Relatório IC

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Luciano Yves Vale Mendes
Adeilton Pereira Maciel
Análise multivariada aplicada ao estudo do efeito da temperatura e pH na imobilização de lipase tipo VII em biomassa lignocelulósica de coco babaçu
São Luís
2020
RESUMO
O biodiesel é uma fonte de energia limpa obtida a partir de fontes renováveis, como óleos vegetais, e tem papel fundamental no desenvolvimento sustentável promovido mundialmente no século XXI, e a aplicação da biocatalisadores ganha forças nessa conjuntura. Entretanto, com o preço elevado e a dificuldade na recuperação do mesmo, faz-se necessário buscar alternativas de imobilização enzimática. Portanto, neste trabalho realizou-se o estudo, interpretação e otimização das variáveis de processo pH e Temperatura com a atividade hidrolítica como variável de resposta tanto para a enzima livre, como para o derivado imobilizado, analisado através de Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) de segunda ordem, constituído do fatorial completo 22, um ponto central e o complementar axial. Os modelos ANOVA foram utilizados para embasar o método, analisando a nível de 95% de confiabilidade. Então obteve-se equacionamentos empíricos para descrever ambos os sistemas e determinar a superfície de resposta, identificando-se a temperatura de 35°C e pH de 7,2 como condições ótimas para a enzima livre, e encontrando o ponto crítico do tipo sela para o derivado imobilizado nas condições de 36°C e pH 7,4, além de constatar um baixo efeito de interação no mesmo, dando margem para que ambas as variáveis de controle possam ser estudadas independentemente nesse processo de imobilização.
Palavras-chave: Biodiesel. Lipase. Delineamento Composto Central Rotacional.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO......................................................................................................... 3
2 JUSTIFICATIVA...................................................................................................... 4
3 OBJETIVOS............................................................................................................. 5
3.1 Objetivo Geral....................................................................................................... 5
3.2 Objetivos Específicos............................................................................................ 5
4 METODOLOGIA...................................................................................................... 5
4.1 Materiais e Reagentes........................................................................................... 5
4.2 Procedimento Experimental.................................................................................. 6
4.2.1 Extração e Tratamento do Epicarpo de Coco Babaçu............................ 6
4.2.2 Imobilização enzimática e determinação da Atividade Hidrolítica........... 8
4.2.3 Cálculos e Planejamento Experimental................................................... 9
5 RESULTADOS....................................................................................................... 11
5.1 Cálculos dos Parâmetros de Imobilização e Atividade Hidrolítica........................ 11
5.2 Planejamento Fatorial.......................................................................................... 14
5.2.1 Análise de Resíduos............................................................................... 17
5.2.2 Metodologia de Superfície de Resposta................................................ 20
6 ATIVIDADES NÃO EXECUTADAS....................................................................... 21
7 CONLUSÃO........................................................................................................... 22
REFERÊNCIAS........................................................................................................ 24
1	INTRODUÇÃO
Combustíveis alternativos ganham destaque com a redução das reservas de petróleo e disseminação do ecodesenvolvimento, o mesmo sendo formalmente discutido desde 1972, quando a ideia de desenvolvimento sustentável foi proposta durante a Primeira Conferência das Nações Unidas sobre o Meio Ambiente e Desenvolvimento, em Estolcomo, Suécia (DECICINO, 2019). Nesse contexto surge o biodiesel, uma alternativa livre de enxofre e aromáticos (contribuintes para a chuva ácida e câncer, respectivamente) e renovável, além do grande impacto na inclusão social e no desenvolvimento regional na realidade brasileira, pois sua síntese parte dos óleos vegetais, o que contribui para a geração emprego e renda no campo, inclusive, tais diretrizes foram protagonistas do Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel (PNPB), implantado em dezembro de 2004 (BRASIL,2005).
O biodiesel apresenta desvantagens e vantagens em relação aos combustíveis diesel derivados de petróleo. Transportabilidade, alta eficiência de combustão, baixo teor de enxofre e compostos aromáticos, alto número de cetano e biodegradabilidade são vantagens da sua utilização. Enquanto sua alta viscosidade, baixo conteúdo de energia, alta emissão de óxido de nitrogênio, baixa velocidade e poder de motor, alto preço e alta corrosão surgem como expressivas desvantagens (YUCEL et al., 2012).
A ênfase mundial no desenvolvimento do biodiesel abriu espaço para a manifestação de novas tecnologias, dentre estas as enzimas, as quais são proteínas (em grande parte, há raros casos de reações catalisadas por RNA) altamente especializadas de grande poder catalítico, muitas vezes superior a catalisadores inorgânicos ou sintéticos, estas apresentam alta especificidade com seu substrato, além de grande sensibilidade a variações no pH e temperatura, que impactam no seu efeito sobre a velocidade da reação (LEHNINGER, 2014), sabendo-se que a reação ocorre por transesterificação, pode-se escolher o catalisador biológico ideal para acelerar a etapa de quebra dos ésteres carboxílicos e facilitar a entrada do grupo alcoólico na composição final dos ésteres derivados de ácidos graxos (BATISTA et al., 2013), sendo assim as lipases compatíveis com o processo.
Entretanto, se uma enzima é desnaturada (perda do arranjo tridimensional da sua cadeia de peptídeos) ou dissociada em suas subunidades, a sua atividade catalítica é perdida, frequentemente permanentemente (LEHNINGER, 2014), requerendo maiores cuidados em seu manuseio no processo reacional. Em vista dessas complicações faz-se necessário uma avaliação meticulosa dos parâmetros de processo e seus impactos no biocatalizador, aparando esta necessidade surgem métodos de avaliação da atividade enzimática, em conjunto de técnicas estatísticas para otimizá-la. O planejamento fatorial é uma técnica estatística que permite a análise de um sistema em relação às alterações nas variáveis controláveis (fatores), através da obtenção de diferentes valores (níveis) pré-estipulados para tais fatores (MONTGOMERY, 2013), habilitando assim a possibilidade de obter o máximo de informação útil ao pesquisador com o número mínimo de experimentos (BOX et. all, 1978), característica particularmente benéfica à pesquisas com enzimas, pois consistem em um material caro em que necessita-se a prevenção do desperdício.
2	JUSTIFICATIVA
	Biodiesel é uma fonte de energia limpa capaz de fortalecer a economia regional, gerando emprego e renda para comunidades extrativistas rurais, de acordo com o último censo agropecuário brasileiro, 175 mil famílias maranhenses cultivavam roças tradicionais, e dentre essas 40 mil era dedicadas ao babaçu (IBGE, 2006), atividade essa que também contribui para a preservação de vastar áreas naturais de florestas no Brasil e no mundo (SIMONI, 2010), pois contrasta com o modelo produtivo agroexportador, que tende a aplicar o cultivo de monocultura, substituindo a vegetação nativa, e negligenciar a integralização da comunidade local às suas metodologias capitalizadas (MENDES, 2013). 
	As lipases (triacilglicerol acil-hidrolasesEC3.1.1.3) na reação de transesterificação são capazes de promover altas taxas de rendimento com grande conteúdo de óleo, não é afetada pelo teor de água presente no óleo, produz glicerina de alta pureza, e de simples recuperação, baixo gasto de energia, pois o processo acontece à temperaturas medianas, baixo impacto ambiental, pois as águas residuais são descarregadas de contaminantes, enquanto a catálise alcalina enfrentaria a formação de sabão com o aumento de teor de água, uma glicerina com recuperação complexa e de baixa pureza, auto gasto de energia, pois os processos acontecem à temperaturas na faixa de 60 a 80°C, auto impacto ambiental, pois efluentes alcalinos e salinos são produzidos (BATISTA et al., 2013). Justifica-se assim a escolha pela lipase, porém, duas grandes problemáticas emergem, o custo elevado do biocatalisador e sua baixa taxa de recuperação e reuso, obstáculos esses de baixa relevância para o método alcalino, pois ainda que esse não apresente recuperação de catalisador prática, o seu baixo custo não inviabiliza sua constante substituição no processo. Assim faz-se necessário a imobilização da enzima em uma matriz, neste caso o epicarpo de babaçu, para que essa possa ser reutilizada. Entretanto, faz-se necessário embasamento estatístico para avaliar a eficiência da imobilização na matriz escolhida com sua respectiva metodologia, assim como identificar as novas condições ótimas da enzima, agora imobilizada, para obter tal levantamento de dados e ampliar a compreensão do sistema, com o menor número de ensaios experimentais viável, aplica-se o planejamento fatorial.
3	OBJETIVOS
3.1	OBEJTIVO GERAL
	Estudar e otimizar as condições reacionais da imobilização da enzima lipase tipo VII de Cândida Rugosa em matriz de epicarpo de babaçu tratada por método oxidativo com peróxido de hidrogênio, em escala laboratorial, aplicando o Delineamento Composto Centro Rotacional (DCCR) como técnica de planejamento fatorial.
3.1	OBJETIVOS ESPECÍFICOS
· Extrair o epicarpo do babaçu da matéria prima coco;
· Caracterizar através da espectroscopia de infravermelho os efeitos de diversos tratamentos químicos na retirada de lignina da matriz de epicarpo de babaçu;
· Imobilizar a enzima na matriz lignocelulósica utilizando-se adsorção física;
· Otimizar o processo de imobilização através da análise de duas variáveis de controle, temperatura e pH, e seus efeitos na atividade enzimática quantificada pelo método de Soares;
4	METODOLOGIA
4.1 Materiais e Reagentes
	Na extração do epicarpo do coco babaçu foram utilizados coco babaçu in natura; prensa hidráulica 10 Toneladas P 10000 com Manômetro BOVENAU; Prensa Mecânica Manual; Forrageira da Marca Trapp (TRF 400 super); Moinho FRITSCH – Pulverisette 14. Na etapa de tratamento e caracterização da fibra utilizaram-se peróxido de hidrogênio (30% (V/V) – ISOFAR); Hidróxido de Sódio (P.A. (Micro pérolas) – ISOFAR); Álcool Etílico Absoluto (P.A. – ISOFAR); Banho-maria analógico – Inox – Modelo SP-02/2001ª (SP Labor: equipamentos para laboratório); Agitador IKA – RW20 digital; Espectrômetro de infravermelho com transformada de Fourier modelo IRPrestige-21-SHIMADZU.
	Na imobilização enzimática e determinação da atividade hidrolítica utilizaram-se Lipase tipo VII (obtida de cândida rugosa em pó com atividade ≥ 700 U/mg - SIGMA ALDRICH); Hidróxido de Sódio (P.A. (Micro pérolas) – ISOFAR); Azeite de Oliva clássico extravirgem (GALLO); Goma Arábica em Pó (Puríssima –ISOFAR); Fosfato de Potássio Monobásico (P.A. Anidro – VETEC); Álcool Etílico (Absoluto P.A. – ISOFAR); Acetona (MERCK); Fenolftaleína 1%; Agitador IKA – RW20 digital; Banho-maria analógico FANEM – Modelo 100; Incubadora made in home; tubos cônicos tipo Falcon.
	Materiais comuns aos procedimentos foram a estufa para a secagem com circulação mecânica de ar – linha 520 (FANEM) com controlador de temperatura analógico modelo A-HT e balança analítica SHIMADZU modelo AUW220D.
4.2 Procedimento Experimental
4.2.1	Extração e tratamento do epicarpo de coco babaçu
	Na separação do epicarpo da matéria prima do coco de babaçu antes de tudo realizou-se a raspagem da matéria orgânica, inicialmente com facas de cozinha, ou outros objetos laminares, até otimizar-se o procedimento com a utilização de uma esmerilhadeira, reduzindo a carga de trabalho manual, então utilizou-se uma prensa hidráulica para quebrar a casca, e a prensa mecânica manual ou um martelo para corrigir falhas indesejadas no primeiro momento de fratura. A separação do epicarpo das demais partes do coco; endocarpo, mesocarpo e amêndoas, foi feita manualmente e então triturada na forrageira, utilizando uma malha de 8 mm que foi previamente lixada, evitando a contaminação por ferrugem, o triturado foi então pulverizado no moinho elétrico. Por fim, realizou-se uma etapa de lavagem onde o pó foi deixado em descanso em água destilada, esperou-se até que decantasse e então descartou-se o sobrenadante, repetiu-se o procedimento até que a água permanecesse translúcida, após isso foi filtrada e levada à estufa à 60°C. 	Figura 1: Coco Babaçu antes e depois da raspagem;
Figura 2: Coco babaçu segmentado com amêndoas, o epicarpo é a camada mais externa;
Na etapa de tratamento da fibra utilizaram-se dois métodos bibliograficamente estabelecidos, e uma tentativa experimental complementar. Para o método de extração alcalina utilizou-se 2 g de resíduo seco e moído, então foram tratadas com 100 mL de solução de NaOH (1,0 mol/L) a temperatura de 55ºC sob 540 RPM por 1 hora. Então, a amostra foi neutralizada para pH 7 através da adição de ácido acético, filtrada e levada à estufa à 60°C para análise posterior. 
O método organosolv foi realizado pesando-se em cartucho de extração 1 g da amostra tratada por extração alcalina, o qual depois foi inserido no tubo de extração Soxhlet. Utilizaram-se 200 mL de etanol como solvente no balão, e com o auxílio de um termômetro controlou-se a temperatura para que permanecesse na faixa de 55 a 60°C, 8 sifonações foram realizadas e então o sólido foi lavado com 100 mL de Etanol no sistema de filtração à vácuo.
No tratamento oxidativo foi preparada uma solução de 100 mL com 0,05 g de NaOH e 18 mL de Peróxido de Hidrogênio 30%. Em seguida adicionou-se 2 g de epicarpo moído à 4 mL da solução de peróxido, deixando sob agitação por 2 horas em banho-maria à uma temperatura de 85°C, e o restante da solução com hidróxido era lentamente adicionada à medida que o nível de líquido no béquer diminuía. Posteriormente, lavou-se com 200 mL de água quente (90°C a 100°C) e depois com 1 litro de água fria (25ºC) e então é levado à secagem em temperatura constante de 60°C na estufa. 
Um terceiro procedimento foi realizado para avaliar a eficiência da junção da extração alcalina com o tratamento oxidativo, sendo realizados nesta ordem respectiva e nas mesmas condições descritas anteriormente. Então alíquotas de cada tratamento realizado foram analisados no FTIR, por fim optando por utilizar-se somente o tratamento oxidativo nos ensaios que se seguem.
Figura 3: Sistema para extração Soxhlet;
Figura 4: Aparelhagem utilizada na extração alcalina e tratamento oxidativo;
4.2.2 Imobilização enzimática e determinação da Atividade Hidrolítica
	A imobilização da enzima foi realizada numa incubadora shaker improvisada, tendo em vista que devido à pandemia tal equipamento não pôde ser disponibilização por outros laboratórios, esta foi construída através da junção de um banho-maria com um agitador vortex, que transmite o movimento oscilatório para uma estante de tubos de ensaio plástico. No processo de imobilização adicionou-se 0,1 g de epicarpo tratado à 2 mL de solução enzimática com concentração 0,1 M, e 4,9mL de tampão fosfato de potássio monobásico 1,0 M à um tubo tipo falcon agitado à aproximadamente 120 RPM por 30 min , com o pH do tampão e temperatura de incubação definidos pelos pares correspondentes ao planejamento fatorial (apresentados na tabela 1). 
Figura 5: Eixo responsável por transmitir a agitação;
Figura 6: Incubadora made in home;
4.3Cálculos e Planejamento Experimental
	A atividade hidrolítica da enzima livre e de seu derivado foram determinadas pelo método de Soares com algumas adaptações (FERREIRA, 2019), 2,5 mL de substrato, uma emulsão de azeite de oliva (marca GALLO, adquirido em supermercado local) e solução de goma arábica 7% (m/v) numa proporção 1:2 (v/v), e 4,9 mL de tampão fosfato de potássio monobásico 1,0 M, para a enzima livre 0,1 mL da solução enzimática 0,1 M, ou para o derivado imobilizado, 0,1 g, foram adicionados ao sistema reacional, que foi mantido sob agitação de aproximadamente 150 rpm por um período de 5 min. Ao término da reação, a atuação da enzima foi paralisada pela adição de 5 mL de uma solução de acetona e etanol 1:2 (v/v), e a mistura titulada com uma solução de NaOH 0,025 M, utilizando fenolftaleína 1% como indicador, contra um branco contendo solução tampão no lugar da enzima livre ou a matriz de imobilização no lugar do derivado imobilizado. De acordo com o volume gasto na titulação do branco e da amostra, é possível determinar a atividade enzimática pela equação abaixo, considerando que 1 unidade de atividade enzimática (U) é definida como a quantidade de enzima capaz de catalisar a produção de 1 μmol de ácido graxo livre por minuto nas condições experimentais estabelecidas.
	 é o volume da solução de NaOH gasto na titulação da amostra (mL), é o volume gasto na titulação do branco (mL), é a concentração molar do hidróxido de sódio utilizado na titulação (nesse caso 0,025 M) em molar, é o tempo da reação (min), e são respectivamente o volume de enzima livre e massa de derivado imobilizado utilizados (mL e mg), inicialmente realizaram-se os ensaios fixando pH 7 e variando a temperatura de 30 a 55ºC em intervalos de 5ºC.
	Então foram calculados o rendimento de imobilização (TEREZA et al., 2017), atividade hidrolítica teórica e atividade recuperada (CARNEIRO, 2007) através das seguintes fórmulas:
	Onde é a atividade hidrolítica do derivado imobilizado, é a atividade hidrolítica da enzima livre, é a atividade hidrolítica do sobrenadante após a reação do imobilizado com o substrato, e é a atividade teórica calculada. 
	A atividade hidrolítica do derivado imobilizado foi escolhida como variável de resposta, enquanto pH e temperatura foram as variáveis independentes analisadas, tendo seus níveis escolhidos através de um levantamento de literatura, dentre estes os trabalhos de PAULA (2008), SOARES (1999), ZAHRA (2012) e GOMES (2006). A concentração e agitação mantiveram-se constantes, constituindo assim um planejamento composto central rotacional (DCCR) 22, contendo 1 ponto central e 4 axiais, resultando no planejamento experimental abaixo, com cada ponto em triplicata, totalizando ao todo 27 ensaios, gerando as superfícies de resposta e outras ferramentas estatísticas no software Statistica for Windows 6.0.
Tabela 1: Planejamento fatorial 22 para a imobilização enzimática
	Variáveis
	Nível 
(-1,41)
	Nível 
(-1)
	Nível 
(0)
	Nível (+1)
	Nível 
(+1,41)
	
	
	
	
	
	
	Temperatura (°C)
	27,92
	30
	35
	40
	42,07
	pH
	5,59
	6
	7
	8
	8,41
5	RESULTADOS
5.1 Cálculos dos Parâmetros de Imobilização e Atividade Hidrolítica
Os valores associados à temperatura de 55°C foram omitidos ou considerados zero em todos os gráficos, ainda que tenham sido medidos, pois esse ponto constantemente apresenta um volume gasto de NaOH na titulação inferior à do branco, apresentando assim valores negativos de atividade hidrolítica calculada. Representa assim um forte indício que não há mais ação da enzima no meio, tendo sido totalmente desnaturada, para confirmar tal suposição foi realizado um teste de normalidade, o qual supõe que os volumes gastos no branco e no derivado imobilizado não pertencem a uma mesma distribuição amostral normal, logo haveria diferenças significativas entre si. Sabendo as limitações laborais do método de Soares realizou-se um número modesto de experimentos, 10 ao todo, realizando ensaios aleatórios na condição fixada de 55ºC e pH 7, assim podendo realizar o teste Saphiro-Wilk, que é ideal para um número de amostras inferior a 50 unidades.Figura 7: Teste Saphiro-Wilk para as condições de 55°C e pH 7
	
O valor de p (0,98780) é superior a um alfa de 0,05, logo a hipótese nula de que está é uma distribuição normal não é rejeitada, condizente com nossa suposição inicial.
	Os ensaios realizados com pH 7 fixado com a temperatura variando em 5°C na faixa de 30 a 50°C obtiveram como resultados:Figura 8: Rendimento de Imobilização;
	Torna-se claro a baixa precisão do método de titulação ácido-base realizado manualmente, pois os intervalos de confiança (95%) ficaram especialmente espessos, o que dificulta a conclusão de que há diferenças significativas entre as médias observadas. Entretanto, assumindo a validade destas, e sabendo que apresentam um perfil de crescimento consistente, pode observar-se que temperaturas mais baixas favoreceram o rendimento de imobilização, porém não necessariamente apresentam valores mais elevados de atividade hidrolítica do imobilizado, esse apenas confere que a atividade hidrolítica resgatada em relação à original, pertencente à enzima livre, foi maior. Porém, confirma-se pelo comparativo da atividade hidrolítica do derivado com a da enzima livre, pois observa-se que o maior valor de atividade hidrolítica corresponde à temperatura de 30°C para o imobilizado, ainda que para a enzima livre a temperatura de maior atividade seja a de 40°C.
Figura 9: Comparativo da atividade relativa da Enzima Livre com o Derivado Imobilizado;
	A atividade recuperada seguiu a mesma tendência, fornecendo indícios que se no planejamento fatorial não for descoberto um forte efeito de interação, então temperaturas mais baixas serão o caminho a seguir no processo de imobilização.Figura 10: Atividade Recuperada
Tabela 2: Desvios Padrões Médios e Coeficientes de variações para as grandezas calculadas;
	
	Rendimento de Imobilização
	Atividade Relativa da Enzima Livre
	Atividade Relativa do Derivado Imobilizado
	Atividade Recuperada
	Desvio Padrão Médio
	11,02
	5,28
	17,14
	4,04
	Coeficiente de variação (%)
	23,46
	10,20
	29,18
	28,13
Desvios relativos (coeficiente de variação) mais significativos foram observados no cálculo de atividade recuperada.
5.2 	Planejamento Fatorial
	
	A Matriz de planejamento fatorial para a atividade hidrolítica do derivado imobilizado e da enzima livre foi o fatorial 22 com ponto central 7 respectivamente e planejamento em estrela, com todos os pontos em triplicata. Obtendo as seguintes matrizes de planejamento fatorial, onde x1 corresponde à temperatura, x2 ao pH e At1, At2 e At3 a cada uma das replicatas sob a atividade hidrolítica.
	
Tabela 3: Matriz de planejamento fatorial 22 para a imobilização da lipase;
	DERIVADO IMOBILIZADO
	Variáveis de Controle
	Variável Dependente (Atividade Hidrolítica (U/mg)
	Ordem
	Variáveis Codificadas
	Variáveis Independentes
	At1
	At2
	At3
	
	x1
	x2
	x1
	x2
	
	1
	-1
	-1
	30
	6
	30
	30
	80
	2
	-1
	1
	30
	8
	5
	25
	15
	3
	1
	-1
	40
	6
	45
	50
	45
	4
	1
	1
	40
	8
	20
	35
	55
	5
	-1,41
	0
	27,93
	7
	20
	10
	15
	6
	1,41
	0
	42,07
	7
	15
	15
	10
	7
	0
	-1,41
	35
	5,59
	70
	55
	40
	8
	0
	1,41
	35
	8,41
	40
	50
	45
	9
	0
	0
	35
	7
	45
	40
	25
	
Tabela 4: Matriz de planejamento fatorial 22 para a enzima livre;
	ENZIMA LIVRE
	Variáveis de Controle
	Variável Dependente (Atividade Hidrolítica (U/mL)
	Ordem
	Variáveis Codificadas
	Variáveis Independentes
	At1
	At2
	At3
	
	x1
	x2
	x1
	x2
	
	1
	-1
	-1
	30
	6
	30
	50
	50
	2
	-1
	1
	30
	8
	120
	110
	130
	3
	1
	-1
	40
	6
	165
	125
	200
	4
	1
	1
	40
	8
	100
	90
	80
	5
	-1,41
	0
	27,93
	7
	140
	145
	115
	6
	1,41
	0
	42,07
	7
	75
	85
	80
	7
	0
	-1,41
	35
	5,59
	150
	100
	90
	8
	0
	1,41
	35
	8,41
	210
	215
	250
	9
	0
	0
	35
	7
	285
	325
	255
	Efeitos são definidos como a mudança provocada na variável de resposta quando se move do limite inferior (-) para o limite superior (+), e podem ser classificados em duas categorias: efeitos principais e efeitos de interação(RODRIGUES e IEMMA, 2005). Os efeitos estimados são exibidos abaixo.
Tabela 5: Efeitos e interações calculados para a variável de resposta da enzima livre;
	ENZIMA LIVRE
	Fatores
	Efeito
	Erro Puro
	t (21) *
	p
	Média
	288,333
	23,76845
	12,13093
	0,000000
	Efeitos Principais
	
	
	
	
	Temperatura (L)
	3,644
	16,80683
	0,21681
	0,830452
	Temperatura (Q)
	-198,542
	27,87097
	-7,12360
	0,000001
	pH (L)
	40,313
	16,80683
	2,39864
	0,025823
	pH (Q)
	-136,042
	27,87097
	-4,88112
	0,000079
	Efeitos de interação
	
	
	
	
	1Lby2L
	-75,000
	23,76845
	-3,15544
	0,004771
Tabela 6: Efeitos e interações calculados para a variável de resposta da imobilização enzimática;
	DERIVADO IMOBILIZADO
	Fatores
	Efeito
	Erro Puro
	t (21) *
	p
	Média
	36,6667
	7,855871
	4,66742
	0,000132
	Efeitos Principais
	
	
	
	
	Temperatura (L)
	4,8274
	5,554940
	0,86903
	0,394655
	Temperatura (Q)
	-20,4167
	9,211825
	-2,21635
	0,037843
	pH (L)
	-13,9522
	5,554940
	-2,51167
	0,020260
	pH (Q)
	15,4167
	9,211825
	1,67357
	0,109046
	Efeitos de interação
	
	
	
	
	1Lby2L
	10,8333333
	7,85587087
	1,37901113
	0,182403261
	Para que os efeitos calculados sejam estatisticamente significativos é necessário que o valor de p correspondente seja menor do que 0,05, ao nível de significância de 95%. Portanto, na tabela 5 apenas o coeficiente linear da temperatura não é estatisticamente significativo, com um enquanto na tabela 6, o termo quadrático da temperatura e o linear do pH foram estatisticamente significativos. Os efeitos padronizados para um grau de liberdade igual a 21 ( t(21) ) são utilizados para representar a magnitude de cada efeito no gráfico de Pareto (figuras 11 e 12), onde uma linha correspondente ao valor de p=0,05 indica o quão grande o efeito deve ser para que possa ser considerado significativo. Percebe-se que nessa faixa de temperatura apenas o termo linear do pH influencia positivamente na variável de resposta da enzima livre, enquanto a temperatura (Q), pH (Q), e o efeito de interação, ainda que estatisticamente significativos, influenciam negativamente na atividade hidrolítica. Para o derivado imobilizado, apenas o pH (L) e temperatura (Q) foram significativos, porém ambos com efeito negativo.
Figura 12: Gráfico de Pareto da Enzima Livre;
Figura 11: Gráfico de Pareto do Derivado Imobilizado;
	
5.2.1	Análise de Resíduos
	Depois de obtido os resultados é fundamental averiguar a adequação do modelo proposto, e em designs de experimentos aleatórios a análise residual é a maior ferramenta para diagnosticar falhas e instigar a busca de ajustes, etapas fundamentais para o processo de otimização (MONTGOMERY, 2013). Um modelo que deixa resíduos consideráveis é obviamente um modelo ruim, entretanto, não significa que é descartável, pois uma grande vantagem do planejamento fatorial é a adição de novos pontos centrais em busca da adequação de regressões inconsistentes. 
Tabela 7: Coeficientes de regressão da Enzima Livre;
	ENZIMA LIVRE
	Fatores
	Coeficientes de Regressão
	Erro Puro
	t (21) *
	p
	Média
	-9900,30882
	1348,0345
	-7,34425476
	0,0000003
	Efeitos Principais
	
	
	
	
	Temperatura (L)
	330,822715
	42,4518023
	7,79290153
	0,0000001
	Temperatura (Q)
	-3,97083333
	0,557419473
	-7,12359995
	0,0000005
	pH (L)
	1234,9484
	212,259012
	5,81811998
	0,0000089
	pH (Q)
	-68,0208333
	13,9354868
	-4,88112358
	0,0000794
	Efeitos de interação
	
	
	
	
	1Lby2L
	-7,5
	2,37684462
	-3,15544396
	0,0047715
Tabela 8: Coeficientes de Regressão do Derivado Imobilizado;
	DERIVADO IMOBILISADO
	Fatores
	Coeficientes de Regressão
	Erro Puro
	t (21) *
	p
	Média
	211,520097
	445,548055
	0,474741376
	0,6398711
	Efeitos Principais
	
	
	
	
	Temperatura (L)
	21,4827411
	14,031034
	1,53108752
	0,1406739
	Temperatura (Q)
	-0,408333333
	0,184236503
	-2,21635413
	0,0378430
	pH (L)
	-152,809434
	70,1551701
	-2,17816354
	0,0409349
	pH (Q)
	7,70833333
	4,60591257
	1,67357353
	0,1090462
	Efeitos de interação
	
	
	
	
	1Lby2L
	1,083
	0,7856
	1,37901
	0,182403
	
	Observa-se que todos os valores da enzima livre foram significantes (p ≤ 0,05), enquanto para o derivado imobilizado apenas o termo linear do pH e o termo quadrático da temperatura rejeitaram a hipótese nula. Os testes de significância são baseados em modelos ANOVA (Análise de Variância) e para isso fazem uso de parâmetros estatísticos como a média e soma dos quadrados dos desvios, soma quadrática residual, entre outros. Logo, para avaliar o modelo faz-se uso dos dados tabelados abaixo.
Tabela 9: Análise de variância para a Enzima Livre;
	ENZIMA LIVRE
	Fatores
	Soma Quadrática
	Grau de Liberdade
	Média Quadrática
	F
	p
	Efeitos Principais
	
	
	
	
	Temperatura (L)
	79,66
	1
	79,66
	0,047
	0,830452
	Temperatura (Q)
	86004,64
	1
	86004,64
	50,75
	0,000001
	pH (L)
	9751,1
	1
	9751,05
	5,75
	0,025823
	pH (Q)
	40379,6
	1
	40379,64
	23,83
	0,000079
	Efeitos de interação
	
	
	
	
	1Lby2L
	16875,0
	1
	16875,00
	9,96
	0,004771
	Erro Puro
	9533,3
	18
	529,63
	
	
	Falta de Ajuste (FA)
	26057,8
	3
	8685,94
	16,40
	0,000022
	R2
	0,76
	
	
	
	
Tabela 10: Análise de variância para o Derivado Imobilizado;
	DERIVADO IMOBILIZADO
	Fatores
	Soma Quadrática
	Grau de Liberdade
	Média Quadrática
	F
	p
	Efeitos Principais
	
	
	
	
	Temperatura (L)
	139,823
	1
	139,823
	0,7552
	0,3947
	Temperatura (Q)
	909,470
	1
	909,470
	4,9122
	0,0378
	pH (L)
	1167,983
	1
	1167,983
	6,3085
	0,0203
	pH (Q)
	518,561
	1
	518,561
	2,8009
	0,1090
	Efeitos de interação
	
	
	
	
	1Lby2L
	352,083
	1
	352,083
	1,9016
	0,1824
	Falta de Ajuste (FA)
	604,693
	3
	201,564
	1,105
	0,3729
	Erro Puro
	3283,3
	18
	182,407
	
	
	R2
	0,59
	
	
	
	
	Observa-se que o modelo para a enzima livre está mal ajustado, ou seja, a contribuição ao erro por parte do método estatístico é muito maior que a contribuição por parte da variabilidade natural dos dados, expressa pelo erro puro. Logo, faltam termos ou pontos para se chegar a um modelo preditivo ideal, mas o valor do coeficiente de determinação (R2), 76%, embasa a qualidade da regressão, fato que ficará claro com comparação dos valores previstos com os observados. No derivado imobilizado acontece o contrário, o modelo está ajustado, porém uma conclusão quanto à qualidade do métdo é questionável, pois a variabilidade dos dados encontra-se muito elevada, o que se reflete no baixo valor de R2.Figura 13: Valores Previstos x Valores Observados para a Enzima Livre;
Figura 14: Valores Previstos x Valores Observados para o Derivado Imobilizado;
5.2.2	Metodologia de Superfície de Resposta
	O método de Superfície de Resposta (MSR) é uma técnica estatística auxiliar na modelagem e otimização de processos, através dela é possível estipular uma equação empírica responsável pela descrição do sistema. Nesse contexto, para definir as faixas ótimas operacionais trabalharemos com um modelo de segunda ordem, considerando como a atividade hidrolítica, como temperatura e como pH, para a Enzima Livre temos a seguinte função polinomial:
O modelo que rege a atividade hidrolítica do imobilizado:
	
	
	Obtendo assim as seguintes superfícies de respostas:
 Figura 17: Superfície de Resposta para o Imobilizado;
Figura 18: Curva de nível para o Derivado Imobilizado;
Figura 16: Curva de nível para a Enzima Livre;
Figura 16: Curva de nível para a Enzima Livre;
Figura 15: Superfície de Resposta para a Enzima Livre;
	Constata-se que na MSR da enzima livre o ponto crítico é do tipo máximo, com as coordenadas em 35°C e pH 7,2, enquanto no derivado imobilizado o ponto crítico é do tipo ponto de sela, ou minimáx, com ponto crítico nas coordenadas 36°C e pH 7,4. 
6	Atividades não executadas
	Ocorreu grande demora para a chegada Lipase tendo em vista a necessidade de importação do produto, e as dificuldades logística que surgiram com a pandemia, e nesse mesmo contexto o laboratório responsável, NCCA, ficou inativo por um intervalo de tempo, buscando atender às recomendações de saúde internacionais. Passado essa etapa, iniciou-se om o retorno responsável cumprindo-se as diretrizes para ocompartilhamento do laboratório a fim de evitar aglomerações e com o uso obrigatório de máscara e fornecimento de álcool-gel, ressalva-se também que antes do início das atividades o laboratório precisou passar por uma etapa de limpeza, e na ausência muitos componentes do laboratório apresentaram problemas por consequência de falhas elétricas e precisaram de ajuste. Entretanto, esse retorno às atividades não foi uma iniciativa compartilhada entre todos os centros de pesquisa, e as próprias prevenções associadas ao contato social inviabilizaram a colaboração com outros laboratórios, sendo necessário descartar algumas metodologias de mais fácil execução, e improvisar uma incubadora made in home. Além disso, sabendo-se que a matéria-prima de trabalho é um biomaterial, logo sujeito à ação de microrganismos e principalmente à contaminação por fungos, foi necessário retomar as etapas de extração e tratamento do epicarpo de coco babaçu. Com isso em mente fez-se necessário ajustar o cerne do plano de trabalho, que antes seria orientado para a síntese de biodiesel, para a etapa de imobilização enzimática, e com um número reduzido de fatores, pois a metodologia de Soares para a determinação enzimática era a única alternativa viável no momento, e essa tem a atividade laboral como um grande agente limitante, principalmente pela utilização da titulação como método de medição e o grande volume de materiais e vidrarias que devem ser lavados após o termino das atividades.
		
7	Conclusões
	Os resultados de ponto crítico foram extremamente consistentes com a literatura (PAULA (2008), SOARES (1999), ZAHRA (2012) e GOMES (2006)) e instruções do fabricante, comprovando que a incubadora made in home, ainda que improvisada cumpriu com o seu papel para sistemas líquidos, os ensaios para enzima livre foram realizados paralelamente com esse intuito, de observar o quanto este novo sistema experimental é capaz de se adequar aos resultados disponíveis em outras fontes. Dúvidas quanto à eficiência do equipamento surgiram principalmente pela não observação de agitação do tipo vortex, o que resultava na decantação das partículas durante o processo de incubação, o que pode ter sido crucial para os altos valores de erro puro encontrados no derivado imobilizado. Também fica claro pela interpretação das curvas de níveis que a faixa de trabalho da enzima imobilizada em biomassa lignocelulósica de babaçu possivelmente está além da faixa de pH escolhida, e exigiria outros ensaios e tratamentos estatísticos para que pudesse ser estudado à fundo. Observa-se também que as variáveis temperatura e pH poderiam ser estudadas independentes para esse caso de imobilização, pois há baixo efeito de interação.
REFERÊNCIAS
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