 ATPase. Qual a função desse processo e sua importância? Esse processo ocorre durante a hipóxia (baixas concentrações de oxigênio). Isso porque nessas condições, a principal fonte de ATP da célula passa a ser a glicólise, e o ácido pirúvico ou lático formado a partir desse processo anaeróbico diminui o pH da célula, ativando a IF1. Se isso não acontecesse, a ATP-sintase trabalharia no sentido contrário, fazendo a hidrólise do ATP para bombear prótons para fora, em função da força próton-motriz estar desestabilizada. 9. O citocromo c é um transportador de elétrons entre os complexos III e IV da mitocôndria e um sinalizador pró-apoptótico. Explique a razão e significado fisiológico dessa proteína exercer funções tão diferentes. Curiosamente, a mitocôndria participa da manutenção de várias funções, tais como respiração celular e síntese deATP, modulação do estado redox da célula, regulação osmótica, controle do pH entre outras. De maneira contraditória, possui dentro de si substâncias capazes de levar ao processo de morte celular. Como a mitocôndria é envolvida nesses primeiros processos, ela é capaz de “sentir” quando as coisas não estão transcorrendo bem, e é capaz de sinalizar a morte celular. Quando a célula recebe um sinal externo ou mesmo desencadeia processos internos de sinalização apoptótica. Isso começa aumentando a permeabilidade da membrana da célula, e o citocromo c então consegue escapar da mitocôndria por ser pequeno e solúvel. A ligação desse e do ATP induz a protease Apaf-1 a formar um apoptossomo, que por sua vez é capaz de ativar a caspase-9, que ativa algumas outras caspases levando à morte celular. 10. A enzima adenilato cinase catalisa a interconversão entre ATP + AMP ↔ 2 ADPs. Descreva a importância dessa enzima para a manutenção da homeostase metabólica celular. A sua importância se dá pois ela proporciona que o fosfato de alta energia do ADP seja utilizado na síntese do ATP, assim como o AMP formado pela quebra do ATP seja refosforilado a ADP, ou seja, ela permite todas as conversões. Ademais, concentração de AMP é um indicador muito sensível em relação ao estado energético da célula. Quando o ATP é consumido, o aumento relativo de AMP é muito maior do que na ADP, então é mais eficiente que os processos de homeostase metabólica sejam comandados por alterações nas concentrações de AMP.
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