Determinação do espectro de absorção de corantes e construção de curva padrão - Relatório Biofísica

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Universidade Federal de Goiás 
Instituto de Ciências Biológicas 
Alunos: Rebeca Amorim Pires, Leandro de Abreu Lima, Alisson de Santana Siqueira 
Curso: Biomedicina 
Professora: Fabrícia Paula de Faria 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aula Prática 3: Determinação do espectro de absorção de corantes e construção de 
curva padrão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Goiânia – GO 
2020 
1. INTRODUÇÃO 
 
 
Para que possam ser encontradas informações quali-quantitativas em soluções 
moleculares, temos como meio a espectrofotometria de absorção em UV/Visível. Nesta 
técnica temos a utilização de um feixe de luz monocromática atravessando uma 
solução (branco e amostra) e utilização da absorção feita por ela para que possa se 
obter informações da qualidade e quantidade de componentes presentes naquela 
amostra. Importante ressaltar que alguns fatores da técnica, como a concentração da 
solução e espessura da cubeta, quando modificados podem modificar também o 
resultado do nosso espectro de absorção. 
 
Cada molécula apresenta um espectro de absorção (quais fótons de quais 
comprimentos de onda a molécula absorve) diferente uma da outra, sendo que cada 
uma também apresenta um pico de absorção (comprimento de onda de absorção 
máxima da molécula), que é o melhor comprimento de onda para se utilizar para 
monitorar a presença da molécula. 
 
A curva padrão é a passagem de uma amostra de solução conhecida, com molécula 
específica por um espectrofotômetro em comprimentos de onda distintos para 
construção de uma relação gráfica entre os valores de absorbância e os de 
concentração. Com base na análise gráfica é possível verificar a linearidade da reação 
e calcular um fator de conversão de valores de absorbância em concentração. 
 
 
2. OBJETIVOS 
 
 
A aula prática teve como objetivo determinar o espectro de absorção das soluções 
de azul de bromofenol e metilorange, caracterizando o comprimento de onda de 
absorção máxima (pico de absorção) e contruindo uma curva padrão para cada 
corante nos comprimentos de onda adequados. 
 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
 
 
3.1. Materiais 
• Solução de azul de bromofenol 0,01mg/mL 
• Solução de metilorange 0,01mg/mL 
• Água destilada 
• 6 tubos 
• Pipeta sorológica 
• Cubetas para espectofotômetro 
• Espectrofotômetro 
• Plataforma Exel 
 
 
3.2. Métodos 
 
1º Passo: Varredura no aspectro de absorção dos corantes em comprimento de onda 
415 nm. 
Utilização de 1mL de água dentro de uma cubeta para calibrar o espectofotômetro, 
1mL de azul de bromofenol em outra cubeta e 1mL de metilorange em otra cubeta 
(todos em cubetas de mesma espessura). Após a separação das soluções em 
cubetas, todas foram passadas pelo espectofotômetro, sendo primeiro colocada a 
água destilada para a calibração, depois as soluções de corante, para que 
pudêssemos avaliar a capacidade dessas substâncias de absorver luz (espectro de 
absorção), e identificar qual o comprimento de onda que essas substâncias 
absorvem a maior quantidade de luz (pico de absorção). 
 
 
2º Passo: Repetição do processo de varredura no aspectro de absorção dos corantes 
em outros comprimentos de onda. 
Mudança no comprimento de onda do espectrofotômetro e mesmo processo de 
quantificação de absorbância. Utilização dos comprimentos de 445, 460, 490, 
520,535, 550, 580, 610 e 640 nm. 
 
3º Passo: Criação de uma curva padrão 
 
Escolha de um dos corantes para a criação de uma curva padrão para correlacionar 
a absorbância e a concentração da solução. O corante utilizado para a curva padrão 
foi o azul de bromofenol. Foram feitas diluições do corante escolido para 
concentrações conhecidas para observação de suas respectivas absorbâncias. 
 
Utilização de 6 tubos. Um apenas com água para calibração do espectrofotômetro, e 
do tubo 1 ao 5 soluções com crescentes concentrações do azul de bromofenol. 
Tubo 1 com 1mL de azul de bromofenol, tubo 2 com 2 mL, tubo 3 com 3 mL, tubo 4 
com 4 mL, tubo 5 com 5 mL. Para completar o volume de todos os tubos em 5 mL, 
foi utilizada água destilada, nas quantidades necessárias (excluindo o 5º tubo, que já 
estava na quantidade certa); após o processo foi feita a homogeneização em cada 
tubo. 
 
Após a preparação das concentrações foram transferidos 1mL de cada tubo para as 
cubetas, para serem avaliadas as absorbâncias no espectrofotômetro. 
Primeiramente foi feita a escolha do comprimento de onda, baseado na leitura feita 
no passo 1, com as medidas da absorbância do azul de bromofenol em diferentes 
comprimentos de onda. Com a observação dos resultados, foi escolhido o 
comprimento de onda onde havia o pico de absorção, em 580nm. Feita a escolha do 
comprimento de onda em 580 nm seguimos com a calibração do espectrofotômetro 
com a água destilada e medidas das absorbâncias dos tubos com diferentes 
concentrações do corante azul de bromofenol. 
 
 
 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
 
 
4.1. Resultados 
 
 
1º Passo: Após a calibração do aparelho com a água destilada, e passagem da cubeta do azul de 
bromofenol, chegamos ao resultado de 0,085 de absorbância; na passagem da cubeta com 
metilorange chegamos ao resultado de 0,621 de absorbância. Todos esses resultados utilizando 
o comprimento de onda 415 nm (nanômetros). Esse primeiro resultado nos mostrou 
que as amostras possuiam diferentes espectros de absorção. 
 
 
2º Passo: Gráfico com o espectro de absorção dos corantes. 
 
 
 
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
415 445 460 490 520 535 550 580 610 640
Espectro de absorção do Azul de bromofenol e 
do Metilorange
azul de bromofenol metilorange
3º Passo: Após a adição em diferentes concentrações de azul de bromofenol com 
água, nós podemos verificar a diferença de concentração pelo tom gradualmente 
mais intenso adquirido do tubo 1 ao tubo 5. Com a passagem das soluções de 
diferentes concentrações de azul de bromofenol pelo espectofotômetro foram 
analizadas suas absorbâncias e criação da curva padrão. Dados na tabela e gráficos 
abaixo gráfico abaixo: 
 
 
 
 
Tebela com valores base para a construção do gráfico: 
 
tubos ABF (mL) água (mL) abs (nm) concentração 
1 1 4 0,222 0,002 mg/mL 
2 2 3 0,408 0,004 mg/mL 
3 3 2 0,563 0,006 mg/mL 
4 4 1 0,742 0,008 mg/mL 
5 5 0 0,91 0,01 mg/mL 
 
 
4.2. Discussão 
 
 
Como visto anteriormente na aula teórica e afirmado em referência bibliográficas, as 
substâncias variam nos seus espectros de absorção, apresentando 
conseguentemente diferentes picos de absorção, como foi comprovado pela prática 
com os corantes azul de bromofenol e metilorange. Na construção da curva padrão 
tivemos a observação de uma linha que possibilita que encontremos em outras 
soluções de concentração desconhecida, por meio de sua absorbância, a sua 
concentração respectiva. Ressaltando que as concentrações maiores de 
substâncias, como comprovado na aula, realmente indicam maior absorbância como 
consequência. 
 
0
1
2
3
4
5
6
Curva padrão do azul de bromofenol (nm)
 
5. CONCLUSÃO 
 
Foram feitos os espectros de absorção dos corantes azul de bromofenol e 
metilorange; além da construção de uma curva padrão com soluções em diferentes 
concentrações do azul de bromofenol. Todos os resultados dos processos batem 
com a literatura e a prática fixou a ideia de espectros e picos de absorção diferentes 
para diferentes soluções moleculares. 
 
 
6. REFERÊNCIAS 
 
 
 
Vídeo aulas ministradas no dia 5/10/2020.