POP Western blotting

Prévia do material em texto

1 
 
Prof. Dr. André Quincozes dos Santos - andrequincozes@ufrgs.br 
Profa. Dra. Cristiane Matté - matte@ufrgs.br 
Prof. Dr. Fabrício Figueiró - fabricio.figueiro@ufrgs.br 
 
DETERMINAÇÃO DO IMUNOCONTEÚDO DE PROTEÍNAS POR WESTERN BLOTTING 
Aula 1: Obtenção das amostras, quantificação de proteínas, preparação do gel de poliacrilamida-SDS, 
eletroforese e transferência 
 
1. Introdução 
 
A técnica de Western Blotting é amplamente utilizada para detectar proteínas-alvo em amostras 
biológicas utilizando anticorpos específicos para tais proteínas. Esta técnica envolve primeiramente a 
separação das proteínas presentes na amostra através de eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS- 
PAGE). A polimerização da acrilamida durante a preparação do gel forma poros de tamanho uniforme, os 
quais irão permitir a migração das proteínas com base no tamanho da cadeia polipeptídica. Posteriormente, as 
proteínas são transferidas para uma membrana (de nitrocelulose ou PVDF), onde serão marcadas para análise 
através da incubação com anticorpo(s) para a(s) proteína(s) de interesse. Normalmente, as membranas são 
incubadas com anticorpos contra a proteína de interesse (antígeno) e, em seguida, com um anticorpo 
secundário que liga o anticorpo primário e permite a detecção da proteína de interesse. Através da análise da 
intensidade do sinal quimioluminescente ou fluorescente gerado, a expressão proteica pode ser determinada 
de maneira semi-quantitativa. 
A primeira etapa para a análise de proteínas por Western blotting consiste na preparação adequada da 
amostra, que pode ser sangue, tecidos humanos e de animais, culturas de células ou bactérias, etc. Evitar a 
degradação das proteínas é crucial, por isso as amostras devem ser mantidas no gelo durante sua preparação, 
e frequentemente, são adicionados ao tampão de homogeneização, inibidores de proteases e/ou quelantes 
iônicos como o EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), que impedem a ligação dos cofatores às enzimas 
proteases. 
Após a homogeneização/sonicação dos tecidos e liberação do conteúdo intracelular, a determinação da 
concentração de proteínas totais em cada amostra é necessária para garantir que quantidades iguais de proteínas 
(esse é um controle importante na quantificação da amostra) a partir de diferentes amostras sejam aplicadas no 
gel de eletroforese. Para a quantificação das proteínas, pode-se utilizar, por exemplo, o método de Lowry. Este 
método baseia-se na reação de Biureto, na qual as ligações peptídicas das proteínas reagem com o Cu2+ em 
condições alcalinas para produzir Cu+, que por sua vez promove uma redução do reagente de Folin, causando 
uma mudança na coloração da solução para azul, cuja intensidade pode ser determinada 
mailto:andrequincozes@ufrgs.br
mailto:matte@ufrgs.br
mailto:fabricio.figueiro@ufrgs.br
2 
espectrofotometricamente a 750 nm. A quantidade de proteína na amostra pode ser estimada utilizando uma 
curva padrão com albumina, com concentração conhecida. 
Para que as proteínas presentes na amostra sejam separadas adequadamente no gel pela eletroforese, é 
necessário que sejam desnaturadas. A desnaturação proteica é realizada de três formas diferentes: 1) através 
do detergente aniônico dodecil sulfato de sódio (SDS), que atua como um agente desnaturante quebrando 
ligações de hidrogênio que mantêm as estruturas secundárias e terciárias das proteínas. Além disso, o SDS 
confere carga negativa às proteínas da amostra (igualando as cargas), o que permite que elas sejam separadas 
apenas pelo seu tamanho durante a eletroforese; 2) o agente redutor β-mercaptoetanol rompe as pontes 
dissulfeto presentes nas proteínas; e 3) o aquecimento das amostras a 100 ºC também promove a desnaturação, 
bem como a ligação do SDS e a aderência a carga negativa. 
Na sequência, esta técnica envolve a separação das proteínas presentes na amostra através de 
eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). A eletroforese consiste na migração de proteínas 
carregadas negativamente em uma matriz de gel sob influência de um campo elétrico. Os géis de poliacrilamida 
são compostos de polímeros reticulados de acrilamida, os quais formam uma malha tridimensional que age 
como uma peneira molecular, retardando a migração de proteínas em proporção à sua razão carga-massa. Na 
eletroforese, a força que move as proteínas é o potencial elétrico (E), e a migração de uma proteína em um gel 
durante a eletroforese é uma função do seu tamanho e formato. Comumente, o detergente dodecil sulfato de 
sódio (SDS) é empregado no método eletroforético. Além de auxiliar no desdobramento das proteínas, este 
detergente liga-se a elas e confere uma carga final negativa às proteínas, tornando insignificante a carga 
intrínseca das moléculas. Assim, na presença de SDS, a eletroforese separa proteínas com base na sua massa 
molecular, com os peptídeos menores migrando mais rapidamente pelo gel de poliacrilamida. 
 
Figura 1. Eletroforese 
3 
Diversos sistemas-tampão podem ser utilizados para a eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-
PAGE), sendo o tris-glicina o mais conhecido. À medida que a voltagem é aplicada a um sistema tris- glicina, 
os ânions (e moléculas de amostra carregadas negativamente) migram em direção ao eletrodo positivo (ânodo) 
na câmara inferior. No gel de entrada, as proteínas são comprimidas (empilhadas), e no gel de separação, as 
proteínas com pequeno peso molecular migram mais rápido que proteínas com grande peso molecular. 
Após a separação pela eletroforese, as proteínas são transferidas do gel para uma membrana, onde a 
proteína de interesse será posteriormente detectada. Sob a ação de um campo elétrico, as proteínas carregadas 
negativamente migram em direção ao eletrodo positivo, saindo do gel e depositando-se na membrana. A 
nitrocelulose é um dos materiais mais usados para membranas de transferência, pois possui alta afinidade por 
proteínas e pode ser usada para diversos sistemas de detecção. 
 
 
Figura 2. Sistema de transferência. 
Após as proteínas serem transferidas para a membrana de nitrocelulose, uma etapa de bloqueio deve ser 
realizada para encobrir os sítios da membrana de nitrocelulose onde não tenham proteínas da amostra ligadas, 
a fim de reduzir ligações inespecíficas durante a detecção da proteína de interesse. As soluções de bloqueio 
mais utilizadas contêm leite em pó desnatado, albumina bovina ou caseína, em tampões como TBS ou PBS, 
na presença de detergentes aniônicos como o Tween-20. 
4 
 
Figura 3. Resumo das etapas da técnica de Western Blotting. 
 
 
2. Procedimentos para a obtenção das amostras 
 
 
- Homogeneizar a amostra biológica na proporção 1:10 (p:v) utilizando tampão fosfato de sódio pH 
7,4 (PBS), sempre em gelo. 
- Aliquotar 25 μL da amostra para a dosagem de proteínas. 
- Fazer uma diluição com tampão de amostra 4x, em gelo. 
- Ferver os eppendorfs contendo a amostra (fechados com segurança) por 5 min em água à 100 ºC. 
Retornar ao gelo. A amostra pode ser congelada para uso posterior. 
 
3. Dosagem de proteínas da amostra 
 
3.1 Procedimento de dosagem de proteínas 
Será realizada através do método de Lowry, utilizando uma curva padrão de albumina conforme a 
tabela abaixo: 
5 
 
 
- Após, pipeta-se 100 L do reagente de Lowry (composto por cobre-tartarato-carbonato, SDS, NaOH 
e água) em todos os poços e incuba-se por 10 minutos à temperatura ambiente. 
- Em seguida, adiciona-se 50 L do reagente de Folin (0,33 N) em todos os poços e incuba-se por 30 
minutos à temperatura ambiente. 
- A absorvância é lida em 750 nm. 
 
 
3.2 Cálculo da concentração de proteínas 
 
 
- Calcular o fator de calibração de cada ponto da curva, utilizando a média dos valores de absorbância 
(Abs): 
FCP = Q/Abs 
 
 
- Calcular a média dos fatores de calibração da curva, obtendo o fator de calibração médio (FCM). 
- Calcular a concentração de proteínas total das amostras, seguindo afórmula abaixo: 
Concentração de proteínas (g/L) = (Abs x FCM)/V 
V = volume aplicado de amostra em L 
 
4. Procedimentos para a preparação do gel de poliacrilamida-SDS 
 
- Para dois géis: 
 
 Gel de separação (10%)* Gel de entrada (5%) 
H2O Milli-Q 4 mL 4,1 mL 
Acrilamida 30% 3,3 mL 1 mL 
Tris 1,5 M pH 8,8 2,5 mL - 
Tris 1 M pH 6,8 - 760 μL 
SDS 10% 100 μL 60 μL 
Temed 6 μL 6 μL 
Persulfato de amônio 10% 100 μL 60 μL 
6 
• A concentração do gel pode variar de acordo com o peso molecular da proteína que se quer 
separar. 
 
Concentração do Gel 
de separação % 
Tamanho da proteína 
alvo (kDa) 
15 12-43 
10 16-68 
7,5 36-94 
5 57-212 
 
- Limpar as placas de vidro onde o gel será preparado com álcool e colocar no suporte. 
- Colocar o pente que formará os poços do gel e fazer uma marcação com caneta na placa de vidro mais 
ou menos 1 cm abaixo do final do pente. Remover o pente. 
- Preparar os géis de entrada e separação conforme a tabela acima em dois recipientes distintos. 
Importante: o Temed e o persulfato devem ser adicionados nesta ordem, mas somente na hora de verter 
o gel na placa, para evitar a polimerização. 
- Verter o gel de separação por entre as placas de vidro até passar ligeiramente a marcação realizada 
anteriormente, pois o gel tende a retrair. 
- Cobrir com álcool ou água e deixar polimerizar por no mínimo 30 minutos. 
- Desprezar o álcool/água virando a placa sobre um papel toalha e, cuidadosamente, passar o papel entre 
as placas para secar o álcool. 
- Adicionar o Temed e o persulfato no gel de entrada e vertê-lo por entre as placas até atingir a 
superfície, de modo que ao colocar o pente o gel transborde. 
- Colocar o pente empurrando-o pela lateral e deixar polimerizar por no mínimo 30 min. 
- Os géis podem ser utilizados imediatamente ou guardados na geladeira embalados em filme plástico 
por 1 ou 2 dias, com água na parte inferior para evitar a desidratação. 
 
5. Procedimentos para a eletroforese 
 
- Descongelar as amostras, se tiverem sido congeladas, e homogeneizar no vórtex. 
- Preparar 1 L de tampão de corrida, diluindo 10X o tampão concentrado preparado previamente. 
- Retirar o pente do gel cuidadosamente. 
- Montar a cuba de eletroforese (ver vídeo indicado). 
- Colocar tampão de corrida entre as placas de gel, até transbordar. 
- No primeiro poço do gel, aplicar 5-10 μL do padrão de peso molecular. 
- Nos demais poços, aplicar uma amostra por poço do gel. Calcular o volume de aplicação, 
considerando a massa desejada (30-50 μg usualmente) 
- Completar a cuba de eletroforese com o tampão de corrida. 
- Para correr a eletroforese, ajustar a voltagem para 100 V (20 minutos), e depois para 170 V constantes 
até o corante sair do gel. A migração dura geralmente entre 1 h e 1 h 20 min (cuidar a frente de corrida 
marcada com o azul de bromofenol da amostra). 
7 
- Assim que a fonte for desligada, desmontar a cuba e abrir as placas de vidro, expondo o gel para 
proceder com a transferência imediatamente. 
- Cortar o gel de entrada e descartar essa parte. Colocar o gel de separação em tampão de transferência 
1X e deixar agitando à temperatura ambiente gentilmente por 10 min para equilibrar. 
 
6. Procedimentos para transferência 
 
- Cortar a nitrocelulose 0,5 cm maior que o gel (8 x 5 cm). Marcar com lápis o número da membrana 
no canto superior esquerdo para permitir a identificação e facilitar a orientação das amostras na membrana. 
- Cortar dois pedaços de papel filtro (9 x 6 cm) para cada membrana de nitrocelulose. 
- Mergulhar a nitrocelulose, o papel filtro e as esponjas no tampão de transferência por pelo menos 10 
min para equilibrar. 
- Preparar o sanduíche de transferência no cassete plástico (ver vídeo), tomando o cuidado para retirar 
bolhas a cada etapa: 
1. Colocar o cassete plástico com o lado cinza para baixo, sobre um superfície lisa e limpa. 
2. Colocar uma esponja molhada sobre o cassete cinza. 
3. Colocar um papel filtro molhado sobre a esponja. 
4. Colocar o gel sobre o papel filtro (atenção para a orientação no gel para que a transferência 
para a membrana seja no sentido correto). 
5. Colocar a membrana de nitrocelulose molhada sobre o gel. 
6. Colocar um papel filtro molhado sobre a membrana. Passar um tubo de ensaio sobre o 
sanduíche para eliminar bolhas. 
7. Colocar uma esponja molhada sobre o papel filtro. 
8. Fechar o cassete com firmeza, sem movimentar o sanduíche. 
- Colocar o cassete dentro da cuba de transferência. Colocar o bloco gelado e a barra agitadora na cuba. 
Colocar a cuba sobre um agitador, o que garante a manutenção da temperatura. 
- Encher a cuba com tampão de transferência 1X até a marca indicada. 
- Ajustar a amperagem da fonte para 300 mA. Geralmente, 1 h é um tempo adequado para a 
transferência, mas os parâmetros de tempo e amperagem podem variar dependendo da proteína de interesse. 
- Depois de transcorrido o tempo de transferência, desligar a fonte, abrir o aparelho e retirar 
cuidadosamente a membrana de nitrocelulose. 
- Lavar a membrana com água tipo 2. 
- Corar a membrana com Ponceau por alguns minutos, para verificar se as proteínas foram transferidas 
do gel para a membrana. 
- Lavar a membrana de três a seis vezes com água destilada até o desaparecimento das bandas. 
 
 
7. Procedimentos para bloqueio 
8 
- Bloquear a membrana por imersão em TBSTM 5% sob agitação suave por 2 h à temperatura ambiente 
ou overnight à 4 °C. A membrana bloqueada pode ser armazenada em geladeira para uso em alguns dias. 
 
8. Vídeos de apoio 
- Vídeos sobre a teoria e prática 
https://www.youtube.com/watch?v=46NnUeewmbM (português) 
https://www.youtube.com/watch?v=4BE0CWdfxw0 (inglês) 
https://www.youtube.com/watch?v=CEEekahiqMo (inglês) 
 
- Western blot – animações (inglês) 
https://www.youtube.com/watch?v=GJJGNOdhP8w 
https://www.youtube.com/watch?v=JcN0EkcHrKk 
https://www.youtube.com/watch?v=IoVzpL_heFo&t=194s 
 
- Fazendo o gel (inglês) 
https://www.youtube.com/watch?v=EDi_n_0NiF4 
- Eletroforese (inglês) 
https://www.youtube.com/watch?v=XnEdmk1Sqvg&t=247s 
- Transferência úmida (inglês) 
https://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ6dBOfs 
 
 
9. Reagentes 
 
9.1 Tampão de amostra 4x 
2,5 mL de Tris-HCl 1 M pH 6,8 
0,5 mL de água tipo 2 
1,0 g de SDS 
0,8 mL de Bromofenol azul 0,1% 
4 mL de glicerol 100% 
2 mL β-mercaptoetanol (100% stock) 14,3 M 
Ajustar o volume final para 10 mL com água tipo 2. 
 
9.2 Tris 1 M pH 6,8 
6 g de Trizma base 
50 mL de água tipo 2 q.s.p. 
Ajustar o pH com HCl 6M (considerar esse volume para o volume final) 
 
9.3 Tris 1,5 M pH 8,8 
9 g de Trizma base 
50 mL de água tipo 2 q.s.p. 
Ajustar o pH com HCl 6M (considerar esse volume para o volume final) 
 
9.4 Persulfato de amônio 10% 
0,1 g de persulfato de amônio 
1 mL de água tipo 2 
Estocar em freezer, coberto com papel alumínio. 
 
9.5 Tampão de corrida Tris-glicina 10X 
6 g de Trizma base 
28,8 g de glicina 
200 mL de água tipo 2 q.s.p. 
Não é necessário ajustar o pH 
http://www.youtube.com/watch?v=46NnUeewmbM
http://www.youtube.com/watch?v=4BE0CWdfxw0(inglês)
http://www.youtube.com/watch?v=CEEekahiqMo(inglês)
http://www.youtube.com/watch?v=GJJGNOdhP8w
http://www.youtube.com/watch?v=JcN0EkcHrKk
http://www.youtube.com/watch?v=JcN0EkcHrKk
http://www.youtube.com/watch?v=IoVzpL_heFo&t=194s
http://www.youtube.com/watch?v=EDi_n_0NiF4
http://www.youtube.com/watch?v=EDi_n_0NiF4
http://www.youtube.com/watch?v=XnEdmk1Sqvg&t=247s
http://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ6dBOfs
9 
9.6 Tampão de corrida Tris-glicina 1X 
200 mL do tampão de corrida 10X 
20 mL de SDS 10% 
2 L de água tipo 2 q.s.p. 
Não é necessário ajustar o pH 
 
9.7 Tampão de blotting/transferência 10X 
7,6 g de Tris HCl 
21,35 g de glicina 
250 mL de água tipo 2 q.s.p. 
Não é necessário ajustar o pH 
Estocar à 4 ºC. 
 
9.8 Tampão de blotting/transferência 1X 
125 mL de Tampão de blotting 10x 
125 mL de etanol absoluto 
1 L de água tipo 2 
Estocarà 4 ºC. Pode ser reutilizado 5x. 
 
9.9 Ponceau S 
0,5 g de Ponceau S 
5 mL de ácido acético 
500 mL de água tipo 2 q.s.p. 
 
9.10 TBS 10X pH 7,4 
16 g de NaCl 
0,4 g de KCl 
6 g de Trizma base 
200 mL de água tipo 2 q.s.p. 
Ajustar o pH em 7,4 utlizando HCl 
 
9.11 TBST 1X 
100 mL de TBS 10X 
2 mL de Tween 20 
1 L de água tipo 2 q.s.p. 
 
9.12 TBSTM 5% 
5 g de leite desnatado em pó 
100 mL de TBST 
Agitar e manter à 4 °C por até 2 dias. 
 
10 Referências bibliográficas 
 
NELSON, D. L.; COX, M. M. - Lehninger - Princípios de Bioquímica. - Editora Grupo a. 
10 
 
Prof. Dr. André Quincozes dos Santos - andrequincozes@ufrgs.br 
Profa. Dra. Cristiane Matté - matte@ufrgs.br 
Prof. Dr. Fabrício Figueiró - fabricio.figueiro@ufrgs.br 
 
RELATÓRIO N0 6 
 
Nome: Sofia Golbspan Cattaneo No. Cartão: 308146 Data: 24/03/2020 
 
DETERMINAÇÃO DO IMUNOCONTEÚDO DE PROTEÍNAS POR WESTERN BLOTTING 
Aula 1: Obtenção das amostras, quantificação de proteínas e preparação do gel de poliacrilamida-SDS 
 
 
1. OBJETIVOS DA AULA: 
Identificação e detecção de proteína BDNF através de eletroforese em gel e reação com anticorpo específico, 
fator neurotrófico derivado do encéfalo em hipocampo de ratos tratados com fluoxetina. 
 
2. TAREFAS: 
a. Explique por que a concentração do gel pode variar. 
 
A concentração do gel está relacionada ao tamanho dos espaços na malha pelos polímeros de poliacrilamida, um 
gel mais concentrado vai possuir uma malha que terá mais resistência na passagem das proteínas,já concentrações 
menores tem menor resistência, permitindo a passagem de proteínas maiores. Pode-se concluir que a 
concentração varia conforme o tamanho e peso molecular da proteína que se deseja identificar. 
 
 
 
b. Explique as etapas da eletroforese. 
Segundo o relatório de determinaçao as etapas para a eletroforense : 
✓ Descongelar as amostras, se tiverem sido congeladas, e homogeneizar no vórtex 
✓ Preparar 1 L de tampão de corrida, diluindo 10X o tampão concentrado preparado previamente. 
✓ Retirar o pente do gel cuidadosamente. 
✓ Montar a cuba de eletroforese(ver vídeo indicado). 
✓ Colocar tampão de corrida entre as placas de gel, até transbordar. 
✓ No primeiro poço do gel, aplicar 5-10 μL do padrão de peso molecular. 
✓ Nos demais poços, aplicar uma amostra por poço do gel. 
✓ Calcular o volume de aplicação, considerando a massa desejada (30-50 μg usualmente) 
✓ Completar a cuba de eletroforese com o tampão de corrida. 
✓ Para correr a eletroforese, ajustar a voltagem para 100 V (20 minutos), e depois para 170 V constantes até o 
corante sair do gel. A migração dura geralmente entre 1 h e 1 h 20 min (cuidar a frente de corrida marcada 
com o azul de bromofenol da amostra). 
✓ Assim que a fonte for desligada, desmontar a cuba e abrir as placas de vidro, expondo o gel para proceder 
com a transferência imediatamente. 
✓ Cortar o gel de entrada e descartar essa parte. 
✓ Colocar o gel de separação em tampão de transferência 1X e deixar agitando à temperatura ambiente 
gentilmente por 10 min para equilibrar 
 
 
mailto:andrequincozes@ufrgs.br
mailto:matte@ufrgs.br
mailto:fabricio.figueiro@ufrgs.br
11 
c. Explique as etapas da transferência. 
✓ Cortar a nitrocelulose 0,5 cm maior que o gel (8 x 5 cm). 
✓ Marcar com lápis o número da membrana no canto superior esquerdo para permitir a identificação 
efacilitar a orientação das amostras na membrana. 
✓ Cortar dois pedaços de papel filtro (9 x 6 cm) para cada membrana de nitrocelulose. 
✓ Mergulhar a nitrocelulose,o papel filtro e as esponjas no tampão de transferência por pelo menos 10 
min para equilibrar. 
✓ Preparar o sanduíche de transferência no cassete plástico, tomando o cuidado para retirar bolhas a 
cada etapa: 
1. Colocar o cassete plástico com o lado cinza para baixo, sobre um superfície lisa e limpa 
2. Colocar uma esponja molhada sobre o cassete cinza. 
3. Colocar um papel filtro molhado sobre a esponja. 
4. Colocar o gel sobre o papel filtro (atenção para a orientação no gel para que a transferência para 
a membrana seja no sentido correto). 
5. Colocar a membrana de nitrocelulose molhada sobre o gel. 
6. Colocar um papel filtro molhado sobre a membrana. Passar um tubo de ensaio sobre o sanduíche 
para eliminar bolhas. 
7. Colocar uma esponja molhada sobre o papel filtro. 
8. Fechar o cassete com firmeza, sem movimentar o sanduíche. 
✓ Colocar o cassete dentro da cuba de transferência. 
✓ Colocar o bloco gelado e a barra agitadorana cuba. 
✓ Colocar a cuba sobre um agitador, o que garante a manutenção da temperatura. 
✓ Encher a cuba com tampão de transferência 1X até a marca indicada. 
✓ Ajustar a amperagem da fonte para 300 mA. Geralmente, 1 h é um tempo adequado para a 
transferência, mas os parâmetros de tempo e amperagem podem variar dependendo da proteína de 
interesse. 
✓ Depois de transcorrido o tempo de transferência, desligar a fonte, abrir o aparelho e retirar 
cuidadosamente a membrana de nitrocelulose. 
✓ Lavar a membrana com água tipo 2. 
✓ Corar a membrana com Ponceau por algunsminutos,para verificar se as proteínas foram transferidas 
do gel para a membrana. 
✓ Lavar a membrana de três a seis vezes com água destilada até o desaparecimento das bandas 
 
 
 
 
d. Considerando um FCM de 31,16 μg/A obtido a partir de uma curva padrão de albumina para dosagem de 
proteínas pelo método de Lowry, calcule a concentração de proteínas (μg/μL) nas 3 amostras de hipotálamo 
abaixo, considerando que foram aplicados 5 μL de amostra para a dosagem de proteína (obs: o branco já está 
descontado das amostras). 
Amostra 1 (Abs 0,610) 
Amostra 2 (Abs 0,593) 
Amostra 3 (Abs 0,627) 
12 
Amostra 1 : 0,610 A. 31,16 μg/A= 3,80 μg/ μL 
 5 μL 
Amostra 2: 0,593 A . 31,16 μg/A=3,70 μg/ μL 
 5 μL 
Amostra 3: 0,627 A . 31,16 μg/A=3,90 μg/ μL 
 5 μL