GEN_Estudo dirigido I - Estrutura dos ac nt - Replicação - Mutaçoes e reparo DNA_2019 1

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Universidade Federal de São João Del-Rei – Campus Alto Paraopeba (CAP) 
Engenharia de Bioprocessos – 2019/1 
Profª. Izabel de Souza Chaves 
 
ESTUDO DIRIGIDO I – Genética Microbiana 
TEMAS: Estrutura dos ácidos nucleicos (revisão) – Replicação do DNA – Mutações e 
mecanismos de reparo do DNA 
(Questão 1) quais características da molécula de DNA a fazem adequada para ser a 
molécula informacional da natureza? 
A molécula de DNA é considerada a molécula informacional da natureza, por apresentar 
capacidade de armazenamento de informações gênicas e transmiti-las às demais gerações. 
 
(Questão 2) cite as principais diferenças entre DNA e RNA e especifique os principais tipos 
de RNA existentes. 
As principais diferenças do DNA e RNA consentem no tipo de açúcar e nas bases 
nitrogenadas que compões as moléculas. O DNA apresenta uma desoxirribose como açúcar e possui 
Guanina, Citosina, Timina e Adenina como bases nitrogenadas, já o RNA possui um açúcar ribose e 
tem Guanina, Citosina, Uracila e Adenina como bases nitrogenadas. 
O RNA é “dividido” em tipos específicos. Sendo eles, RNA mensageiro (RNAm) que é 
responsável por transportar a informação genética, possui um tamanho variável e é muito instável, ou 
seja, degrada-se rapidamente. RNA transportador (RNAt) que é uma molécula pequena, possui 
papel fundamental na síntese proteica recebendo e transportando aminoácidos, por enrolar-se sobre 
si, sua forma é considerada uma folha de trevo. RNA ribossômico (RNAr) este é responsável pela 
síntese proteica, é uma molécula mais estável e, por isso, não se degrada facilmente, é a maior 
porção de RNA no organismo. 
 
(Questão 3) descreva o experimento de Meselson & Sthal (1958) que comprovou que a o 
processo de replicação do DNA é semiconservativo. 
Meselson & Sthal Cultivaram bactérias E.coli num meio com 15N (Isótopo pesado de 
Nitrogênio) e depois centrifugaram seu DNA, o resultado obtido da centrifugação foram que todas as 
cadeias originadas após o cultivo apresentavam apenas 15N. Logo após, cultivaram bactérias E.coli 
na presença de 14N (Isótopo normal de nitrogênio) e depois centrifugaram o DNA, como analisado 
no experimento anterior, todas cadeias originadas após o cultivo, apresentavam o mesmo isótopo 
com o qual foram cultivados, neste caso, 14N. Posteriormente, as bactérias E.coli foram cultivas em 
um meio para reprodução e tiveram seu DNA recolhido, purificado e centrifugado para análise de 
 
 
 
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densidades. Os resultados obtidos foram, a densidade de flutuação variava entre os valores de 
15N (mais denso) e 14N (menos densas), além disso, observou-se que, após a replicação, cada dupla 
hélice de DNA continha quantidades similares de 15N e 14N. 
Um segundo experimento foi conduzido após perceberem que os resultados obtidos se 
encaixavam tanto na hipótese de replicação dispersiva quanto na hipótese de replicação 
semiconservativa. Este novo estudo consistiu em um novo cultivo de Bactérias com foco em 
reprodução. Três tempos diferente de reprodução foram obtidos como resultado. Logo após, as 
células foram removidas e as moléculas de DNA foram purificados para serem estudadas. Por fim, 
centrifugou-se uma amostra de DNA e analisou-se sua densidade. Como resultado, obtiveram uma 
dupla hélice, onde, um dos lados, apresentava densidade 15N e, no outro, a densidade menor 14N. 
Esse resultado se encaixa na hipótese de replicação semiconservativa. 
 
(Questão 4) explique por que a replicação é semidescontínua e qual a importância dos 
fragmentos de Okazaki. 
O modelo estrutural para a molécula de DNA proposto por Watson & Crick indica que a 
replicação do DNA ocorre de uma forma tal que cada filamento é utilizado como molde para síntese 
de seu filamento complementar. Neste processo, uma molécula de DNA é composta por um 
filamento velho (molde/fita mãe) e um filamento novo (recém-sintetizado/fita filha). Assim, a 
replicação é semiconservativa. No entanto, a enzima DNA polimerase apenas “polimeriza” no 
sentido 5’→3’. Uma vez que as duas cadeias da molécula de DNA são antiparalelas e que a forquilha 
de replicação separa as duas cadeias no mesmo local, a cadeia que está no sentido 5’→3’ é replicada 
facilmente no sentido da abertura da forquilha de replicação. O problema está na outra cadeia, que 
está orientada no sentido 3’←5’, na qual a DNA polimerase não se consegue ligar e realizar a sua 
função pois a abertura da forquilha de replicação ocorre em sentido contrário à de replicação. Para 
resolver este problema, a célula faz a cópia da cadeia que está orientada de 3’←5’ de uma forma 
descontínua. Ficando esta cadeia a denominar-se por ‘cadeia atrasada’. 
Neste processo, vários pequenos fragmentos da cadeia atrasada vão sendo replicados à 
medida que a forquilha de replicação avança (de 5’→3’) e separa mais comprimento da dupla hélice 
 
 
 
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da molécula de DNA. Os fragmentos resultantes desta replicação descontínua são chamados de 
Fragmentos de Okazaki. Assim, embora a cadeia atrasada esteja a crescer no sentido 3’→5’, na 
verdade os Fragmentos de Okazaki estão a ser sintetizados no sentido 3’←5’. 
Após os primers serem removidos, as lacunas de ácidos nucleicos entre Fragmentos de 
Okazaki são preenchidas e uma última enzima, DNA ligase, liga os fragmentos, formando uma nova 
cadeia simples de DNA contínua. 
 
(Questão 5) quais são as principais proteínas envolvidas no processo de replicação e qual a 
função que cada uma delas? 
DNA polimerase: são as enzimas responsáveis pela síntese e reparo do DNA; 
DNA ligase: catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster; 
DNA-Helicase: quebrar as pontes de hidrogênio entre as bases, separando as duas fitas de 
DNA; 
DNA-Girase: promovem a quebra transitória de ligação fosfodiéster da fita de DNA, 
introduzindo ou removendo o superenrolamento; 
Endonuclease: corta o esqueleto do DNA em uma fita de DNA e facilita o reparo e as 
inserções; 
Exonuclease: corta o DNA em uma extremidade exposta, facilita o reparo; 
Metilase: adiciona o grupo metil as bases selecionadas na nova fita de DNA; 
Fotoliase: utiliza a energia da luz visível para separar os dímeros de pirimidina induzidos 
pela luz UV; 
Primase: primer” ou iniciador; 
Ribozima: enzima de RNA que remove introns e processa exons conjuntamente; 
RNA-polimerase: copia RNA a partir de um molde de DNA; 
snRNP: complexo RNA-proteina que remove intros e processa exons conjuntamente; 
Topoisomerase: relaxa o superenovelamento acima da forquilha de replicação; separa DNA 
circular no final da replicação; 
Transpoase: corta o esqueleto de DNA, formando extremidades coesivas; 
 
 
 
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SSB: se ligam ao DNA de fita simples e evitam que as regiões sofram torções ou estruturas 
secundárias, induzindo a conformação ideal para a replicação e pareamento de bases. 
 
(Questão 6) descreva como ocorre a replicação do DNA e as principais diferenças entre 
procariotos e eucariotos. 
A replicação do DNA ocorre com uma fidelidade muito alta e em um tempo designado no 
ciclo celular, é semiconservativa, cada fita atuandocomo molde para a nova fita filha e é realizada 
em três fases: iniciação, alongamento e terminação. 
A reação começa na origem e usualmente prossegue bidirecionalmente. O DNA é 
sintetizado na direção 5’->3’ pelas DNA polimerases 64 Na forquilha de replicação: a fita líder é 
sintetizada continuamente na mesma direção da movimentação da forquilha de replicação. Na 
forquilha de replicação: a fita atrasada é sintetizada descontinuamente como fragmentos de Okazaki, 
que são subsequentemente ligados. Na E.coli a DNA polimerase III é a principal enzima de 
replicação (em eucariotos DNA polimerase δ). A replicação do cromossomo de E.coli envolve 
muitas enzimas e fatores proteicos organizados e ligados à parte interna da membrana celular. A 
replicação é semelhante nas células eucarióticas, mas os cromossomos eucarióticos possuem muitas 
origens de replicação e a terminação se dá nos telômeros. 
As principais diferenças entre procariotos e eucariotos são: em procariotos, a sequências de 
término específicas (chamadas sítios Ter) bloqueiam a replicação. Uma proteína de término, 
chamada Tus na E. coli, liga-se a essas sequências, criando um complexo Tus-Ter. já em Eucariotos, 
a terminação da replicação nos cromossomos eucarióticos lineares envolve a síntese de estruturas 
especiais nas extremidades de cada cromossomo -> Telômeros. 
 
(Questão 7) vimos que as origens das mutações podem ser de forma espontânea ou 
induzida. Cite quais os principais agentes envolvidos em cada uma delas. 
Mutação espontânea: acontecem espontaneamente quando o DNA está sendo duplicado. 
Taxa: 1 a cada 10^9 pares de bases replicados (ex.: desaminação e depurinação) 
 
 
 
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Mutação induzida: ocorre través da exposição a agentes mutagênicos (ex.: agentes 
químicos, raios UV, raios X, raios λ). 
 
(Questão 8) descreva os principais tipos de mutações cromossômicas e os principais tipos 
de mutações gênicas. 
Mutações cromossômicas: 
Numéricas: 
*Euploidia: Conjunto de cromossomo de uma espécie 
1. Monoploidia: n cromossomos 
 2. Diploidia: 2n cromossomos 
3. Triploidia: 3n cromossomos 
 4. Poliploidia: mais de dois conjuntos 
*Aneuploidia: Número de cromossomos difere da espécie 
 1. Monossomia: 2n – 1 
 2. Trissomia: 2n + 1 
 3. Nulissomia: 2n – 2 
Estruturais: 
*Inversões: Paracêntricas ou Pericêntricas 
*Deleção: Terminal ou Intersticial 
*Translocação: Recíproca ou Simples 
*Duplicação: 
Mutações gênicas: 
Mutação de ponto: É a substituição de um nucleotídeo por outro 
*Silenciosa: É a substituição de um nucleotídeo por outro 
*Sem sentido: a substituição do nucleotídeo produz um códon de terminação da proteína 
*Sentido trocado: a substituição do nucleotídeo alterou o aminoácido, alterando a proteína 
produzida 
Mutação do quadro de leitura: 
 
 
 
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*Inserção: É a adição de um par de bases ou de grandes trechos do DNA 
*Deleção: É a remoção de um par de bases ou de grandes trechos do DNA 
 
 
 
(Questão 9) considerando que mutações podem dar origem a células cancerosas, comente 
como as seguintes alterações poderiam ser danosas para um organismo: 
a) Remoção de três nucleotídeos consecutivos no meio da sequência codificadora. 
Mutação por deleção de códon, pode haver tradução de um aminoácido a menos alterando a 
formação final da proteína. 
b) Remoção de um único nucleotídeo no início da sequência codificadora. 
 Mutação por deslocamento, alteração na matriz de leitura dos códons. 
c) Substituição de um nucleotídeo por outro no meio da sequência codificadora. 
 Pode provocar uma mutação de sentido trocado alterando a proteína produzida. 
 
(Questão 10) descreva os principais mecanismos que a célula possui para reparar o DNA. 
1. Reparação por fotorreatividade enzimática: 
Neste processo, tem-se as seguintes etapas: inicialmente, a enzima reconhece e liga-se ao 
dímero; depois, a absorção de luz fornece energia para converter o dímero em monômero de 
pirimidina; por fim, a enzima dissocia-se do DNA. A reação depende do gene que codifica a 
fotoliase e ocorre especificamente em procariotos. 
 
2. Reparação de bases alquiladas: 
A base nitrogenada primariamente afetada pelos agentes alquilantes é a guanina. Esta lesão 
é removida pela enzima O-6-metilguanina-metiltransferase, que reconhece a alteração no DNA e 
remove o grupamento metila causador da mutação. A mesma enzima também pode remover 
grupamentos metila dos fosfatos que possivelmente interrompem a cadeia de DNA. Uma 
 
 
 
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característica importante dessa reação é que cada grupamento metila removido consome uma enzima 
O-6-metilguanina-metiltransferase, a qual não pode ser recuperada para nova utilização. 
 
3. Reparação por excisão de base: 
 Ocorre quando a remoção da base defeituosa é feita pela clivagem da ligação base 
nitrogenada – desoxirribose, seguida pelo preenchimento da região com a base correta por ação da 
DNA-polimerase. Um exemplo comum de reparo por excisão de base é o que acontece na correção 
da desaminação da citosina à uracila. O sistema de reparação reconhece a uracila como uma base 
estranha ao DNA. Primeiramente, a uracila-DNA-glicosilase hidrolisa a ligação entre a uracila e a 
molécula de desoxirribose. Nesse estágio, a cadeia de DNA está intacta, mas a base é perdida. A 
enzima AP endonuclease reconhece, então, essa fenda e cliva a cadeia em regiões adjacentes à base 
perdida. A DNA-polimerase insere novamente uma citosina, de acordo com a orientação fornecida 
pela fita complementar não-danificada, que contém uma guanina. Finalmente, a integridade da fita 
corrigida é restaurada pela DNA-ligase. Existem outras glicosilases que reconhecem e removem 
hipoxantina, 3-metil-adenina e purinas com anel imidazol aberto por radiação ionizante ou pH 
elevado. 
 
4. Reparação por excisão de nucleotídeos: 
Ocorre quando a remoção da base defeituosa é feita pela incisão endonucleolítica nos dois 
lados da lesão, com liberação dos nucleotídeos, seguida pelo preenchimento da região por ação da 
DNA-polimerase. Em todos os organismos onde já foi estudado, o processo de REN consiste em 
cinco etapas: 1. Reconhecimento da lesão por um complexo multienzimático; 2. Incisão da fita 
anormal em ambos os lados da lesão a alguma distância desta; 3. Excisão do segmento contendo a 
lesão; 4. Síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não-danificada como molde, por 
ação da DNA-polimerase; 5. Ligação/restauração da molécula de DNA por ação da enzima DNA-
ligase. A extensão média do fragmento de DNA removido é de 12 nucleotídeos, razão pela qual esse 
modelo é chamado de reparação de regiões curtas. Em caso de grandes quantidades de lesões, em 
que a substituição envolve de 1500 a 9000 nucleotídeos, o modelo é conhecido como reparação de 
 
 
 
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regiões longas. A diferença entre esses dois modelos de reparação é que o primeiro é uma função 
constitutiva da célula, enquanto o segundo deve ser induzido por lesões no DNA – pelo menos no 
que diz respeito à célula bacteriana. O modelo proposto para o sistema de REN em mamíferos é o 
seguinte: 
1. As proteínas XPB, XPD e XPA estão envolvidas na detecção da lesão, sendo que as duas 
primeiras percorrem a hélice e a segunda reconhece a lesão; 
2. Após encontrar a lesão, o DNA do local do dano é desnaturado e as endonucleases XPF e 
XPG fazem a dupla incisão na cadeia; 
3. O oligonucleotídeo contendo a lesão é removido pelas DNAs-polimerases δ e ε e pelos 
seus cofatores PCNA e RF-C, que também são responsáveis pelo passo seguinte; 
4. Ressíntese do DNA utilizando a fita não danificada como molde; 
5. Ligação da extremidade 5’ da região recém-sintetizada à seqüência original, pela DNA-
ligase. 
 
5. Reparação de bases mal pareadas/ pareamento incorreto: 
Algumas bases incorretamente pareadas conseguem escapar da revisão realizada pela DNA-
polimerase durante o processo de replicação. Por isso, na E. coli, a etapa final que confere precisão 
ao processo de replicação é de responsabilidade do sistema de correção de erro, que consiste em 
várias proteínas codificadas pelos genes mut. Esse sistema percorre o DNA recentemente sintetizado 
à procura de pares de base mal pareadas e remove os segmentos de fita simples contendo 
nucleotídeos incorretos. Isso permite que a DNA-polimerase insira a base correta na lacuna formada. 
A dificuldade que surge, aparentemente, é a de distinguir qual das bases de um par erroneamente 
formado é a incorreta, porque ambas são componentes naturais do DNA. Se a remoção de uma das 
bases fosse ao acaso, haveria a probabilidade de 50% de a base correta ser removida e a mutação 
poderia ser perpetuada, ao invés de ser corrigida. Existe, porém, um sinal específico que direciona o 
sistema de excisão do erro exclusivamente para a fita recém-sintetizada: o reconhecimento de 
seqüências GATC próximas ao erro. GATC metiladas indicam a fita parental, enquanto que ausência 
de metilação nestas seqüências caracteriza a fita recém-sintetizada. O sistema de correção detecta 
 
 
 
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mecanismos de reparo do DNA 
não somente pares únicos de bases mal pareadas, mas também adições e deleções, o que reduz a 
incidência de mutações por modificação no módulo de leitura, além daquelas envolvendo 
substituição de bases. 
 
6. Reparo sujeito ao erro: 
Existem ocasiões em que o dano no DNA é tão extremo que não há como os mecanismos 
celulares de reparo corrigirem de forma precisa a molécula. Nesses casos, a célula utiliza como 
último recurso o sistema de reparo sujeito a erro, no qual qualquer uma das quatro bases é inserida 
no local lesado, a fim de garantir a continuidade do processo de replicação. Devido ao fato de não 
haver a informação precisa (molde), o próprio mecanismo de reparo acaba sendo o causador de uma 
mutação, pois a chance de introduzir uma base incorreta na cadeia é grande. De qualquer forma, para 
a célula é preferível incorporar uma base incorreta e permitir que a replicação continue, do que não 
replicar mais.