Seminário de Micologia

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Princípios do diagnóstico laboratorial das micoses
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
CAMPUS PARNAÍBA
DISCIPLINA: MICOLOGIA
PROF.: GUSTAVO P. PEREIRA
2014.1
Alexandra Carvalho
George
Jéssica Moreira 
Nara Leão
Mário Oliveira
Rosa Viana
Fase Pós-Analítica
Fase analítica 
Fase Analítica 
Fase Pós-Analítica
Fase pré- analítica 
Fase Analítica 
Coleta
Transporte
Recebimento
Processamento
Microscopia 
Culturas 
Relato e Análises dos Resultados 
Interações com Epidemiologistas 
Manutenção de Amostras e Registros 
Diagnóstico preciso
Fases do Diagnóstico laboratorial
Introdução
SIDRIM & ROCHA, 2004
Fases do Diagnóstico laboratorial
Introdução
SIDRIM & ROCHA, 2004
Uso de antifúngicos
Amostras encaminhadas
Suspensão 
Ficha padrão 
SIDRIM & ROCHA, 2004
Coleta da amostra
Fase pré-analítica
Unhas
Pelos , Cabelos, barba e bigode
Líquidos corpóreos ou lavados
Órgãos
Pele e mucosas
4
Mudar imagens
4
ZAIZ et al., 2010; ANVISA, 2004; VERMELHO et al., 2006
Assepsia
Lâmina dermatológica/bisturi sem fio de corte 
Jarbas Porto
Debridação da lesão
Coleta da amostra
Fase pré-analítica
Pele
5
ZAIZ et al., 2010
Coleta da amostra
Fase pré-analítica
Pelos e Cabelos
Região de alopécia 
Auxílio pinça flambada 
Lâmpada de Wood 
Antibioticoterapia prévia
COLOCAR UMA IMAGEM
6
ZAIZ et al., 2010
Tesouras, limas, alicates de unhas e curetas dermatológicas 
Região de progressão e confluência 
Swabs ou pipeta Pasteur 
Região mais adentro da matriz ungueal 
Coleta da amostra
Fase pré-analítica
Onicomicoses
ZAIZ et al., 2010
Swab
Exame direto e cultura
Solução salina
Refrigerar 
Boca
Ânus
Vagina
Biópsia ou raspagem
Coletar as escamas
Curetagem ou biópsia
4 swabs
Coleta da amostra
Fase pré-analítica
Mucosas, orifícios naturais e secreções diversas
SIDRIM & ROCHA, 2004
Conjuntiva
Córnea
Coleta da amostra
Fase pré-analítica
Tecidos e Órgãos
Raspagem ou debridação
Duas regiões bem demarcadas
Solução salina
Temperatura ambiente por até 24 horas
Procurar imagem de micose ocular
9
Coleta da amostra
Fase pré-analítica
Punção lombar 
3-5ml em tubo estéril 
Temperatura ambiente 
LCR 
Sangue 
Assepsia
Anticoagulante 
MINAMI, 2003
Procurar imagem de micose ocular
10
20-30ml do jato intermediário 
Frasco estéril 
Punção suprapúbica 
Urina
Máximo de 2 horas para análise 
Fezes
Swab retal 
Máximo 2 horas 
Cary-Blair 
MINAMI, 2003
Coleta da amostra
Fase pré-nalítica
11
MINAMI, 2003
Punção
Antissepsia 
Refrigeração 
Pus e líquidos patológicos
Coleta da amostra
Fase pré-analítica
Amostra expectorada naturalmente
Saneamento bucal 
Frascos estéreis 
Escarro 
Aspirados 
Processamento
Procurar imagem de micose ocular
12
MINAMI, 2003
Coleta da amostra
Fase pré-analítica
Características de uma boa amostra
Consistência
Coloração 
Odor
Aspectos macroscópicos
Características da amostra analisada
Aspectos microscópicos
Mudar imagens
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Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. Agência de Vigilância Sanitária. Módulo VII. 2004
Coleta da amostra
Fase pré-analítica
Processamento da amostra
Exame microscópico e cultura
Pelos, cabelos, escamas de unha e pele
Centrifugação
Líquor, secreções e fluídos corporais
Semeado por esgotamento
Urina 
FAZER UM ESQUEMA!!!
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Coleta da amostra
Fase pré-analítica
Processamento da amostra
Digestão com enzima
Exame microscópico e cultura
Escarro 
Fragmentação → coloração/cultura
Tecidos 
Centrifugação e cultura
Sangue 
Principais técnicas para diagnóstico em micologia médica
Compêndio de micologia médica
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Coloração da amostra
Fase analítica
KOH ou NaOH
Pelos, pele, unha, escarro, exsudatos espessos e outros materiais densos 
É um reativo que clarifica e digere o material clínico 
Fonte: MEDRANO, D. J. A. Perfil de sensibilidade de cepas de Coccidioides posadasii a associação de drogas antimicrobianas. Universidade Federal do Ceará - Programa de Pós-graduação em Ciências Medicas (Tese). Fortaleza, 2010. 156 p.
Coccidioides sp.
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Coloração da amostra
Fase analítica
Lactofenol azul de algodão
Lactofenol 
Fluido de montagem
Azul de algodão
Corante 
Fonte: MEDRANO, Delia Jéssica Asteta. Perfil de sensibilidade de cepas de Coccidioides posadasii a associação de drogas antimicrobianas. FORTALEZA. 2010. (Tese) Doutorado em Microbiologia Médica- Universidade Federal do Ceará. 2010.
O lactofenol azul de algodão é composto de lactofenol, que atua como fluido de montagem, e de azul de algodão, um corante. Os organismos suspensos no fluido de montagem são rapidamente mortos pela presença do fenol que age como citotóxico, precipitando proteínas celulares e inativando sistemas enzimáticos essenciais. O ácido lático preserva as estruturas fúngicas. A visualização e preservação de fungos através deste sistema são excelentes, uma vez que não ocorre plasmólise (retração do volume das células por perda de água) ao matar os organismos. O azul de algodão é incorporado à fórmula como corante diferencial para quitina e celulose, elementos da parede celular dos fungos.
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Coloração da amostra
Fase analítica
Tinta Nanquim
Líquor, urina, secreções ou exsudatos 
Fungos capsulados 
Erro frequente: confundir linfócitos com células de leveduras 
Nanquim preto
Criptococccus
Criptococoma.Fonte: <http://anatpat.unicamp.br/nptcripto1c.html#esfregnanquim>.
Nanquim preto. Estes preparados examinados sem coloração adicional destacam os fungos contra o fundo negro dado pela tinta Nanquim, variando a altura do condensador e a abertura do diafragma, é possível visualizar detalhes da estrutura interna dos fungos, melhor que com qualquer dos métodos precedentes.
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Coloração da amostra
Fase analítica
Coloração de Gram
Gram +
Discrimina elementos fúngicos de artefatos existentes em urina, secreções e fezes 
Exceção
Aspergillus flavus
Cryptococcus neoformans
SIDRIM &ROCHA, 2004
Cryptococcus neoformans – leveduras encapsuladas com brotamentos e de tamanho variável, mostrando um padrão puntiformes devido à retenção irregular da coloração.
Aspergillus – esta amostra não retém a coloração do violeta cristal e cora-se com Gram negativa
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Coloração da amostra
Fase analítica
Giemsa, Leishman ou Wright
Histoplasma capsulatum 
Medula óssea, sangue, aspirados e secreção cutânea 
CORA AS CÉLULAS EVIDENCIANDO O FUNGO FAGOCITADO.
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O calcoflúor white (CFW) é um agente clareador – celulose e quitina 
Coloração da amostra
Fase analítica
Calcoflúor
Utilizado em combinação com o KOH
DANIELLE L. H.; MARYAM Gerami-Nejad; CASSANDRA Kistler-Anderson; CHERYL A. Gale. Hyphal Guidance and Invasive Growth in Candida albicans Require the Ras-Like GTPase Rsr1p and Its GTPase-Activating Protein Bud2p. American Society for Microbiology. 2005
Candida albicans
Tinha nigra. Disponível em:<http://anatpat.unicamp.br/lampele2a.html>.
Avaliação dos padrões de reações teciduais 
Coloração da amostra
Fase analítica
Hematoxilina-Eosina
Cora o tecido – ressalta a morfologia fúngica
Cromoblastomicose - Phialophora 
LÂMINHA – TINHA NIGRA - Paciente masculino, 37 anos, branco, transplantado renal há 2 meses. Apresenta lesões eritêmato-descamativas difusas na pele. 
Tinha (do latim tinea).  São um grupo de micoses superficiais, limitadas às camadas queratinizadas ou semiqueratinizadas da pele (epiderme, pelos e unhas).  Os fungos (dermatófitos) utilizam a queratina como alimento.  Os principais gêneros são: Microsporum, Tricophyton e Epidermophyton.  As tinhas são denominadas conforme a área acometida: tinha do couro cabeludo, da barba, do pé e da mão, tinha corporal,  crural (períneo, regiões glúteas e parede abdominal), e das unhas (onicomicose).
A epiderme está recoberta por hiperortoceratose lamelar. De permeio ao estrato córneo, e nos infundíbulos foliculares, notam-se estruturas fúngicas, na forma de hifas e esporos.
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Aspergilose. Fonte: http://anatpat.unicamp.br/biinflaspergilose1c.html
Coloração da amostra
Fase analítica
Grocoot 
Impregnação pela prataCortes de tecido e esfregaço 
Aspergilus
A técnica de Grocott é simples, feita em cortes de parafina, e permite demonstração dos fungos com grande elegância.  Baseia-se numa oxidação inicial dos cortes em ácido crômico, seguida pela impregnação na solução de metenamina prata na estufa a 60ºC. É fundamental o acompanhamento da reação sob microscópio já após os primeiros 10 minutos, para interromper no ponto ótimo. Isto é feito colocando a lâmina em tiossulfato de sódio.  Impregnação excessiva leva ao escurecimento de outras estruturas, principalmente fibras colágenas, e o preparado perde em especificidade e qualidade.  Resultado - fundos marrom a negro, tecido claro. Pode-se recorrer a contracoloração com hematoxilina (não realizada no material demonstrado abaixo) para visualização do tecido.
IMAGEM - Fungos invadindo vasos. 
Os fungos do gênero Aspergillus exibem grande predileção por vasos. Com  facilidade, invadem paredes vasculares, causando vasculite necrosante e trombose, o que promove as lesões vistas na macroscopia:  estas podem ser  isquêmicas e/ou hemorrágicas, com predomínio de abscessos.
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Fungos que contêm cápsula mucopolissacarídica 
Diferencia o Cryptococcus de outros fungos similares em tamanho e forma 
Núcleos – azul 
Mucinas - róseo para vermelho  
 Outros elementos – amarelo 
Coloração da amostra
Fase analítica
Mucicarmim
Criptococoma. Fonte: <http://anatpat.unicamp.br/nptcripto1b.html#muci>.
Glicogênio, mucinas neutras, membranas basais e evidenciar a maior parte de fungos e parasitas em tecidos
Produz artefatos facilmente confundíveis com Histoplasma e Eporothrix
Glicogênio, mucina, membrana basal, fungos -  vermelho
Núcleos - azul
Coloração da amostra
Fase analítica
Periodic-Acid-Schiff (PAS) 
C. neoformans
A reação histoquímica do ácido periódico e reativo de Schiff para grupos açúcar (para procedimento técnico, clique) demonstra o corpo celular do fungo em cor magenta forte e a cápsula polissacarídica em róseo. Realça os parasitas contra o tecido de fundo e dá detalhes dos limites entre cápsulas de fungos vizinhos nos aglomerados. Células em reprodução são também elegantemente demonstradas. 
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FONTE: http://www.ijpmonline.org/viewimage.asp?img=IndianJPatholMicrobiol_2011_54_1_216_77417_u5.jpg
Coloração da amostra
Fase analítica
Fontana-Masson 
Evidencia a parede celular fúngica por reagir com pigmentos de melanina, bem como grânulos argentafins 
Núcleos – rosa 
Grânulos argentafins – preto
C. neoformans
Masson-Fontana mancha marrom mostrando a formas de leveduras negras da C. neoformans (Masson-Fontana, × 1000)
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Pelos, unhas, escamas de pele
Exame microscópico + KOH
Líquor
Exame microscópio + tinta nanquim, coloração de gram, coloração de Giemsa ou panótica
Fluidos oculares
Exame microscópico com KOH ou com coloração de gram
Sangue ,medula óssea
ZAITS
Exame direto da amostra
Fase analítica
Resumindo...
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1-Exame microscópico + KOH, 2 - Exame microscópio + tinta nanquim, 3 -Exame microscópio com coloração de gram, 4 - Exame microscópico com coloração de Giemsa ou panótica
Exame direto da amostra
Fase analítica
Resumindo...
Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. Agência de Vigilância Sanitária. Módulo VII. 2004
Exame microscópico + KOH
Exame microscópio + tinta nanquim
Exame microscópio com coloração de gram
Exame microscópico com coloração de Giemsa ou panótica
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Meios de cultura
Fase analítica
Aspectos micro e macromorfológicos
Isolamento
Manutenção Estocagem
Enriquecimento 
Estruturas de ornamentação e frutificação
Cor verso/reverso
Rosa começa aqui
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Seletivo
Não seletivo
Para a cultura e isolamento primário de fungos, é necessário a utilização de dois meios de cultura
A seleção do tipo de meio é feita de acordo com a experiência clínica do analista + dados clínicos repassados pela equipe médica 
Semeadura da amostra
Fase analítica
Para a cultura e isolamento primário de fungos é necessário a utilização de 2 meios de cultura: Meios seletivos e não-seletivos.
Os meios seletivos são aqueles que contém algumas substâncias inibitórias que acabam que inibido o crescimento de alguns fungos e favorecendo o crescimento de outros. Enquanto que os meios não seletivos são aqueles que não apresentam inibidores, desse modo permite o crescimento de uma variedade de microrganismos.
A seleção dos meios é feito de acordo com as informações clínicas fornecidas ao laboratório. Ex: O tipo de amostra (raspado de pele, unhas, sangue, LCR) pois cada amostra requer um processamento específico. O local de onde essa amostra foi coletada no caso das unhas (onicomicose) limbo as infecções estão mais relacionadas a dermatófitos, enquanto no leito mais relacionado a leveduras-Candidas como foi falado pelo professor. E claro que a experiência do analista também não poderia ficar de fora.
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Amostra semeada na superfície dos meios de cultura
Inoculação – alça de níquel-cromo ou pipeta Pasteur
O material não deve ser colocado em profundidade no ágar
Temperatura de incubação para todas as amostras
Fase analítica
Procedimentos de semeadura
As amostras clínicas devem ser inoculada na superfície do ágar com movimento de zig-zag para separar eventuais contaminantes da amostra, podendo ser utilizado para essa finalidade a alça de níquel ou a pipeta paster quando se refere a amostra líquida. O material não deve ser inoculado em profundidade do ágar, mas sim na superfície para não interferir no crescimento fúngico. Levando em consideração a temperatura de incubação de cada fungo, pois assim como na bacteriologia, os fungos também apresentam uma temperatura de incubação ótima. A temperatura de incubação para todas as amostras é recomendado uma temperatura de 30ºC devido a possibilidade do agente etiológico ser oportunista.
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Fase analítica
Procedimentos de semeadura
Secreção respiratória
Líquor
Urina
Fluidos corporais
Swabs
Pele, pelos e escamas
Tecidos 
Sangue
Fluidificação, centrifugação - sedimento
Centrifugação - sedimento
Centrifugação - sedimento
Centrifugação - sedimento
Centrifugação - sedimento 
Nenhum 
Fragmentação-maceração-imprint
Semeadura - esfregaço
Pus, secreções de abscesso
Nenhum 
NENHUM – significa que a amostra não precisa passar por nenhum tratamento prévio
Tendo em vistas a diversidade das amostras que chegam no laboratório, temos de saber quais procedimentos tomar para poder fazer a inoculação no meio de cultura.
Em amostras muito liquefeita recomenda-se a centrifugação para a concentração da amostra e só depois a inoculação. Ex:. Secreções respiratórias fluidificadas como: líquor, urina (principalmente), fluidos corporais (pleura, ascítico, sinovial, pericárdio, gástrico, brôquico). Amostras obidas com Swabs (mucosa oral, nasal, olhos e conduto auditivo) deve ser embebido com salina e depois centrifugado. Para tecidos recomenda a fragmentação ou maceração da amostra e logo após fazer o imprint em lâmina. Esse procedimento tem como objetivo melhor expo microrganismo ligado ao tecido. A preparação do esfregaço a partir da amostra clínica não é recomendado devido a baixa sensibilidade, desse modo, recomenda-se que a amostra seja semeada em meio de cultura, e só depois se preparar a cultura em lâmina. Para pus, abscesso, pele, pelos e escamas não necessita de nenhuma preparação.
 
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Aspergillus glaucus
Cultivo primário de fungos
Meios de cultura
Fase analítica
Ágar sabouraud dextrose
Dextrose 
Peptona 
Leveduras
O meio de cultura Ágar Sabouraud dextrose é um meio utilizado em larga escala para o cultivo primário de uma variedade de fungos (filamentosos, leveduriformes, e alguns dimórficos). São utilizados em especial para o cultivo de dermatófitos uma vez que as característica macro e microscópica são descritas a partir da sua caracterização nesse meio. Em alguns casos esse ágar é acrescido antibióticos para impedir o crescimento de bactérias que possam vir prejudicar o isolamento de fungos. E para o isolamento de fungos ditos patogênicos na maioria dasvezes utilizam-se Ágar mycosel que possui tanto antifúngico como antibiótico, que na maioria das vezes é cicloeximida e clorofenicol
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Meios de cultura
Fase analítica
SABHI
Infusão de coração, cérebro, peptona, sais, glicose, sangue e clorofenicol
Sporothrix schenckii
Isolamento de fungos patogênicos, não-patogênicos e dermatófitos 
Blastomyces dermatitidis
Histoplasma capsulatum
Ágar sabouraud-infusão de cérebro e coração. É um meio enriquecido, uma variação do ágar sabouraud dextrose. Utilizado para o isolamento de fungos patogênicos, não-patogênicos e dermatófitos.
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Meios de cultura
Fase analítica
Ágar arroz
Gênero Microsporum
Estruturas de frutificação
M. Audoinii → Microsporum
Diferencia 
Produção de clamidosporos
M. canis
Facilita o aparecimento de estruturas de frutificação, especialmente dos macroconídios do gênero microsporum . Utilizado para diferenciar o Microsporum audoinii das demais espécie de Microsporum, uma vez que esse que essa espécie não se desenvolve nesse meio de composição pobre.
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Meios de cultura
Fase analítica
Lactrimel 
Meio enriquecido
Estruturas de frutificação e ornamentação
Mel de abelhas
Farinha de trigo
Solução de leite
M. canis
É um meio que permite o aparecimento de várias estruturas fúngicas de ornamentação e de frutificação, facilitando a identificação das estruturas fúngicas das espécie em geral.
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Meios de cultura
Fase analítica
Ágar Batata 
Estruturas de frutificação e ornamentação
Microcultivo 
Candida albicans
Meio enriquecido
Utilizado para a realização de microcultivo de fungos filamentosos e estoque de cepas fúgicas. Esse meio estimula a produção de macro e microconídios em microcultivo em lâmina. Pode ser encontrada na forma desidratada com a denominação de: Ágar batata (DIFCO), potato dextrose agar (OXOID), Ágar pomme-de- terre
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Meios de cultura
Fase analítica
Ágar Mycosel 
Seletivo
Antibióticos 
Fungos inibidos clorofenicol: Cryptococcus neomorfans, Trichosporon beigelli, espécie de Candida e Aspergillus
Cloranfenicol 
Cicloeximida
Farinha de soja + glicose
Microsporum canis
Colônia plana, cotonosa, branca, radiada em fundo, em fundo amarelo ouro-micélio vegetativo
É um meio seletivo utilizado para o isolamento de fungos patogênicos a partir de amostras contaminadas. O ágar consiste em digerido de farinha de soja suplementado de glicose, cicloeximida e clorofenicol. Fungos sensiveis como Cryptococcus neomorfans, Trichosporon beigelli, espécie de candida e aspergillus e alguns fungos saprófitos e oportunitas também não crescem nesse meio.
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Meios de cultura
Fase analítica
Ágar Fubá Dextrose 
Pigmento avermelhado
Estruturas de frutificação
Trichophyton rubrum – demais espécies
Diferencia 
Fubá de milho
dextrose
Usado para diferenciação de Trichophyton rubrum das demais espécie de Trichophyton com base na produção de pigmento avermelhado desse fungo.
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Meios de cultura
Fase analítica
Ágar ureia de Christensen
Trichophyton 
Diferenciar 
T. mentagrophytes
T. rubrum
Hidrólise da ureia +
Hidrólise da ureia -
Leveduras dos filos Ascomicotina e Basidiomicotina
Peptona, Glicose, NaCl, Fosfato de potássio, monobásico, Fenol vermelho, ureia
Meios de cultura
Fase analítica
Dixon 
Promove o crescimento de fungos lipofílicos
Malassezia furfur
ASD
Antibióticos
Óleo de oliva
Bili de boi
 Malassezia sp
Promove o crescimento de fungos lipídicos, especialmente leveduras do gênero Malassezia.
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Identificação e diferenciação
Candida de interesse médico
Peptona
Mistura cromogênica
Cloranfenicol 
Meios de cultura
Fase analítica
CHROMagar 
Diferencia as espécie de Candida, baseado-se nas diferentes coloração adquirida pelas colônias. Sendo muito útil nos casos de infecções mistas, facilitando a diferenciação das espécie envolvidas. Candidas albicans – são verdes, C. krusei- coloração rósa, C. tropicalis- coloração púrpura, C. glabrata- coloração azul metálica
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Meios de cultura
Fase analítica
CHROMagar 
Candidas albicans – são verdes, C. krusei- coloração rósa, C. tropicalis- coloração púrpura, C. glabrata- coloração azul metálica
44
Fase analítica
Microcultivo 
Cultivo em lâmina
estudar aspectos microscópicos característicos
Micélio vegetativo e micélio reprodutivo ou de frutificação
Cultivo em lâmina também chamado de microcultivo, é uma técnica utilizada para estudo dos aspectos microscópicos característico de micélio vegetatativo ou de frutificação. A técnica consiste em uma câmera úmida contendo uma lâmina de vidro colocada sobre um bastão de vidro colocado sobre um bastão de vidro em forma de U. Onde um pequeno quadrado de ágar batata é semeado com fungo a ser estudado. Uma lamínula é colocada sobre o bloco de ágar, e após o crescimento satisfatório a lamínula é retirada e colocada em uma lâmina corada com lactofenol azul de algodão e depois submetida a estudo microscópico do fungo.
45
SIDRIM & ROCHA, 2004
Tamanho 
Bordas 
Textura 
Relevo 
Pigmentação 
Aspectos macroscópicos
Fase analítica
Alexandra começa aqui
46
SIDRIM & ROCHA, 2004
Hifa 
Conidióforo 
Conídeos 
Clamidosporos 
Outras características
Aspectos microscópicos
Fase analítica
Coccidioidis sp.
Algodonosa, branca ou acinzentada, reverso creme - amarronzado ao envelhecer
Hifa hialina, septado com artroconídios e de parede celular espessa 
Aspectos gerais dos fungos 
Fase analítica
 Macro e micromorfologia
Aspectos gerais dos fungos 
Fase analítica
 Macro e micromorfologia
Trichophyton verrucosum
Glabrosa a velutosa, relevo rugoso, branco-amarelo ocre.
Presença de cadeias formadas por clamidoconídios grandes.
Epidermophyton floccosum
Aspectos gerais dos fungos 
Fase analítica
 Macro e micromorfologia
Algodonosas, com relevo umbilicado, pulverulenta
Macroconídeos em cacho
Paracoccidiodes brasiliensis
Aspectos gerais dos fungos 
Fase analítica
 Macro e micromorfologia
Endurecida,franjas nas bordas, de centro elevado, irregular e com a superfície de cor branca
Célula com múltiplos brotamentos
Trichophyton mentagrophytes
T. rubrum
Não perfura
Perfura o pelo radialmente
Teste fisiológico
Fase analítica
Teste de perfuração do pelo in vitro 
Prova nutricional
Fase analítica
Teste de pigmentação em ágar batata
T. mentagrophytes
T. rubrum
Meio vermelho
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Testes anatomopatológicos
Fase analítica
Demonstração de elementos fúngicos em tecido 
Diagnóstico de micoses subcutâneas e sistêmicas
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Lâmpada de Wood 
Fase analítica
Auxílio diagnóstico
Tinea capitis
Pitiríase versicolor
Eritrasma
Corynebacterium minutissimum
Fluorescência vermelho-coral.
Tinea capitis: pelos infectados com alguns dermatófitos emitem fluorescência de cores variadas, como: Microsporum canis ou M. audouini – verde-azulada; Trichophyton schoenleini – verde-palha.
Pitiríase versicolor: escamas infectadas com Malassezia spp. emitem fluorescência em tom prateado.
Eritrasma: escamas infectadas com Corynebacterium minutissimum – fluorescência vermelho-coral.
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Meios de cultura
Fase analítica
Ágar Trichophyton T1-T7 
Trichophyton T1
Ácido casamínico (sem vitaminas), Fosfato monopotássico, Sulfato de magnésio, Dextrose
T2
T1+inositol
Requerimento vitamínico
T6
T3
T4
T5
T7
T1+inositol+tiamida
T1+tiamida
T1+ácido nicotínico
T. verrucosum
T. tonsuras de T. violaceum
T. equinum 
Nitrato de amônio, Fosfato monopotássico, Sulfato de magnésio, Dextrose
Requerimento vitamínico
Trichophyton - T. megninni de T. rubrum
T6 + sol. de histidina
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Meios de cultura
Fase analítica
Ágar Trichophyton T1-T7 
Meios sem inoculação
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SIDRIM & ROCHA, 2004
Meios de cultura
Fase analítica
Ágar Trichophyton
SIDRIM & ROCHA, 2004
Identificação de leveduras
Fase analítica
SIDRIM & ROCHA, 2004
Alçada de colônia isolada
Suspensão em 5 ml de soro ou plasma
Incubar a 37°C
Por 3h
Depositar uma gota da suspensão sobre lâmina e cobrir com lamínula
Examinar ao microscópio óptico
A presença de tubo germinativoProva do tubo germinativo 
Fase analítica
Extensão filamentosa de uma célula leveduriforme que tem cerca da metade da largura e três a quatro vezes o comprimento da célula-mãe. 
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Auxanograma
Fase analítica
Álcoois, proteínas e aminoácidos – fontes de nitrogênio - meio isento de nitrogênio
Levedura irá assimilar e crescer em volta de determinadas fontes
Pelo halo de turvação resultante do crescimento
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Auxanograma
Fase analítica
Identificação das principais leveduras de interesse médico
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Fase analítica
Diagnóstico Imunológico
Maior sensibilidade
Reações sorológicas 
Reações sorológicas 
Epidemiologia e monitorização – Diagnóstico?
Eficiência relacionada à: sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade 
Antígenos – extratos brutos – conferem maior positividade – reatividade cruzada – componentes antigênicos comuns
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glicoproteína de 43 kDa- Ag imunodominante
Positivo para 1/32
Diagnóstico Imunológico
Fase analítica
Imunodifusão em gel
O teste de ID é o principal método diagnóstico de Pb, e utiliza antígenos de leveduras concentrados e/ou soro de referência. É um teste bastante simples e que não requer equipamentos de alto custo o que consequentemente estimula sua utilização. Apresenta sensibilidade superior a 80% e especificidade superior a 90%, variando de acordo com o antígeno utilizado . É um teste baseado na formação de imunocomplexos que precipitam de acordo com seu peso molecular. O que se observa no teste é de uma a três bandas de precipitina, sendo o número de bandas relacionado com os títulos de FC, informando que baixos títulos indicam infecção localizada e altos títulos, infecção disseminada. O teste de imunodifusão baseia-se no princípio de reação entre anticorpos circulantes contra epítopos do fungo no organismo do paciente e um preparado antigênico que irá reagir formando um imunocomplexo, visualizado a olho nu pela formação de uma linha de precipitação em lâmina. Alguns trabalhos relatam a glicoproteína de 43 kDa, denominada p43, como o antígeno imunodominante em P. brasiliensis. Esta glicoproteína exerce papel importante frente à adesão a laminina, o que favorece a infecção e disseminação do fungo 
para os tecidos (VICENTINI et al., 1994; BLOTTA et al., 1993). Este antígeno está presente em grandes concentrações em pacientes acometidos com a forma aguda da PCM, consequentemente estes pacientes apresentam elevadas concentrações de anticorpos antigp43, apresentando bons resultados frente ao teste de imunodifusão (MENDES-GIANNINI et al., 1990; BLOTTA et al., 1993). 
64
Diagnóstico Imunológico
Fase analítica
Intradermorreação
Diagnóstico Imunológico
Fase analítica
ELISA
elevada sensibilidade e especificidade variável
Boa correlação com a clínica
Reatividade cruzada –histoplasmose, candidíase e doença de Jorge Lobo
Diagnóstico molecular
Fase analítica
Identificação de fungos a nível de espécie
Diagnóstico precoce de infecções fúngicas invasivas
Especificidade e sensibilidade, rapidez
REVER SLIDES
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Obrigada pela atenção!
Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. Agência de Vigilância Sanitária. Módulo VII. 2004
SIDRIM, J. L. C.; ROCHA, M. F. O. Micologia Médica à luz de autores contemporâneos. 2ª. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004
ZAITZ, C.; MARQUES, S. A., RUIZ, L. R. B.; FRAMIL, V. M. de S. Compendio de Micologia Médica. 2ª ed. Guanabara Koogan. 2010
LACAZ
Referências bibliográficas